CN107758628B - 一种利用山茶植物水提取物制备纳米硒的方法及制备而成的纳米硒 - Google Patents

Abstract

本发明属于纳米材料技术领域，公开了一种利用山茶植物水提取物制备纳米硒的方法及制备而成的纳米硒。该方法包括以下步骤：先制备山茶植物水提取物，再将亚硒酸钠与维生素C在山茶植物水提取物存在的条件下发生还原反应得到纳米硒溶胶，脱除维生素C得纳米硒成品，并通过体外细胞模型研究山茶植物水提取物纳米硒抗氧化、抗癌及抗炎活性。本发明以不同山茶植物水提取物为模板，制备功能活性强化的纳米硒，拓宽纳米硒的应用领域，提高其应用价值。

Description

一种利用山茶植物水提取物制备纳米硒的方法及制备而成的 纳米硒

技术领域

本发明属于纳米材料技术领域，特别涉及一种利用山茶植物水提取物制备纳米硒的方法及制备而成的纳米硒。

背景技术

硒(Se)是人体必需微量元素之一，与人体健康密切相关。其中，抗氧化、抗癌是硒最主要的生物活性，硒同时还具有提高免疫力、拮抗重金属、参与体内碘代谢、调节生物体内碘的水平及自由基水平等功能。相比无机硒和有机硒，无定形纳米硒具有更高的生物活性。

无定形纳米硒最常用的制备方法为聚合物模板法，该方法反应条件温和，操作简单，粒子尺寸可控，能赋予纳米硒模板的功能活性，提高纳米硒功能性。

山茶植物是我国重要的经济作物，具有广泛的药用价值。该类植物含有大量多酚类化合物、生物碱、蛋白质、多糖等化学成分，这些成分含有大量羟基、羧基、醛基等基团，各基团能通过共价键或非共价键与纳米硒结合并稳定纳米硒。此外，山茶植物具有抗菌、抗突变、抗癌、抗炎、抗氧化、降血脂等生理活性，可强化纳米硒的健康功效。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种利用山茶植物水提取物制备纳米硒的方法；以不同山茶植物水提取物为模板，制备功能强化的山茶植物水提取物纳米硒。

本发明的另一目的在于提供一种上述方法制备得到的纳米硒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种利用山茶植物水提取物制备纳米硒的方法，包括以下步骤：

(1)制备山茶植物水提取物；

(2)利用山茶植物水提取物制备纳米硒。

步骤(1)所述制备山茶植物水提取物具体按照以下步骤：将山茶植物原料按料液比1:10～1:250分别加入25～100℃水，然后在25～100℃水浴条件下浸提2～120min得到山茶植物水提取液，冷冻干燥得冻干粉，得到山茶植物水提取物，于-20℃保存，待用。

所述山茶植物原料为山茶科(Theaceae)植物，包括茶叶(Camellia sinensis)或可可茶(Camellia ptilophylla)。

所述步骤(1)所述茶水比为1:50，水浴的温度为100℃；所述浸提的时间为30min。

步骤(2)所述利用山茶植物水提取物制备纳米硒具体按照以下步骤：

A、将摩尔比为1:2～1:20的亚硒酸钠溶液与维生素C溶液在山茶植物水提取物存在的条件下发生还原反应，于20～80℃水浴静置0.5～72h，得到纳米硒溶胶；所述亚硒酸钠溶液的浓度为10～100mM，维生素C的浓度为100～500mM；所述山茶植物水提取物的添加量为25～900mg/L；

B、纳米硒溶胶经高速离心分离、超滤离心分离或透析分离，脱除维生素C，得到纳米硒悬液，冷冻干燥得到固体纳米硒；所述高速离心分离是在4℃条件下，以转速8000～11000r/min离心30～40min，所述超滤离心分离是采用3～100kDa离心超滤管，在4℃条件下以转速1000～4000g离心10～40min，所述透析分离是采用3.5～8000kDa再生纤维素透析袋透析12～96h。

步骤A所述亚硒酸钠溶液的浓度为10mM，维生素C的浓度为100mM；所述亚硒酸钠溶液与维生素C溶液的摩尔比为1:8；所述山茶植物纳米聚集体的添加量为25mg/L或50mg/L；所述水浴的温度为25℃，静置的时间为24h。

一种根据上述的方法制备得到的纳米硒。

通过MTT法检测肿瘤细胞存活率，评价本发明所得纳米硒的抗癌活性；通过化学抗炎法和炎症细胞模型，评价本发明所得纳米硒的抗炎活性。

上述肿瘤细胞模型包括：HCT 116细胞系、Hepa1c1c7细胞系、MDA-MB-231细胞系、HepG2细胞系、Hela细胞系等，优选HCT 116细胞系。

上述化学抗炎法为参照Tsai等方法。

上述炎症细胞模型包括：Raw264.7细胞系、Caco-2细胞系、HUVEC细胞系等，优选Raw264.7细胞系。

上述抗炎活性测定包括：化学抗炎法和细胞法，优选细胞法。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：本发明采用聚合物模板法，以山茶植物水提取物为模板，利用山茶植物水提取物与硒的健康功效有机结合，自组装纳米硒。赋予纳米硒以山茶植物水提取物及其生物活性成分的功效，增强纳米硒的功能特性，拓宽纳米硒的应用领域，提高其应用价值。

附图说明

图1为浸提温度对不同初制工艺加工干茶的水提取物理化组成的影响。

图2为浸提时间对不同初制工艺加工干茶的水提取物理化组成的影响。

图3为以不同初制工艺加工干茶的水提取物为模板的纳米硒的平均直径。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

为了使本发明的目的、技术方案更加清晰明白，下面结合以茶(Camelliasinensis)、可可茶(Camellia ptilophylla)鲜叶经不同初制工艺加工干茶的水提取物作为模板举例，对本发明进行进一步详细说明。本发明所用设备仪器和试剂均为本领域所常用。应当理解，此处所描述的举例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：山茶植物水提取物的制备。

准确称取4.5g磨碎绿茶，按1:50茶水比分别于0、25、45、65、85、100℃水浴浸提30min，每隔10min摇一次，浸提结束后用定量滤纸抽滤，定容，测定其总多酚、生物碱、蛋白质、多糖等化学组分浓度，结果如图1所示，浸提温度为100℃时，总多酚、蛋白质和多糖浓度最高。茶汤经冷冻干燥得绿茶水提取物冻干粉，于-20℃保存。

实施例2：山茶植物水提取物的制备。

准确称取4.5g磨碎绿茶，按1:50茶水比于100℃水浴浸提2、4、6、8、10、15、20、30、40min，浸提结束后用定量滤纸抽滤，定容，测定其总多酚、生物碱、蛋白质、多糖等化学组分浓度，结果如图2所示，浸提时间为30min时，蛋白质和多糖浓度达到最高。茶汤经冷冻干燥得绿茶水提取物冻干粉，于-20℃保存。

实施例3：利用山茶植物水提取物制备纳米硒。

(1)分别配制10mM的亚硒酸钠溶液、100mM的维生素C溶液。

(2)分别称取不同山茶植物(绿茶、白茶、黄茶、乌龙茶、红茶、普洱茶、可可茶绿茶、可可茶红茶)水提取物冻干粉2.5mg和5mg于5mL离心管中，用10mL超纯水转移至烧杯中，加入72mL超纯水，搅拌均匀，过0.8μm滤膜，加入10mL 10mM的亚硒酸钠溶液，混合均匀后静置15min，然后加入8mL 100mM的维生素C溶液，混匀，反应静置24h，得到纳米硒胶体溶液。

(3)将纳米硒胶体溶液，通过3.5kDa再生纤维素透析袋透析24h以脱除未反应维生素C，测定纳米硒胶体溶液胶体化学特性，结果如图3所示，模板添加浓度为25mg/L时，纳米硒平均直径较小，纳米硒平均直径大小与模板粒径大小、添加量相关。

(4)透析后的纳米硒胶体溶液冷冻干燥得固体纳米硒粉末，于-20℃保藏，待用。

实施例4：纳米硒的抗癌活性测定

通过胰蛋白酶消化贴壁HCT 116细胞制成单细胞悬液，以5×10⁴个细胞/孔接种96孔培养板，置于37℃、5％CO₂培养箱中预培养24h，不同初制工艺加工干茶水提取物为模板(模板量分别为25mg)的纳米硒用培养基溶解后，按100μL/孔加入培养基，继续培养72h。往培养板加入0.05mg/mL MTT稀释液100μL/孔，放置在37℃、5％CO₂培养箱中继续培养2h后弃上清，每孔加入200μL DMSO溶液，放置在100rpm/min的摇床中振荡15～20min，测定各孔OD₅₅₀值，以对照组OD₅₅₀值为100％，计算各组纳米硒抑制细胞增殖的半抑制浓度(IC₅₀)，如表1所示，以绿茶、白茶、黄茶、乌龙茶、红茶、普洱茶和可可茶红茶水提取物为模板制备的纳米硒均具有较强的抗增殖活性，其中以绿茶水提取物为模板的纳米硒抑制HCT116细胞增殖的活性最强。

表1不同初制工艺加工干茶的水提取物为模板的纳米硒抑制HCT 116细胞增殖的半抑制浓度(IC₅₀)

(样品浓度梯度为3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/mL；以可可茶绿茶水提取物为模板的纳米硒在此浓度范围内，细胞存活率>0.5。)

实施例5：纳米硒的抗炎活性测定

通过刮刀将贴壁Raw264.7细胞刮下，吹打分散成单细胞悬液，以5×10⁵个细胞/孔接种96孔培养板，置于37℃、5％CO₂培养箱中预培养24h，不同初制工艺加工干茶水提取物为模板(模板量分别为25mg和50mg)的纳米硒用培养基溶解后，按100μL/孔加入培养基，并加入1μg/mL LPS工作液100μL/孔，继续培养24h。分别取出培养板中样品培养基100μL/孔于新培养板中，加入Griess试剂100μL/孔，静置10min，测定OD₅₄₂值，计算各组纳米硒对NO产生的抑制率。旧培养板弃培养液后，加入0.05mg/mL MTT稀释液100μL/孔，放置在37℃、5％CO₂培养箱中继续培养1h后弃上清，每孔加入200μL DMSO溶液，放置在100rpm/min的摇床中振荡10～15min，测定各孔OD₅₅₀值，以对照组OD₅₅₀值为100％，计算细胞存活率。以细胞存活率>50％，计算各组纳米硒抑制NO产生的半抑制浓度(IC₅₀)，如表2所示，以白茶、红茶、可可茶红茶水提取物为模板制备的纳米硒具有较强的抗炎活性。

表2不同初制工艺加工干茶的水提取物为模板的纳米硒对Raw264.7细胞NO产生的半抑制浓度(IC₅₀)

(样品浓度梯度为3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/mL；以绿茶、黄茶、乌龙茶、普洱茶、可可茶绿茶在此浓度范围内，NO抑制率<0.5。)

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种利用山茶植物水提取物制备纳米硒的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）制备山茶植物水提取物；

（2）利用山茶植物水提取物制备纳米硒；

步骤（2）所述利用山茶植物水提取物制备纳米硒具体按照以下步骤：

A、将摩尔比为1:2~1:20的亚硒酸钠溶液与维生素C溶液在山茶植物水提取物存在的条件下发生还原反应，于20~80 ℃水浴静置0.5~72 h，得到纳米硒溶胶；所述亚硒酸钠溶液的浓度为10~100 mM，维生素C的浓度为100~500 mM；所述山茶植物水提取物的添加量为25~900 mg/L；

B、纳米硒溶胶经高速离心分离、超滤离心分离或透析分离，脱除维生素C，得到纳米硒悬液，冷冻干燥得到固体纳米硒；所述高速离心分离是在4 ℃条件下，以转速8000~11000r/min离心30~40 min，所述超滤离心分离是采用3~100 kDa离心超滤管，在4 ℃条件下以转速1000~4000 g离心10~40 min，所述透析分离是采用3.5~8000 kDa再生纤维素透析袋透析12~96 h。

2.根据权利要求1所述的一种利用山茶植物水提取物制备纳米硒的方法，其特征在于：步骤（1）所述制备山茶植物水提取物具体按照以下步骤：将山茶植物原料按料液比1:10~1:250分别加入25~100 ℃水，然后在25~100 ℃水浴条件下浸提2~120 min得到山茶植物水提取液，冷冻干燥得冻干粉，得到山茶植物水提取物，于-20 ℃保存，待用。

3.根据权利要求2所述的一种利用山茶植物水提取物制备纳米硒的方法，其特征在于：所述步骤（1）所述料液比为1:50，水浴的温度为100 ℃；所述浸提的时间为30 min。

4.根据权利要求1所述的一种利用山茶植物水提取物制备纳米硒的方法，其特征在于：步骤A所述亚硒酸钠溶液的浓度为10 mM，维生素C的浓度为100 mM；所述亚硒酸钠溶液与维生素C溶液的摩尔比为1:8；所述山茶植物水提取物的添加量为25 mg/L或50 mg/L；所述水浴的温度为25 ℃，静置的时间为24 h。

5.一种根据权利要求1-4任一项所述的方法制备得到的纳米硒。

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