CN113234552B - 一种啤酒花多糖纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种啤酒花多糖纳米粒子及其在功能性啤酒生产中的应用，属于食品技术领域。啤酒花多糖纳米粒子的制备方法包括：(1)配制壳聚糖‑醋酸溶液，调节pH至3～5；(2)配制啤酒花多糖溶液，调节pH与壳聚糖‑醋酸溶液一致；(3)配制功能因子溶液；(4)在搅拌条件下，将功能因子溶液滴加入壳聚糖‑醋酸溶液中，再滴加啤酒花多糖溶液，控制壳聚糖与啤酒花多糖的质量比为2:1～1:2，进而制得壳聚糖‑啤酒花多糖包埋功能因子纳米粒子。本发明通过啤酒花多糖与壳聚糖之间的聚电解质络合作用制备得到的纳米粒子，能够有效包埋功能因子。基于此纳米粒子生产出的功能性啤酒产品，能有效降低储存过程中功能因子的损失。

Description

一种啤酒花多糖纳米粒子及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及食品技术领域，具体涉及一种啤酒花多糖纳米粒子及其在功能性啤酒生产中的应用。

背景技术

功能因子指的是能通过激活酶的活性或其他途径，调节人体机能的物质。功能食品中功能因子是功能食品真正起生理作用的活性成分，是生产功能食品的关键。常见的功能因子大多是从动物、植物、微生物中提取得到的组成成分、代谢产物或内源性化学物质，具有来源丰富、种类繁多、生理活性功能较强等特征。来源于植物的有效成分主要有黄酮类、生物碱类、多糖类、挥发油类、醌类、萜类、木脂素类、香豆素类、皂苷类、强心苷类、酚酸类、氨基酸以及酶类等；来源于微生物及发酵液的有效成分主要有多糖类、酶类、抗生素类、色素类、氨基酸类、有机酸类、醇酮类、维生素类、核酸类等；来源于海洋生物的有效成分主要有甾醇、萜类、皂甙、不饱和脂肪酸、多糖和糖苷、大环内酯、聚醚类化合物和多肽等。

功能因子通常具有各类较强的生理活性功能，例如抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、抑菌、抗病毒、抗衰老、抗心血管疾病、抗神经退行性疾病等，具有非常巨大的发展潜力。如何将各类功能性功能因子应用到食品体系中，业已成为行业研究热点。

啤酒花(Humulus lupulus L.)，别名蛇麻花、唐草花、忽布等，是桑科葎草属多年生攀援草本植物，能够赋予啤酒特殊的苦味和独特的风味，因而常用于啤酒酿造中。啤酒花中已检测出数百种组成不同的有机化合物，主要成分包括苦味质、挥发油、纤维素、多酚、木质素、蛋白质、可溶性多糖、蜡质、鞣质、黄酮等，尤其是其中的多酚、黄酮及挥发油类物质，因具有镇定、安神、催眠、杀菌、抗炎和利尿等药理活性作用，而被广泛研究与开发。

近年来，随着研究的逐渐发展与深入，植物多糖类物质的生理活性逐渐被人们所发现，包括降血糖、降血脂、抗血栓、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射和调节免疫功能等，正逐渐成为国内外学界的研究热点之一。研究证明，啤酒花中含有丰富的多糖类物质，具有良好的抗氧化等生物活性，尤其是清除羟基自由基和亚硝酸盐的能力较强。从结构上看，啤酒花多糖是一类β-型吡喃糖，分子量在1.5-50kDa左右，支链基团丰富，易于化学修饰和改性。其单糖组成主要包括D-阿拉伯糖、D-半乳糖和L-(-)-岩藻糖等，以及少量的L-鼠李糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸和D-半乳糖醛酸等。目前对于啤酒花的生产加工主要集中在苦味质、挥发油以及多酚、黄酮类的提取上，绝大多数的啤酒花多糖仍残留在啤酒花萃余物中，可以通过水提醇沉、脱色、脱蛋白，以及凝胶色谱分离等方法进行提取纯化。但目前对于啤酒花多糖在产业化应用等方面的研究依旧较少，尤其是在功能性保健食品领域和包埋材料领域，目前鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以包埋功能因子的纳米粒子，并将其应用到功能性啤酒的生产当中。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种啤酒花多糖纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

(1)将壳聚糖溶于醋酸溶液中，并调节pH至3～5，制得壳聚糖-醋酸溶液；

(2)将啤酒花多糖溶于水中，调节pH与壳聚糖-醋酸溶液一致，制得啤酒花多糖溶液；

(3)将待包埋的功能因子溶于溶剂中制得功能因子溶液；

(4)在搅拌条件下，将功能因子溶液滴加入壳聚糖-醋酸溶液中，再滴加啤酒花多糖溶液，控制壳聚糖与啤酒花多糖的质量比为2:1～1:2，制得含有壳聚糖-啤酒花多糖包埋功能因子纳米粒子的混合液；

(5)从混合液中分离得到所述的啤酒花多糖纳米粒子。

本发明研究发现，在pH＝3～5的条件下，啤酒花多糖具有良好的负电性，它可以通过与壳聚糖之间的静电作用发生聚电解质络合，形成稳定的纳米粒子，能够包埋以黄腐酚、苯乙醇苷(毛蕊花糖苷)等为代表的一系列功能因子，表现出了良好的粒径、分散性、Zeta电位、包封率、负载率。基于此纳米粒子生产出的功能性啤酒产品，能有效降低储存过程中功能因子的损失。

步骤(1)中，称取壳聚糖粉末，溶解于体积百分比浓度为0.6～1.2％的醋酸水溶液中，磁力搅拌至完全溶解，用NaOH溶液将pH调节至3-5，得到壳聚糖-醋酸溶液。

壳聚糖-醋酸溶液中壳聚糖的质量百分比浓度为0.1～0.5％，所述壳聚糖的分子量为100～500kDa，去乙酰度为90％～95％。

优选的，壳聚糖-醋酸溶液的pH为4。

步骤(2)中，称取啤酒花多糖溶于去离子水中，用醋酸溶液调节pH至与壳聚糖-醋酸溶液一致，得到啤酒花多糖溶液。

啤酒花多糖溶液中啤酒花多糖的质量百分比浓度为0.1～0.5％，所述啤酒花多糖由啤酒花萃余物经水提醇沉法制备得到，纯度≥90％，分子量在20～50kDa。所述啤酒花萃余物为啤酒生产中产生的酒花渣。

具体地，啤酒花多糖的制备方法包括：1)取啤酒生产中的酒花渣(啤酒花萃余物)，利用水提法提取粗多糖，提取条件为：料液比为1:5～1:20，萃取温度为40～80℃，萃取时间为2～8h；2)收集提取液，旋蒸浓缩，再加入乙醇，调节溶液中乙醇浓度达40～80％，静置后过滤，收集沉淀，洗涤，干燥得到粗品；3)将粗品溶于蒸馏水，进行脱色、脱蛋白处理，再按步骤(2)的方法醇析、洗涤、冻干，得精制品；4)将精制品溶于蒸馏水，经DEAE-纤维柱柱层析，收集分子量在20～50kDa的多糖物质溶液，旋蒸浓缩后透析，再经醇析、洗涤、冻干后即得所述啤酒花多糖。

优选的，步骤1)中，利用超声辅助提取，超声功率为300～600w、超声时间为0.5～2h。步骤2)中，提取液旋蒸浓缩至原体积的10％～20％，再加入乙醇进行醇沉。步骤3)中，粗品溶于蒸馏水后，加入活性炭或过氧化氢溶液脱色，以酶-化学联用法脱蛋白。

步骤(3)中，根据功能因子特性选择相应的溶剂使其溶解，溶剂优选为水或无水乙醇。可结合超声以加速溶解。

所述的功能因子主要指各类从动物、植物、微生物中提取得到的组成成分、代谢产物或内源性化学物质，包括但不限于各类蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、生物酶、挥发油、黄酮、糖苷、有机酸、维生素、甾醇、脂肪酸等物质，也可以是以各类功能因子为主要成分的多种物质的组合或复配。

优选的，所述的功能因子为黄腐酚、苯乙醇苷、豆甾醇、大麻二酚、白藜芦醇、芦丁、麦角甾醇中的一种或几种。

步骤(4)中，在磁力搅拌过程中，取功能因子溶液缓慢滴入壳聚糖-醋酸溶液中，再滴入啤酒花多糖溶液，继续搅拌1～3h，使得啤酒花多糖与壳聚糖发生聚电解质络合，形成纳米粒子，在此过程中功能因子被包埋进纳米粒子中。

优选的，搅拌转速为1000～3000rpm，反应温度为15～35℃。

优选的，壳聚糖与酒花多糖的质量比为1:1。

当功能因子采用无水乙醇作为溶剂时，在反应结束后，20～50℃旋转蒸发10～40min以除去乙醇。

步骤(5)中，利用高速离心，将啤酒花多糖纳米粒子从混合液中分离。离心条件为9000～10000g，30～45min。离心后收集沉淀，蒸馏水洗涤2-3次后干燥得到啤酒花多糖纳米粒子粉末，即壳聚糖-啤酒花多糖包埋功能因子的纳米粒子。

本发明提供了由所述制备方法制得的啤酒花多糖纳米粒子。

本发明还提供了所述的啤酒花多糖纳米粒子在制备功能性啤酒中的应用，所述应用为：在啤酒生产过程中，按照0.01～5g/L向啤酒中添加所述的啤酒花多糖纳米粒子，该功能性啤酒中功能因子含量为0.1～1000mg/L。

所述功能性啤酒产品出厂时，其中功能因子含量为0.1～1000mg/L；且出厂后6个月内，啤酒产品中该功能因子的总含量不低于初始含量的15％。

功能性啤酒产品的具体制备方法为：称取一定量壳聚糖-啤酒花多糖包埋功能因子的纳米粒子粉末，在啤酒生产过程中加入，再经灭菌、封装等处理后即可制得富含功能因子的功能性啤酒产品。

能够加入纳米粒子的啤酒生产过程包括但不限于麦汁冷却、发酵熟成、过滤以及清酒处理等，优选的，在啤酒生产过程中的过滤或清酒阶段添加啤酒花多糖纳米粒子。

优选的，啤酒花多糖纳米粒子按照0.1～1g/L向啤酒中添加。更为优选，啤酒花多糖纳米粒子以500mg/L添加至啤酒中。

与现有技术相比，本发明所取得的有益效果是：

1)本发明通过啤酒花多糖与壳聚糖之间的聚电解质络合作用制备得到的纳米粒子，能够有效包埋以黄腐酚、苯乙醇苷(毛蕊花糖苷)等为代表的一系列功能因子。相较于其他壁材的载体微粒，该纳米粒子具有较小的粒径、良好的分布、以及较高的包封率和负载率。将壳聚糖-啤酒花多糖进行复配以制备纳米粒子为首次报道。

2)本发明在制备壳聚糖-啤酒花多糖纳米粒子的基础上，提供了一种富含功能因子的功能性啤酒及其制备方法。该方法能够将啤酒中的功能因子含量维持在更高水平，有效增强啤酒中功能因子的储藏稳定性和缓释效果，从而提升产品的心血管保护、抗衰老等功能。

3)本发明中用于制备纳米粒子的主要原料：啤酒花多糖，具有良好的生物相容性和较强的生理活性功能，并且大量存在于啤酒生产中的萃余物废渣中，来源丰富、成本低廉，可促进废弃资源的再生利用，提高啤酒产品的附加值。

4)本发明中涉及到的各制备工艺简单便捷，不使用任何对人体或对环境有毒有害的有机物和化学品，绿色安全无污染，符合可持续发展要求。

附图说明

图1为实施例2至5、比较例2中各功能性啤酒样品储藏180天后的黄腐酚含量。

图2为实施例7至10、比较例7中各功能性啤酒样品储藏180天后的毛蕊花糖苷含量。

图3为实施例16至20、比较例16至20中各功能性啤酒样品储藏180天后的功能因子含量。

图4为各功能性啤酒样品的黄腐酚含量随时间变化曲线，其中A为实施例2与对比例2-1-1至2-1-4的样品，B为实施例2与对比例2-2-1至2-2-4的样品，C为实施例2与对比例2-3-1至2-3-4的样品，D为实施例2与对比例2-4-1至2-4-6的样品，E为实施例2与对比例2-5-1至2-5-3的样品，F为实施例2至5的样品。

图5为各功能性啤酒样品的毛蕊花糖苷含量随时间变化曲线，其中A为实施例7与对比例7-1至7-4的样品，B为实施例7至10的样品。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，对本发明做进一步的详细说明。但是，这些实施例、对比例仅用于更详细地说明本发明，并不对本发明所附权利要求范围构成任何限制。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

啤酒花多糖在参照专利文献CN 102558379 A记载方法的基础上进行调整，并制备得到，具体步骤为：

1)取啤酒生产中的酒花渣(啤酒花萃余物)，通过超声辅助热水浸提法从中提取粗多糖。提取条件：料液比为1:8、萃取时间为2h、萃取温度为50℃、提取次数为2次、超声功率为500w、超声时间为0.5h。

2)合并提取液溶液，旋蒸浓缩至原体积的10％，加入高浓度乙醇，调节溶液中乙醇浓度达70％，静置24h后过滤，收集沉淀。滤液再重复此步骤2次，合并每次得到的沉淀，用高浓度乙醇洗涤后溶于适量蒸馏水，过滤，取滤液冷冻干燥得到粗品。

3)将粗品溶于适量蒸馏水，加入活性炭或过氧化氢溶液脱色，以酶-化学联用法脱蛋白，按步骤2)所述再次醇析、洗涤、冻干，得精制品。

4)将精制品溶于适量蒸馏水，经DEAE-纤维柱柱层析后，收集所需分子量范围的多糖物质溶液，旋蒸浓缩后透析2天，醇析、洗涤、冻干后即得符合所需条件的啤酒花多糖。

其中酒花渣购自杭州千岛湖啤酒有限公司。

壳聚糖、黄腐酚、毛蕊花糖苷购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

豆甾醇、大麻二酚、白藜芦醇、芦丁以及麦角甾醇购自上海源叶生物科技有限公司。

实施例1

纳米粒子制备，功能因子为黄腐酚，制备工艺参数：pH＝4，XN:CS＝1:20，CS:HP＝1:1。

1、溶液配制

准确称100mg壳聚糖粉末，溶解于100mL浓度为1.0％(v/v)的醋酸溶液，磁力搅拌至完全溶解，用NaOH溶液将pH调节至4，得到壳聚糖浓度为0.1％的溶液，备用。

准确称取啤酒花多糖粉末100mg，溶于100mL去离子水，用醋酸溶液调节pH至4，得到啤酒花多糖浓度为0.1％的溶液，备用。

准确称取5mg黄腐酚溶于1mL无水乙醇，适当超声以加速溶解，得到黄腐酚浓度为0.5％的溶液。

2、在1500rpm磁力搅拌下，取1mL黄腐酚溶液缓慢滴入100mL壳聚糖溶液中，再缓慢滴入100mL啤酒花多糖溶液，继续搅拌2h，之后40℃旋转蒸发30min以除去乙醇。将所得溶液在10000g下离心30min，取1mL上清液保存，并用去离子水洗涤沉淀物2次，40℃真空干燥后得到壳聚糖-啤酒花多糖包埋黄腐酚的纳米粒子粉末。准确称取1mg纳米粒子粉末溶于1mL乙醇并保存。

比较例1

1、不同pH条件

将实施例1中配制壳聚糖-醋酸溶液和啤酒花多糖溶液时，pH改为2、3、5、6，其余同实施例1。制得的纳米粒子分别对应表1的对比例1-1-1、对比例1-1-2、对比例1-1-3、对比例1-1-4。

2、不同壳聚糖与啤酒花多糖的质量比

将实施例1中啤酒花多糖溶液的添加量分别改为33.3mL，50mL，200mL，300mL，即壳聚糖-醋酸溶液和啤酒花多糖溶液的体积比分别为CS:HP＝3:1，2:1，1:2，1:3，其余同实施例1。制得的纳米粒子分别对应表1的对比例1-2-1，对比例1-2-2，对比例1-2-3，对比例1-2-4。

3、不同壁材物质

对比例1-3-1：利用三聚磷酸钠制备纳米粒子

按实施例1中所述，制备得到浓度为0.1％的壳聚糖溶液100mL(pH＝4)和浓度为0.5％的黄腐酚溶液1mL，备用。

另准确称取25mg三聚磷酸钠，溶于25mL去离子水，用醋酸溶液调节pH至4，得到三聚磷酸钠浓度为0.1％的溶液，备用。

在1500rpm磁力搅拌下，取1mL黄腐酚溶液缓慢滴入100mL壳聚糖溶液中，再缓慢滴入25mL三聚磷酸钠溶液，继续搅拌2h，之后40℃旋转蒸发30min以除去乙醇。将所得溶液在10000g下离心30min，取1mL上清液保存，并用去离子水洗涤沉淀物2次，40℃真空干燥后得到壳聚糖-三聚磷酸钠包埋黄腐酚的纳米粒子粉末。准确称取1mg纳米粒子粉末溶于1mL乙醇并保存。

对比例1-3-2：利用海藻酸钠制备纳米粒子

按实施例1中所述，制备得到浓度为0.1％的壳聚糖溶液100mL(pH＝4)和浓度为0.5％的黄腐酚溶液1mL，备用。

另准确称取120mg海藻酸钠，溶于120mL去离子水，用醋酸溶液调节pH至4，得到海藻酸钠浓度为0.1％的溶液，备用。

在1500rpm磁力搅拌下，取1mL黄腐酚溶液缓慢滴入100mL壳聚糖溶液中，再缓慢滴入120mL海藻酸钠溶液，继续搅拌2h，之后40℃旋转蒸发30min以除去乙醇。将所得溶液在10000g下离心30min，取1mL上清液保存，并用去离子水洗涤沉淀物2次，40℃真空干燥后得到壳聚糖-海藻酸钠包埋黄腐酚的纳米粒子粉末。准确称取1mg纳米粒子粉末溶于1mL乙醇并保存。

对比例1-3-3：利用葡聚糖硫酸钠制备纳米粒子

按实施例1中所述，制备得到浓度为0.1％的壳聚糖溶液100mL(pH＝4)和浓度为0.5％的黄腐酚溶液1mL，备用。

另准确称取80mg葡聚糖硫酸钠，溶于80mL去离子水，用醋酸溶液调节pH至4，得到海藻酸钠浓度为0.1％的溶液，备用。

在1500rpm磁力搅拌下，取1mL黄腐酚溶液缓慢滴入100mL壳聚糖溶液中，再缓慢滴入80mL葡聚糖硫酸钠溶液，继续搅拌2h，之后40℃旋转蒸发30min以除去乙醇。将所得溶液在10000g下离心30min，取1mL上清液保存，并用去离子水洗涤沉淀物2次，40℃真空干燥后得到壳聚糖-葡聚糖硫酸钠包埋黄腐酚的纳米粒子粉末。准确称取1mg纳米粒子粉末溶于1mL乙醇并保存。

实施例2

啤酒制备(淡啤)

选择美式淡色拉格啤酒(原麦汁浓度8°P，酒精度≥3.1％vol)作为啤酒产品的基液。在该啤酒生产的清酒环节，在清酒液注入清酒罐时，加入实施例1中的纳米粒子适量，控制纳米粒子的添加量为500mg/L，其余生产条件不变，经灭菌、罐装等处理后即得到一款富含功能因子的功能性啤酒产品。

比较例2

1、将实施例2中加入的纳米粒子分别改为对比例1-1-1、对比例1-1-2、对比例1-1-3、对比例1-1-4中的纳米粒子，其余同实施例2。制备的啤酒分别对应图1中的对比例2-1-1、对比例2-1-2、对比例2-1-3、对比例2-1-4。

2、将实施例2中加入的纳米粒子分别改为对比例1-2-1，对比例1-2-2，对比例1-2-3，对比例1-2-4中的纳米粒子，其余同实施例2。制备的啤酒分别对应图1中的对比例2-2-1，对比例2-2-2，对比例2-2-3，对比例2-2-4。

3、将实施例2中加入的纳米粒子分别改为对比例1-3-1，对比例1-3-2，对比例1-3-3中的纳米粒子，以及将实施例2中加入的纳米粒子改为对应剂量的黄腐酚粉末(以芯材物质的质量计算)，其余同实施例2。制备的啤酒分别对应图1中的对比例2-3-1，对比例2-3-2，对比例2-3-3，对比例2-3-4。

4、纳米粒子添加量优化

将实施例2中纳米粒子的添加量分别改为5mg/L，10mg/L，100mg/L，1g/L，5g/L，10g/L，其余同实施例2。制备的啤酒分别对应图1中的对比例2-4-1，对比例2-4-2，对比例2-4-3，对比例2-4-4，对比例2-4-5，对比例2-4-6。

5、纳米粒子添加环节优化

对比例2-5-1：将实施例2加入纳米粒子的节点改为啤酒生产中的麦汁冷却环节，待麦汁温度降至10℃左右时加入纳米粒子，其余同实施例2。

对比例2-5-2：将实施例2加入纳米粒子的节点改为啤酒生产中的发酵环节，待发酵液温度降至0℃左右时加入纳米粒子，其余同实施例2。

对比例2-5-3：将实施例2加入纳米粒子的节点改为啤酒生产中的过滤环节，在啤酒液注入过滤机前加入纳米粒子，其余同实施例2。

实施例3

啤酒制备(黑啤)

选择德国慕尼黑啤酒(原麦汁浓度12°P，酒精度≥4.1％vol)作为啤酒产品的基液。在该啤酒生产的清酒环节，在清酒液注入清酒罐时，加入实施例1中的纳米粒子适量，控制纳米粒子的投料比为500mg/L，其余生产条件不变，经灭菌、罐装等处理后即得到一款富含功能因子的功能性啤酒产品。

实施例4

啤酒制备(IPA)

选择印度淡色艾尔啤酒(原麦汁浓度15.5°P，酒精度≥5.9％vol)作为啤酒产品的基液。在该啤酒生产的清酒环节，在清酒液注入清酒罐时，加入实施例1中的纳米粒子适量，控制纳米粒子的投料比为500mg/L，其余生产条件不变，经灭菌、罐装等处理后即得到一款富含功能因子的功能性啤酒产品。

实施例5

啤酒制备(精酿原浆)

选择浑浊型精酿原浆啤酒(原麦汁浓度9°P，酒精度≥3.6％vol)作为啤酒产品的基液。在该啤酒生产的清酒环节，在清酒液注入清酒罐时，加入实施例1中的纳米粒子适量，控制纳米粒子的投料比为500mg/L，其余生产条件不变，经灭菌、罐装等处理后即得到一款富含功能因子的功能性啤酒产品。

实施例6

纳米粒子制备，功能因子为毛蕊花糖苷，制备工艺参数：pH＝4，GP:CS＝1:5，CS:HP＝1:1。

将实施例1中浓度为0.5％的黄腐酚溶液(1mL)改为2％的毛蕊花糖苷溶液(1mL)，其余同实施例1。

比较例6

对比例6-1：将比较例1中对比例1-3-1的浓度为0.5％的黄腐酚溶液(1mL)改为2％的毛蕊花糖苷溶液(1mL)，其余同对比例1-3-1。即纳米粒子的组成为壳聚糖与三聚磷酸钠。

对比例6-2：将比较例1中对比例1-3-2的浓度为0.5％的黄腐酚溶液(1mL)改为2％的毛蕊花糖苷溶液(1mL)，其余同对比例1-3-2。即纳米粒子的组成为壳聚糖与海藻酸钠。

对比例6-3：将比较例1中对比例1-3-3的浓度为0.5％的黄腐酚溶液(1mL)改为2％的毛蕊花糖苷溶液(1mL)，其余同对比例1-3-3。即纳米粒子的组成为壳聚糖与葡聚糖硫酸钠。

实施例7

将实施例2中加入的纳米粒子改为实施例6中的纳米粒子，其余同实施例2。

比较例7

将实施例7中加入的纳米粒子分别改为对比例6-1，对比例6-2，对比例6-3中的纳米粒子，以及将实施例7中加入的纳米粒子改为对应剂量的毛蕊花糖苷粉末(以芯材物质的质量计算)，其余同实施例7。制备的啤酒对应图2的对比例7-1，对比例7-2，对比例7-3，对比例7-4。

实施例8

将实施例3中加入的纳米粒子改为实施例6中的纳米粒子，其余同实施例3。

实施例9

将实施例4中加入的纳米粒子改为实施例6中的纳米粒子，其余同实施例4。

实施例10

将实施例5中加入的纳米粒子改为实施例6中的纳米粒子，其余同实施例5。

实施例11

纳米粒子制备，功能因子为豆甾醇，制备工艺参数：pH＝4，豆甾醇:CS＝1:10，CS:HP＝1:1。

将实施例1中浓度为0.5％的黄腐酚溶液(1mL)改为1％的豆甾醇溶液(1mL)，其余同实施例1。

实施例12

纳米粒子制备，功能因子为大麻二酚，制备工艺参数：pH＝4，大麻二酚:CS＝1:20，CS:HP＝1:1。

将实施例1中浓度为0.5％的黄腐酚溶液(1mL)改为0.5％的大麻二酚溶液(1mL)，其余同实施例1。

实施例13

纳米粒子制备，功能因子为白藜芦醇，制备工艺参数：pH＝4，白藜芦醇:CS＝1:20，CS:HP＝1:1。

将实施例1中浓度为0.5％的黄腐酚溶液(1mL)改为0.5％的白藜芦醇溶液(1mL)，其余同实施例1。

实施例14

纳米粒子制备，功能因子为芦丁，制备工艺参数为：pH＝4，芦丁:CS＝1:10，CS:HP＝1:1。

将实施例1中浓度为0.5％的黄腐酚溶液(1mL)改为1％的芦丁溶液(1mL)，其余同实施例1。

实施例15

纳米粒子制备，功能因子为麦角甾醇，制备工艺参数：pH＝4，麦角甾醇:CS＝1:20，CS:HP＝1:1。

将实施例1中浓度为0.5％的黄腐酚溶液(1mL)改为0.5％的麦角甾醇溶液(1mL)，其余同实施例1。

实施例16

将实施例2中加入的纳米粒子改为实施例11中的纳米粒子，其余同实施例2。

比较例16

对比例16-1：将实施例16中加入的纳米粒子改为对应剂量的豆甾醇粉末(以芯材物质的质量计算)，其余同实施例16。

实施例17

将实施例2中加入的纳米粒子改为实施例12中的纳米粒子，其余同实施例2。

比较例17

对比例17-1：将实施例17中加入的纳米粒子改为对应剂量的大麻二酚粉末(以芯材物质的质量计算)，其余同实施例17。

实施例18

将实施例2中加入的纳米粒子改为实施例13中的纳米粒子，其余同实施例2。

比较例18

对比例18-1：将实施例18中加入的纳米粒子改为对应剂量的白藜芦醇粉末(以芯材物质的质量计算)，其余同实施例18。

实施例19

将实施例2中加入的纳米粒子改为实施例14中的纳米粒子，其余同实施例2。

比较例19

对比例19-1：将实施例19中加入的纳米粒子改为对应剂量的芦丁粉末(以芯材物质的质量计算)，其余同实施例19。

实施例20

将实施例2中加入的纳米粒子改为实施例15中的纳米粒子，其余同实施例2。

比较例20

对比例20-1：将实施例20中加入的纳米粒子改为对应剂量的麦角甾醇粉末(以芯材物质的质量计算)，其余同实施例20。

测试例1

对上述各实施例和比较例中的纳米粒子进行理化表征，检测并分析各功能性啤酒中功能因子含量的变化情况。

一、纳米粒度仪(检测指标：粒径PDI包封率负载量)

通过动态光散射粒度仪对实施例1、比较例1、实施例6、比较例6、实施例11至15中所得到的各纳米粒子的粒径、PDI、Zeta电位等进行测定。同时，通过高效液相色谱仪对上述各例中保存的上清液和各纳米粒子的乙醇萃取液进行检测，进而推算出各纳米粒子的包封率和负载率。所有结果重复测定三次。所得数据通过SPSS软件进行方差分析，结果以(平均值±标准误差)的形式表示，组间差异通过t检验进行分析，同一列不同字母表示存在显着差异(p＜0.05)。具体数据如下表1、表2、表3中所示。

表1.壳聚糖-啤酒花多糖及其他包埋黄腐酚纳米粒子的粒径、PDI、Zeta电位、包封率及负载量

分析表1数据可知，相较于表中列出的其他对比例，实施例1表现出了较好的粒径、PDI、Zeta电位、包封率和负载率。同时，依次比较对比例1-1-1至1-1-4，以及对比例1-2-1至1-2-4，可以发现制备工艺条件在本专利要求范围的纳米粒子(溶液pH为3-5；壳聚糖与酒花多糖的质量比为2:1-1:2)在各指标上均有更好的表现。而实施例1与对比例1-3-1至1-3-3的对比则说明，在各类常见的壳聚糖纳米粒子复配物中，本专利所述的壳聚糖-啤酒花多糖纳米粒子在包埋等量黄腐酚时表现出了相对更好的特性。

表2.壳聚糖-啤酒花多糖及其他包埋毛蕊花糖苷纳米粒子的粒径、PDI、Zeta电位、包封率及负载量

分析表2数据可知，在控制纳米粒子的制备工艺均在本专利范围内的前提下，将其芯材物质由黄腐酚换成毛蕊花糖苷之后，纳米粒同样表现出了较好的粒径、PDI、Zeta电位、包封率和负载率(实施例6)。同时，实施例6与对比例6-1至6-3的对比则说明，在各类常见的壳聚糖纳米粒子复配物中，本专利所述的壳聚糖-啤酒花多糖纳米粒子在包埋等量毛蕊花糖苷时表现出了相对更好的特性。

表3.包埋各类常见功能因子的壳聚糖-啤酒花多糖纳米粒子的粒径、PDI、Zeta电位、包封率及负载量

分析表3数据可知，同样在控制纳米粒子的制备工艺均在本专利范围内的前提下，继续将其芯材物质扩展到豆甾醇、大麻二酚、白藜芦醇、芦丁以及麦角甾醇等其他典型功能因子之后，纳米粒依旧表现出了较好的粒径、PDI、Zeta电位、包封率和负载率(实施例11至15)。这说明本专利所述的壳聚糖-啤酒花多糖纳米粒子在包埋各类功能因子时均具有较好表现，具有广泛的扩展空间与发展潜力。

二、啤酒中的功能因子含量变化曲线

通过高效液相色谱检测并分析实施例2至实施例5、比较例2、实施例7至10、比较例7、实施例16至20、比较例16至20中各功能性啤酒的黄腐酚或其他功能因子含量随储藏时间推移的变化情况。

准确称取新鲜出厂的啤酒样品100mL，超声脱气处理1h以上，依次做好标记。各样品通入氮气除氧后密封，置于25℃避光环境中储存。在储存时间达到0、7、14、21、30、45、60、90、120、180天时，分别从样品中取1mL溶液，经乙醇萃取后，通过高效液相色谱测定其中的功能因子含量，并注入1mL新鲜的同款啤酒(已预先超声脱气1h以上)作为补充。所有结果重复测定三次，所得数据通过SPSS软件进行方差分析，结果以(平均值±标准误差)的形式表示。

储藏180天时啤酒中的黄腐酚、毛蕊花糖苷以及其他功能因子含量如图1、图2、图3所示。同时，计算出各时刻功能因子含量与初始加入总量的比值，并依此绘制出各啤酒样品中黄腐酚或毛蕊花糖苷含量随时间推移的变化曲线，具体如下图4、图5所示。

分析图1可知，各方面条件均在本专利要求范围及优选范围内的啤酒样品(实施例2至5、对比例2-1-2、2-1-3、2-2-2、2-2-3、2-4-3、2-4-4、2-5-3)在储藏180天后均表现出了较高的黄腐酚含量。相比之下，部分条件在本专利所要求的范围内，但不在优选范围内的啤酒样品(对比例2-4-2、2-4-5、2-5-1、2-5-2)中黄腐酚含量表现出了不同程度的降低。部分条件不在本专利所要求的范围内的啤酒样品(对比例2-1-1、2-1-4、2-2-1、2-2-4、2-3-1、2-3-2、2-3-3、2-3-4、2-4-1、2-4-6)中的黄腐酚含量则显着低于其他相关组。实施例2与对比例2-3-4的比较，说明本专利提供的功能性啤酒制备方法显着优于直接添加黄腐酚的功能性啤酒制备方法，证明了纳米粒子包埋处理的必要性。而实施例2与对比例2-3-1至2-3-3的比较，则说明本专利所制备得到的包埋黄腐酚纳米粒子相较于其他壁材的纳米粒子，在功能性啤酒的制备上同样具有一定的优越性。实施例2-5中的啤酒样品均表现出较高的黄腐酚含量，说明本专利所述的功能性啤酒制备方法适用于各类常见的啤酒类型。

分析图2可知，在控制各条件均在本专利范围内的前提下，将纳米粒子包埋的功能因子由黄腐酚换成毛蕊花糖苷后，制备得到的功能性啤酒在储藏180天后均表现出了较高的毛蕊花糖苷含量(实施例7)。同时，实施例7与对比例7-4的比较，说明本专利提供的功能性啤酒制备方法显着优于直接添加毛蕊花糖苷的功能性啤酒制备方法，证明了纳米粒子包埋处理的必要性。而实施例7与对比例7-1至7-3的比较，则说明本专利所制备得到的包埋毛蕊花糖苷纳米粒子相较于其他壁材的纳米粒子，在功能性啤酒的制备上同样具有一定的优越性。另外，实施例8-10中的啤酒样品均表现出较高的毛蕊花糖苷含量，说明本专利所述的功能性啤酒制备方法适用于各类常见的啤酒类型。

分析图3可知，同样在控制各条件均在本专利范围内的前提下，继续将纳米粒子的芯材物质扩展到豆甾醇、大麻二酚、白藜芦醇、芦丁以及麦角甾醇等其他典型功能因子之后，制备得到的功能性啤酒在储藏180天后均表现出了较高的功能因子含量(实施例16至20)，并且均显着优于未做包埋处理、直接添加相应功能因子的啤酒产品(对比例16-1至20-1)。由此可见，本专利提供的纳米粒子包埋处理有助于提升各类常见的功能因子在啤酒产品中的有效含量(溶解性)和储藏稳定性，具有较好的扩展应用性。

由图4(A)(B)(E)可知，对于功能性啤酒制备而言，在纳米粒子制备液pH不同、壳聚糖-啤酒花多糖比例不同，以及啤酒生产中纳米粒子加入环节不同时，各方面条件在本专利要求范围内的啤酒样品(实施例2、对比例2-1-2、2-1-3、2-2-2、2-2-3、2-5-1、2-5-2、2-5-3)在储藏期内均表现出了较好的缓释率，显着优于部分条件不在本专利所要求的范围内的啤酒样品(对比例2-1-1、2-1-4、2-2-1、2-2-4)，而在优选范围内的样品(实施例2、对比例2-5-3)则表现更佳。这说明在本专利要求范围和优选范围内制备得到的功能性啤酒在黄腐酚含量变化上着较强的储藏稳定性。

同时，由图4(C)可知，通过本专利提供的方法制备得到的功能性啤酒(实施例2)表现出了良好的黄腐酚缓释效应，显着优于直接添加法制备得到的功能性啤酒(对比例2-3-4)，证明了纳米粒子包埋处理的必要性。此外，实施例2与对比例2-3-1至2-3-3的对比也说明，基于本专利纳米粒子制备得到的功能性啤酒，相较于基于其他壁材纳米粒子制备得到的功能性啤酒，在黄腐酚的缓释效应和储藏稳定性上有着更好的表现。

值得注意的是，在图4(D)中，部分条件不在本专利所要求的范围内的啤酒样品(对比例2-4-1、2-4-2、2-4-3)表现出了更高的黄腐酚缓释性。观察图1可以发现，这些具体例的啤酒样品储藏180天后的黄腐酚含量均极低，说明这可能是由于黄腐酚加入量或啤酒生产过程中纳米粒子添加量过少导致的。由于最终啤酒产品中的黄腐酚含量始终偏低，因此这些具体例同样不符合本专利所需要求。

观察图4(F)可知，在控制实施例2中其他条件均不变的情况下更换啤酒基液，制备得到的不同种类的功能性啤酒样品(实施例3-5)，在黄腐酚含量变化上均表现出了较好的缓释性和稳定性。这说明本专利提供的富含功能因子(黄腐酚)的功能性啤酒制备方法适用于包括淡色、深色、艾尔、拉格、精酿等各种常见类型的啤酒产品，具有较好的产业意义。各啤酒样品之间的黄腐酚缓释性存在一定的差异，可能与啤酒基液原有的色度、浊度等性质差异有关。

分析图5(A)可知，在控制各条件均在本专利范围内的前提下，将纳米粒子包埋的功能因子由黄腐酚换成毛蕊花糖苷后，制备得到的功能性啤酒在储藏期内同样表现出了较好的毛蕊花糖苷缓释效应(实施例7)，并且显着优于直接添加法制备得到的功能性啤酒(对比例7-4)，证明了纳米粒子包埋处理的必要性。同时，实施例7与对比例7-1至7-3的对比也说明，在更换所包埋的功能因子之后，基于本专利纳米粒子制备得到的功能性啤酒，相较于基于其他壁材纳米粒子制备得到的功能性啤酒，在芯材物质的缓释效应和储藏稳定性上依旧有着更好的表现。

而图5(B)则说明，在控制实施例7中其他条件均不变的情况下更换啤酒基液，制备得到的不同种类的功能性啤酒样品(实施例8-10)，在毛蕊花糖苷含量变化上均表现出了较好的缓释性和稳定性。从而证明了本专利提供的富含功能因子(毛蕊花糖苷)的功能性啤酒制备方法适用于包括淡色、深色、艾尔、拉格、精酿等各种常见类型的啤酒产品，具有较好的产业意义。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例和对比例。显然，本发明不限于以上实施例和对比例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联系到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种啤酒花多糖纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将壳聚糖溶于醋酸溶液中，并调节pH至3～5，制得壳聚糖-醋酸溶液；

(2)将啤酒花多糖溶于水中，调节pH与壳聚糖-醋酸溶液一致，制得啤酒花多糖溶液；所述啤酒花多糖由啤酒花萃余物经水提醇沉法制备得到，纯度≥90％，分子量在20～50kDa，其中水提法提取条件为：料液比为1:5～1:20，萃取温度为40～80℃，萃取时间为2～8h；

(3)将待包埋的功能因子溶于溶剂中制得功能因子溶液；

(4)在搅拌条件下，将功能因子溶液滴加入壳聚糖-醋酸溶液中，再滴加啤酒花多糖溶液，控制壳聚糖与啤酒花多糖的质量比为2:1～1:2，制得含有壳聚糖-啤酒花多糖包埋功能因子纳米粒子的混合液；

(5)从混合液中分离得到所述的啤酒花多糖纳米粒子。

2.如权利要求1所述的啤酒花多糖纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，醋酸溶液的体积百分比浓度为0.6～1.2％，壳聚糖-醋酸溶液中壳聚糖的质量百分比浓度为0.1～0.5％，所述壳聚糖的分子量为100～500kDa，去乙酰度为90％～95％。

3.如权利要求1所述的啤酒花多糖纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，啤酒花多糖溶液中啤酒花多糖的质量百分比浓度为0.1～0.5％。

4.如权利要求3所述的啤酒花多糖纳米粒子的制备方法，其特征在于，啤酒花多糖的制备方法包括：1)取啤酒花萃余物，利用水提法提取粗多糖；2)收集提取液，旋蒸浓缩，再加入乙醇，调节溶液中乙醇浓度达40～80％，静置后过滤，收集沉淀，洗涤，干燥得到粗品；3)将粗品溶于蒸馏水，进行脱色、脱蛋白处理，再经醇析、洗涤、冻干，得精制品；4)将精制品溶于蒸馏水，经DEAE-纤维柱层析，收集分子量在20～50kDa的多糖物质溶液，旋蒸浓缩后透析，再经醇析、洗涤、冻干后即得所述啤酒花多糖。

5.如权利要求1所述的啤酒花多糖纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的功能因子为黄腐酚、苯乙醇苷、豆甾醇、大麻二酚、白藜芦醇、芦丁、麦角甾醇中的一种或几种。

6.如权利要求1所述的啤酒花多糖纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，搅拌条件为：搅拌转速为1000～3000rpm，反应温度为15～35℃。

7.一种由权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的啤酒花多糖纳米粒子。

8.如权利要求7所述的啤酒花多糖纳米粒子在制备功能性啤酒中的应用，其特征在于，在啤酒生产过程中，按照0.01～5g/L向啤酒中添加所述的啤酒花多糖纳米粒子，该功能性啤酒中功能因子含量为0.1～1000mg/L。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，啤酒花多糖纳米粒子按照0.1～1g/L向啤酒中添加。

10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，在啤酒生产过程中的过滤或清酒阶段添加啤酒花多糖纳米粒子。

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