WO2022220163A1 - 化合物、ミトコンドリア染色剤およびミトコンドリアの蛍光染色方法 - Google Patents

化合物、ミトコンドリア染色剤およびミトコンドリアの蛍光染色方法 Download PDF

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cells
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純子 坂神
憲太郎 大橋
茂雄 高島
美和 前田
洋 竹森
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株式会社ニコン
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    • C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution

Definitions

  • the present invention relates to a compound, a mitochondrial stain, and a fluorescent staining method for mitochondria.
  • Mitochondria are intracellular organelles used by eukaryotic cells to synthesize ATP, a bioenergy, using oxygen. Therefore, mitochondrial dysfunction is directly linked to cell death and the like, causing various diseases (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2019-112338). In addition, since mitochondrial dysfunction is also associated with mitochondrial morphology, observation of mitochondrial morphology is an important indicator when examining cell states and functions. Therefore, methods using various fluorescent low-molecular-weight compounds and fluorescent proteins have been developed for morphological observation of mitochondria (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2020-098199; Japanese Patent Application Laid-Open No. 2017-48268).
  • fluorescent low-molecular-weight compounds in mitochondria is simple and has the advantage of being able to stain all cells, whereas the use of fluorescent proteins requires manipulations such as genetic recombination and introduction of expression vectors into cells. It is complicated because On the other hand, when mitochondria are labeled with a fluorescent low-molecular-weight compound, the fluorescent low-molecular-weight compound binds to the mitochondrial lipid membrane, resulting in unstable localization of the fluorescent low-molecular-weight compound on the mitochondrial membrane.
  • the emission wavelength of fluorescence from fluorescent small-molecular-weight compounds can be a problem. .
  • An object of the present invention is to provide a novel mitochondrial stain and a fluorescent staining method for mitochondria.
  • Embodiments according to the present invention are as follows. [1] A compound represented by the following formula (I) or a salt thereof.
  • R 1 is hydrogen, C1-C6 alkyl, —NH2, —OR 3 , —COOH, —CONH 2 , —COONH 2 , —N ⁇ C ⁇ O, or —N ⁇ C ⁇ S
  • R 3 is hydrogen or C1-C6 alkyl.
  • a method for staining mitochondria comprising the step of fluorescently staining mitochondria using the compound or salt thereof according to any one of [1] to [4].
  • a method for detecting cells that have undergone autophagy comprising: A step of fluorescently staining the mitochondria of the cells to be examined with the compound according to any one of [1] to [4]; a step of observing the fluorescently stained mitochondria; A method of detection, including [12] A step of fluorescently staining mitochondria using the compound or salt thereof according to any one of [1] to [4]; identifying cells having the fluorescently stained mitochondria; A method of identifying a cell, comprising: [13] A first cell having mitochondria fluorescently stained with the compound or salt thereof according to any one of [1] to [4] and any compound of [1] to [4]
  • a method of distinguishing a first cell from a cell population comprising a second cell having mitochondria that are not fluorescently stained comprising: A method for identifying cells, comprising the step of identifying cells having the fluorescently stained
  • a second step of obtaining information on the one or more mitochondria from the cell image When, a second step of obtaining information on the one or more mitochondria from the cell image; and a third step of evaluating the state of health of the cells based on the obtained information on the one or more mitochondria.
  • a method for analyzing cell images including [18]
  • the fluorescence image of the cell is a microscope image
  • the information of the one or more mitochondria is the area, length, width, aspect ratio, circularity, Elongation, Shape Factor, Roughness, and relationship with adjacent mitochondria of the one or more mitochondria.
  • the health of the cells is evaluated based on the statistics.
  • the analysis method according to the item. [19] In the first step, the fluorescence image of the cell is a microscope image, In the second step, the information of the one or more mitochondria is the occupancy rate of the area where the two or more mitochondria are aggregated at a predetermined density or higher in the cell, with respect to the area of the cell, In a third step, the health of the cells is evaluated based on the occupancy. [17] The analysis method according to the item.
  • the area in which two or more mitochondria fluorescently stained in the second cell are aggregated at a predetermined density or higher in the second cell, relative to the area of the second cell The analysis method according to item [19] or [21], wherein the health condition of the cells is evaluated by comparing with the occupancy rate. [24] The analysis method according to [22] or [23], wherein the second cells are normal cells.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a microscope apparatus used in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a flow chart of computer controlled operation of a microscope apparatus for use in an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 shows a flow chart of a method for analyzing images of cells stained for mitochondria in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 shows images observed with a fluorescence microscope when mitochondria were labeled with compound 3 (compound (II)) (FIG. 4A) or compound 4 (compound (III)) (FIG. 4B) in Example 3.
  • FIG. 5 shows images observed with a fluorescence microscope when mitochondria were labeled with compound 4, fixed, and triple-stained with COX4-Alexa488 and DAPI in Example 4.
  • FIG. 5A is an image of compound 4 fluorescence
  • FIG. 5B is Alexa488 fluorescence
  • FIG. 5C is a superimposed image of compound 4 fluorescence, Alexa488 fluorescence, and DAPI fluorescence.
  • FIG. 5D is a bright field image.
  • 10 is an image observed with a fluorescence microscope showing the results of Example 5.
  • FIG. 6A is stained with compound 4
  • FIG. 6B is stained with compound 4 and then treated with mitochondrial uncoupler
  • FIG. 6C is stained with mitochondrial uncoupler first and then stained with compound 4.
  • FIG. 10 is an image observed with a fluorescence microscope showing the results of Example 6.
  • FIG. The figure at the top of the image is a schematic diagram showing the dyeing process.
  • FIG. 7A is a brightfield image of where cells are present.
  • FIG. 7B is an observation image of fluorescence emitted by Compound 4 (denoted as Chemical Compound 4 in the figure).
  • FIG. 7C is an image in which the bright field image and the fluorescence image are superimposed.
  • 10 is an image observed with a fluorescence microscope showing the results of Example 7.
  • FIG. 8A is an observation image of fluorescence emitted by Compound 4.
  • FIG. FIG. 8B is an observation image of fluorescence staining using the LC3B antibody.
  • FIG. 8C is a superimposed image of fluorescence from compound 4, fluorescence staining with the LC3B antibody, and fluorescence from DAPI.
  • FIG. 8D is a bright field image.
  • FIG. 10 is an image observed with a fluorescence microscope showing the results of Example 8.
  • FIG. 9A is an observation image of fluorescence emitted by compound 1.
  • FIG. 9B is an observation image of staining using the LC3B antibody.
  • FIG. 9C is a superimposed image of fluorescence from Compound 1, fluorescence staining with the LC3B antibody, and fluorescence from DAPI.
  • FIG. 9D is a bright field image.
  • 10 is an image observed with a fluorescence microscope showing the results of Example 9.
  • FIG. 10A is a brightfield image.
  • 10B is an observation image of fluorescence emitted by compound 3.
  • FIG. 11 shows an image (A) of HeLa cells stained with compound (III) in Example 9, and an image (B) in which a region in which luminance values are continuously distributed at high levels is detected. It is a diagram showing.
  • FIG. 12 shows an image of normal mesenchymal stem cells stained with compound (III) in Example 9 (A), and an image (B) of a region in which mitochondria have a predetermined density or higher. , and an image (C) in which a region in which whole cells are present is detected.
  • FIG. 13 shows an image (A) obtained by imaging aged mesenchymal stem cells stained with compound (III) in Example 9, and an image (B) obtained by detecting a region in which mitochondria have a predetermined density or more. , and an image (C) in which a region in which whole cells are present is detected.
  • a compound according to one embodiment disclosed in the present specification is a compound represented by the following formula (I) or a salt thereof (in this specification, a compound represented by the following formula (I) or a salt thereof).
  • the salt is called compound (I)).
  • R 1 is hydrogen, C1-C6 alkyl, —NH2, —OR 3 , —COOH, —CONH 2 , —COONH 2 , —N ⁇ C ⁇ O, or —N ⁇ C ⁇ S
  • R 3 is hydrogen or C1-C6 alkyl.
  • formula (II) or (III) represented by formula (II) or (III) below .
  • compound (I) When compound (I) is irradiated with excitation light of 520 nm to 590 nm, it emits fluorescence of 590 nm to 660 nm.
  • Compound (I) can be easily produced by referring to the method described in the Examples and appropriately modifying it using common general technical knowledge.
  • a solvent for the dye is not particularly limited as long as it can dissolve the above compound, and examples thereof include acetone, DMSO, ethanol, acetonitrile, and aqueous solutions thereof.
  • the mitochondrial stain may contain, for example, a fluorescent compound for fluorescently staining mitochondria and cellular constituents different from mitochondria, such as cell membranes and intracellular organelles. This allows multiple elements to be dyed simultaneously. Further, the interaction between the compound (I) and the fluorescent compound can sensitize the luminescence of the compound (I) and improve the specificity of the compound (I) to mitochondria. Examples of fluorescent compounds that sensitize the emission of compound (I) include (Mito Tracker), and examples of fluorescent compounds that improve the specificity of compound (I) include (DAPI: 4,6-Diamidino- 2-phenylindole, dihydrochloride), etc.
  • Staining of mitochondria using the mitochondrial staining agent disclosed herein can be performed by a routine method for those skilled in the art.
  • compound (I) when staining mitochondria in cultured cells, compound (I) may be added to the medium during culture.
  • concentration of compound (I) is not particularly limited, it is preferably 0.001 ⁇ M to 10 ⁇ M, more preferably 0.01 ⁇ M to 0.1 ⁇ M.
  • the dyeing time is also not particularly limited, but is preferably from (1 minute) to (1 week), more preferably from (5 minutes) to (1 hour).
  • the dyeing temperature is not particularly limited, it is preferably (10°C) to (45°C), more preferably (30°C) to (40°C).
  • the dyeing time is preferably longer, and specific examples include conditions such as (37)° C. and (15) minutes.
  • the medium may be removed and the cells may be washed, or may proceed to the next step without washing.
  • a cell culture medium, a phosphate buffer, or the like can be used as a washing solution.
  • the cleaning liquid may contain a surfactant.
  • the cultured cells may be collected, centrifuged, the supernatant removed, suspended in a buffer or medium, and compound (I) added to the cell suspension. .
  • the staining conditions are the same as above. After staining, the cells may be seeded on a plate or a slide glass, or may proceed to the next step while being suspended.
  • the cells are irradiated with light of the excitation wavelength, and the fluorescence emitted from the staining agent is detected to detect the mitochondria in the cells.
  • irradiation means similar to those used for general fluorescence detection may be used.
  • a predetermined wavelength may be selected from a laser light source provided in a fluorescence microscope, if necessary. Fluorescence may be detected from the lens barrel of the fluorescence microscope, or an image captured by a camera or the like installed in the fluorescence microscope may be displayed on display means such as a monitor.
  • a filter that selectively passes a predetermined wavelength may be used as needed.
  • Compound (I) can be used as a very convenient cell marking agent.
  • the mitochondria of tumor cells collected from humans are marked with compound (I), transplanted into mice, and fluorescence emission is traced to determine the behavior of tumor cells in the body of mice (e.g., ease of metastasis, etc.). ) can be known.
  • a cell group comprising a first cell having mitochondria fluorescently stained with compound (I) and a second cell having mitochondria not fluorescently stained with compound (I)
  • fluorescence from compound (I) The first cell can be identified by detecting staining and identifying cells with fluorescently labeled mitochondria.
  • substance transfer or information transfer between the first cell and the second cell can be evaluated.
  • a step of fluorescently staining either keratinocytes or melanocytes with compound (I) mixing these melanocytes and keratinocytes, and a cell group containing both, a compound to be tested and compound (I) culturing in the presence of; distinguishing between keratinocytes and melanocytes by fluorescent staining; and examining whether melanosomes have migrated from melanocytes to keratinocytes.
  • the compound to be tested as a cosmetic product.
  • compounds that inhibit the movement of melanosomes from melanocytes to keratinocytes can inhibit the movement of melanin to the body surface, so they can be evaluated as cosmetics with a whitening effect.
  • Compound (I) can also be used as a cell state-evaluating agent.
  • Examples of cell states include cell differentiation stage, apoptosis, hypoxia, cell growth inhibition, growth promotion, and the like.
  • mitochondria have an elongated shape, but when reprogrammed into iPS cells, the mitochondria become fragmented, and when redifferentiated into differentiated cells, the mitochondria assume an elongated shape again. become (Biochem Biophys Res Commun. 2018 vol.500(1) pp.59-64.). Therefore, by fluorescently staining mitochondria with compound (I) and identifying their shape, it is possible to identify the stage of reprogramming or regeneration of cells.
  • the differentiation stage of melanocytes can be evaluated by fluorescently staining mitochondria with compound (I) and observing the intracellular localization of mitochondria.
  • mitophagy a phenomenon known as mitophagy in which surplus mitochondria are selectively degraded when cells undergo autophagy. Therefore, when mitochondria are fluorescently stained with compound (I) and the state of intracellular fluorescent staining is examined, fluorescence is finely scattered in mitophagy-induced cells, and fluorescence signals specific to mitophagy are observed. Therefore, by fluorescently staining mitochondria with compound (I) and observing the fluorescence distribution state, it is possible to identify whether or not the cells are undergoing autophagy.
  • compound (I) strongly binds to mitochondria, compound (I) is as strong as a conventional fluorescent dye, even if it is fixed with a fixative after fluorescent staining with compound (I) or the membrane is permeabilized with a surfactant. ) does not weaken the fluorescence intensity. Moreover, since the peak width of the emitted fluorescence wavelength is narrow (ie, 590 nm to 660 nm), there is little overlap with the fluorescence wavelengths of other fluorescent dyes. From these facts, compound (I) can be suitably used for multiple staining with other fluorescent dyes.
  • the cells after fluorescently staining the mitochondria of cells with compound (I), the cells can be fixed and multi-stained by histochemical techniques using antibodies.
  • the fluorescent dye to be used at the same time may have a wavelength that does not overlap with the fluorescence of compound (I), and examples thereof include FITC, ATTO 488, Alexa Fluor 488, and Cy5.
  • DAPI DAPI
  • mitochondrial morphology and distribution reflect cell health.
  • mitochondrial morphology and distribution such as fragmentation and clustering near the nucleus, reflect cellular health. Therefore, the toxicity of cosmetics or pharmaceuticals can be evaluated by treating cultured cells with cosmetics or pharmaceuticals in advance and fluorescently staining the mitochondria of the cells with compound (I).
  • ⁇ Disease marker> The shape of mitochondria changes according to cell conditions and pathologies. For example, mitochondria are known to curl up when undernourished. Alternatively, cardiovascular diseases, neurological diseases such as Hutchinton's disease, ALS, and diabetes are known to be triggered by abnormal mitochondrial fission/fusion (Japanese Pharmacological Society, Japanese Pharmacological Journal 149: 269-273 ( 2017) “Ecopharma, an Approved Drug Focusing on Mitochondrial Fission”). Therefore, compound (I) can also be used as a diagnostic marker for diseases and the like. For example, a method comprising the steps of collecting biological tissue from a living body, staining the mitochondria of the collected biological tissue with compound (I), and evaluating a disease, using compound (I) as a diagnostic marker. can be used.
  • the cell image analysis method includes a first step of acquiring a cell image by imaging a cell having mitochondria fluorescently stained with the compound disclosed herein or a salt thereof, and from the cell image, A second step of obtaining mitochondrial information and a third step of assessing cell health based on the obtained mitochondrial information. This analysis method allows investigation of the state of cells based on mitochondrial morphology.
  • a cell image is obtained by imaging a cell having one or more mitochondria fluorescently stained with a compound disclosed herein or a salt thereof.
  • This cell image is preferably a microscope image.
  • a microscope image is preferably captured by a camera with an image sensor attached to a microscope including a stereomicroscope and an electron microscope, and obtained as an image file.
  • a single cell may be captured in the cell image, or a plurality of cells may be captured.
  • ⁇ Second step> information on one or more mitochondria present in one cell is obtained from the cell image obtained in the first step.
  • Mitochondrial information refers to numerical values obtained from the mitochondrial image that indicate the characteristics of the mitochondrion, such as area, length, width, aspect ratio, circularity, elongation, shape factor, roughness, shortest distance to adjacent mitochondria.
  • Statistical value obtained by statistically processing at least one of the distance, the number of branching points, the distance from the nucleus, the distance from the cell membrane, and the distance from the cell body, or the number of fluorescently stained mitochondria in the cell It is the occupancy rate in the cell of the area aggregated at a predetermined density or more in the cell.
  • the length of mitochondria is the longest line segment connecting two points on the circumference of mitochondria.
  • the width of mitochondria is the shortest of the lengths of line segments connecting two points on the circumference of mitochondria.
  • the circularity of mitochondria refers to the result of dividing the square of the circumference of a circle having the same area as the mitochondrial region by the square of the circumference of the area.
  • Mitochondrial elongation refers to the ratio of mitochondrial length to width.
  • the shape factor of mitochondria refers to the ratio of the square of the perimeter of a circle having the same area as the mitochondrial region to the square of the perimeter of a shape that fills the unevenness of the mitochondrial region.
  • the shortest distance between a mitochondrion and an adjacent mitochondrion is the shortest length of a line segment connecting a point on the periphery of the mitochondrion and a point on the periphery of the adjacent mitochondrion, or between the center of gravity of the mitochondrion and the distance between the adjacent mitochondria It refers to either of the distances from the center of gravity.
  • the number of branching points of mitochondria refers to the number of branching portions when mitochondria have a branched shape.
  • the distance from the mitochondrial nucleus is the shortest of the lengths of the line segments connecting the points on the circumference of the mitochondria and the points on the circumference of the adjacent mitochondria, or the distance between the centroid of the mitochondria and the centroid of the nucleus.
  • the distance between the mitochondria and the cell membrane is the shortest of the lengths of the line segments connecting the points on the periphery of the mitochondria and the points on the cell membrane.
  • the distance of mitochondria from the cell body refers to the distance between the mitochondria present in the neurite and the connection point between the neurite and the cell body, the centroid of the cell body, or the centroid of the nucleus in nerve cells.
  • the obtained value may be used as is, or statistical processing such as rounding may be performed so that the value is rounded to a predetermined number of digits to calculate the statistic.
  • statistical processing may be performed using the obtained numerical values to calculate the statistic.
  • Examples of statistical processing include obtaining average values, median values, variance values, quartiles, and the like.
  • the occupancy rate of the area of the cell where fluorescently-stained mitochondria are aggregated at a predetermined density or higher in the cell may be obtained. Specifically, for example, first, the area of the cell in which the mitochondria are present is obtained. Next, the area of the region where mitochondria are aggregated at a predetermined density or higher is determined. Finally, the ratio of the area of the mitochondria-aggregated region to the area of the cells is obtained, and this ratio may be used as the occupancy rate.
  • ⁇ Third step> the health condition of the cells is evaluated from the mitochondrial information obtained in the second step.
  • the state of health of cells means that cells are in an abnormal state or in an aged state.
  • Cells are in an abnormal state, e.g. undergoing necrosis, undergoing apoptosis, exhibiting faster or slower than normal proliferation rates, altered cell morphology, differentiation such as mesenchymal-epithelial transdifferentiation It refers to the occurrence of transformations, disruption of the balance between mitochondrial fission and fusion, and accumulation of abnormal proteins.
  • cells age for example, their ability to produce collagen decreases, their proliferation rate slows down, their telomeres shorten, they lose cell-specific or intrinsic functions, and their cytoplasm increases. , multinucleation, or fragmentation of mitochondria.
  • This cellular health state also includes the state of the individual, for example the state of cells in patients with bipolar disorder.
  • two or more mitochondria fluorescently stained in a second cell different from the cell for which the cell image is analyzed are aggregated at a predetermined density or more in the second cell. The health of the cells may be evaluated by comparing the occupancy ratio of the area in which the cells are located to the area of the second cells and the occupancy ratio obtained in the second step.
  • the second cells are preferably cells of the same type as the cells whose cell images are to be analyzed, and are preferably normal cells.
  • normal means not being in an abnormal state as described above. Examples include normal cell morphology, function, and proliferation.
  • ⁇ Fourth step> a bright-field image of the cell from which information on mitochondria was obtained is obtained. Acquired bright-field images can be used, for example, to determine cell area.
  • a fluorescence image of one or more cells containing one or more stained mitochondria is acquired using a fluorescence microscope with an image sensor (S21). Then, shot noise is removed from the captured image (S21). Specifically, shot noise can be removed from the captured image by averaging luminance values or removing high-frequency components in a region of a certain size in the captured image.
  • cell area the cell region in the image (hereinafter referred to as "cell area") is detected (S22).
  • the nucleus is detected by binarizing the fluorescent image of a nuclear staining reagent such as DAPI, and the cell area is detected using the Watershed algorithm for the fluorescent image of cytoplasmic staining using that as a starting point.
  • Mitochondrial fluorescence imaging may be used instead of cytoplasmic staining reagents.
  • a cell area may be detected using a phase contrast image.
  • a close/open filter is applied to the phase contrast image to obtain the difference between the images, acquire edge information, and create a GVF (Gradient Vector Flow) based on the acquired edge information to extract the outline of the cell. It is also good to acquire and detect the cell area.
  • the cell area can be detected by finally obtaining cell contours from the fluorescence image.
  • the Detect Peaks algorithm implemented in NIS Elements software manufactured by Nikon Corporation is used to detect a continuous high brightness value distribution. Detect the area where it is, and further increase the luminance to a high luminance value (S23). As a result, the outline of the filamentous structure is emphasized as the internal structure of each cell.
  • areas where mitochondria are aggregated to a predetermined density or higher within the cell are detected (S26).
  • a binary image from which mitochondria can be identified may be used, but a captured image of cells from which shot noise has been removed may also be used. In the latter case, for example, by calculating the sum of luminance values for each divided region and identifying regions with relatively high luminance values, regions where mitochondria are aggregated may be detected.
  • the area of the cell region detected in S22 and the area of the region where mitochondria are detected in S26 are measured, and the area where mitochondria are aggregated at a predetermined density or more in the cell is compared to the area of the cell.
  • the occupancy rate is calculated (S27).
  • the evaluation method is not particularly limited, for example, the mitochondrial information of the second cell is obtained, the learning device described below is used, and the health state of the cell is evaluated by comparing it with the mitochondrial information of the second cell. You may
  • abnormal or senescent cells or normal cells are used, and one or two or more pieces of information obtained from these cells are mapped to an n-dimensional vector space, and deep learning, support vector machine , decision tree, etc. By inputting information on the target mitochondria into this learning machine, it is possible to determine whether abnormalities or aging have occurred.
  • FIG. 1 An example of a microscope apparatus used in the analysis method of the present disclosure will be described below with reference to FIGS. 1 and 2.
  • FIG. 1 An example of a microscope apparatus used in the analysis method of the present disclosure will be described below with reference to FIGS. 1 and 2.
  • FIG. 1 An example of a microscope apparatus used in the analysis method of the present disclosure will be described below with reference to FIGS. 1 and 2.
  • FIG. 1 An example of a microscope apparatus used in the analysis method of the present disclosure will be described below with reference to FIGS. 1 and 2.
  • the microscope apparatus 1 includes an apparatus main body 10, a computer 170, a monitor 160 that is a display section, and an input device 180.
  • the device body 10 includes a microscope section 150 , a transmitted illumination section 40 , an imaging device (hereinafter referred to as a digital camera) 300 , an excitation light source 70 and an optical fiber 7 .
  • digital cameras include CCD cameras and CMOS cameras.
  • the microscope section 150 includes a stage 23, an objective lens section 27, a fluorescence filter section 34, an imaging lens section 38, a deflection mirror 452, a field lens 411, and a collector lens 41. , a light source 47 for transmitted illumination, a field lens 44 and a deflection mirror 45 .
  • a chamber 100 containing a transparent culture container 20 is mounted on the stage 23 .
  • cultured cells whose mitochondria are labeled with a fluorescent substance grow in a medium.
  • a portion a of the bottom surface of the chamber 100 and a portion b of the top surface of the chamber 100 are transparent.
  • the top surface of the culture container 20 is open will be described, but the top surface of the culture container 20 may be covered with a lid of the same quality as the culture container 20 if necessary.
  • a plurality of types of objective lenses are attached to the objective lens section 27 along the X direction in FIG.
  • the type of objective lens is switched. This switching is performed under the control of computer 170 .
  • a plurality of types of filter blocks are attached to the fluorescence filter section 34 along the X direction in FIG.
  • the type of filter block is switched. This switching is also performed under the control of the computer 170 .
  • the computer 170 switches the combination of the type of objective lens arranged in the optical path and the type of filter block arranged in the optical path according to the observation method to be set in the apparatus main body 10 .
  • the observation method by the apparatus main body 10 is switched between phase contrast observation and two types of fluorescence observation by this switching.
  • Phase contrast observation and fluorescence observation differ in the type of filter block placed in the optical path and the type of objective lens that can be placed in the optical path. are different, and the types of objective lenses that can be placed in the optical path are the same.
  • the illumination method differs between phase contrast observation and fluorescence observation.
  • the computer 170 uses the transmitted illumination light source 47 to use the optical path of the transmitted illumination unit 40 during phase contrast observation, and uses the optical path of the epi-illumination unit (that is, the excitation light source 70, the optical fiber 7, the collector An optical path passing through the lens 41, the field lens 411, the deflection mirror 452, the fluorescence filter section 34, and the objective lens section 27 in that order) is used, so the excitation light source 70 is used.
  • the excitation light source 70 is turned off when the transmitted illumination light source 47 is used, and the transmitted illumination light source 47 is turned off when the excitation light source 70 is used.
  • phase contrast observation which is bright field observation
  • the light emitted from the transmission illumination light source 47 illuminates the observation point c in the culture vessel 20 via the field lens 44, the deflection mirror 45, and the transparent portion b of the chamber 100. do.
  • the light transmitted through the observation point c reaches the light receiving surface of the digital camera 300 via the bottom surface of the culture container 20, the transparent portion a of the chamber 100, the objective lens portion 27, the fluorescence filter portion 34, and the imaging lens 38, and is observed.
  • a phase contrast image of point c When the digital camera 300 operates in this state, a phase contrast image is captured and phase contrast image data is generated. This image data is transmitted to computer 170 and stored there.
  • the bright-field image obtained by bright-field observation includes images obtained by bright-field observation other than fluorescence observation, such as images obtained by dark-field observation, phase contrast observation, and differential interference observation.
  • the light emitted from the excitation light source 70 passes through the optical fiber 7, the collector lens 41, the field lens 411, the deflection mirror 452, the fluorescence filter section 34, the objective lens section 27, the transparent section a of the chamber 100, the culture vessel.
  • Observation point c in culture vessel 20 is illuminated through the bottom surface of 20 .
  • This fluorescence reaches the light-receiving surface of the digital camera 130 via the bottom surface of the culture container 20, the transparent portion a of the chamber 100, the objective lens portion 27, the fluorescence filter portion 34, and the imaging lens 38, and a fluorescence image at the observation point c is obtained.
  • a fluorescence image is captured and image data is generated. This image data is also transmitted to computer 170 and stored there.
  • the computer 170 controls the XYZ coordinate position of the observation point c in the culture container 20 by controlling the XY coordinates of the stage 23 and the Z coordinate of the objective lens unit 27 .
  • a humidifier may be connected to the chamber 100 via a silicone tube, and the humidity and CO2 concentration inside the chamber 100 may be controlled to predetermined values.
  • the air around the chamber 100 may be appropriately circulated by a heat exchanger, thereby controlling the internal temperature of the chamber 100 to a predetermined value.
  • Humidity, CO2 concentration, and temperature inside such chamber 100 may be measured by sensors. The measurement results may be transmitted to computer 170 and stored there.
  • the digital camera 300 may be housed in a housing separate from the other parts of the device main body 10 and maintained at the same temperature as the outside air temperature of the device main body 10 regardless of the internal temperature of the chamber 100 .
  • a program for observation is installed in the computer 170, and the computer 170 operates according to the program. Any information input from the user to the computer 170 is performed through the input device 180 .
  • FIG. 2 is an operation flowchart of the computer 170.
  • the computer 170 first sets the observation method of the apparatus main body 10 to low-magnification phase-contrast observation, acquires the image data of the bird's-eye view image in this state, and displays it on the monitor 160.
  • S11 A bird's-eye view image refers to an image of a relatively wide area of the culture container 20 .
  • the computer 170 In acquiring the image data of the bird's-view image, the computer 170 repeatedly acquires the image data of the phase-contrast image while moving the observation point c in the culture container 20 in the XY directions. composited with the image data of the image of Each piece of image data is image data of a so-called tile image, and image data after combining is image data of a bird's-eye view image.
  • the user While observing the bird view image displayed on the monitor 160, the user determines the conditions for time-lapse photography (for example, interval, number of rounds, observation point, observation method, etc.).
  • the computer 170 When the user inputs the conditions (S12: YES), the computer 170 creates a recipe in which the conditions are written (S13).
  • the storage destination of the recipe is, for example, the hard disk of the computer 170 .
  • the interval, the number of rounds, the observation point, and the observation method written in the recipe will be referred to as "designated interval,” “designated number of rounds,” “designated point,” and “designated observation method,” respectively.
  • the computer 170 receives an instruction to start time-lapse photography from the user (S14), the computer 170 starts time-lapse photography (S15).
  • the computer 170 matches the observation point c of the culture container 20 with the designated point, sets the observation method of the apparatus main body 10 to the designated observation method, and acquires image data in this state.
  • three designated observation methods three types of image data are continuously acquired while switching the observation method of the device main body 10 among the three designated observation methods. This completes the shooting of the first round.
  • the computer 170 waits for a specified interval from the first round shooting start time, and starts shooting the second round.
  • the imaging method for the second round is the same as the imaging method for the first round.
  • the computer 170 sequentially accumulates the image data captured from the apparatus main body 10 in the execution progress file.
  • the storage destination of this implementation progress file is, for example, the hard disk of the computer 170 .
  • the computer 170 refers to the contents of the implementation progress file at that point in time, and based on that, displays the implementation progress confirmation screen described below. is displayed on the monitor 160 .
  • the captured image of each cell in the bird's-eye view image acquired by the microscope apparatus 1 is input to the image processing unit of the computer 170, where the above-described image analysis processing is performed, and the analysis result is output. good.
  • Example 3 Fluorescent Staining of Mitochondria in Live Cells Using compound (II) and compound (III) synthesized in Examples 1 and 2, intracellular mitochondria were fluorescently stained. The procedure is shown below.
  • FIG. 4A is an image of whole cells by compound (II).
  • FIG. 4B is a whole-cell image with compound (III).
  • compound (II) and compound (III) fluorescently stained mitochondria having linear structures in cells.
  • compound (II) and compound (III) can stain intracellular mitochondria.
  • Example 4 Triple staining with DAPI and anti-COX4 antibody
  • intracellular mitochondria were fluorescently stained with compound (III) synthesized in Example 2, fixed, and further stained with DAPI and mitochondrial markers. Cells were stained with an antibody against COX4. The procedure is shown below.
  • HEK293A cells obtained from Thermofisher were seeded in a glass bottom dish (Matsunami) and cultured for 24 hours.
  • the medium used was Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose (D6046 (Merck)) added with 1 ⁇ penicillin/streptomyne (26252-94 (Nacalai Techs)) and 10% fetal bovine serum (Nichirei). . Cultivation was performed at 37° C., 5% CO 2 .
  • Compound (III) was added to the medium to a final concentration of 0.01 ⁇ M.
  • FIG. 5A is a fluorescence microscope image of whole cells by compound (III).
  • FIG. 5B is the accumulation site of the anti-COX4 antibody.
  • FIG. 5C is a superimposition of FIGS. 5A, 5B and the fluorescence image of the nucleus (DAPI).
  • FIG. 5D is a bright-field image of the whole cell. Fluorescence was emitted from compound (III) and antibody bound to COX4, as shown in FIGS. 5A and B, and fluorescence from compound (III) and antibody bound to COX4, as shown in FIG. 5C. fluorescence was superimposed.
  • compound (III) can be fixed after staining and subjected to multiple staining with DAPI and antibodies.
  • Example 5 Dependence of fluorescent staining on mitochondrial membrane potential
  • the mitochondrial membrane has a stronger membrane potential than the membranes of other intracellular organs, and most of the compounds with mitochondrial accumulation are dependent on the mitochondrial membrane potential. Localized in mitochondria.
  • This example shows that staining of mitochondria by compound (III) is dependent on membrane potential and that once stained, staining remains even with loss of membrane potential. The procedure is shown below, but the details of staining mitochondria with compound (III) are the same as in Example 4.
  • FIG. 6A is an image of fluorescence emitted by treatment with compound (III) alone.
  • FIG. 6B is an image after FCCP treatment after treatment with compound (III).
  • FIG. 6C is an image of compound (III) treatment after FCCP treatment.
  • Example 6 Selection of multiple types of cells by fluorescent staining of mitochondria
  • transfer of substances between two types of cells was evaluated by fluorescent staining of mitochondria using compound (III).
  • Compound (III) was used to stain the mitochondria of human keratinocyte PSVK1 cells to distinguish which were keratinocytes when assessing melanosome transport from mouse melanoma B16F10 cells to PSVK1 cells. The procedure is shown below, but the details of staining mitochondria with compound (III) are the same as in Example 4.
  • 1 ⁇ 10 4 PSVK1 cells obtained from National Institute of Biomedical Innovation, Health and Nutrition
  • Keratinocyte Growth Medium 2 Kit C-20111 (TAKARA Bio)
  • Compound (III) was added to a final concentration of 0.01 ⁇ M and incubated for 5 minutes.
  • FIG. 7A is a bright field image showing the coexistence of B16F10 cells and PSVK1 cells.
  • the black grains that are vesicles are melanosomes.
  • FIG. 7B is a fluorescence image detecting cells stained with compound (III), and the three cells in the central portion are identified as PSVK1 cells.
  • FIG. 7C is a superimposed image of FIGS. 7A and 7B.
  • fluorescence staining of mitochondria using compound (III) enables selection of multiple types of cells, which can be used to evaluate interactions between cells.
  • Example 7 Detection of mitophagy
  • mitophagy was detected by staining mitochondria with compound (III).
  • HEK293A cells were seeded in a glass bottom dish and cultured for 24 hours.
  • the medium used was Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose (D6046 (Merck)) added with 1 ⁇ penicillin/streptomyne (26252-94 (Nacalai Techs)) and 10% fetal bovine serum (Nichirei). .
  • Cultivation was performed at 37° C., 5% CO 2 .
  • Compound (III) was added to a final concentration of 0.01 ⁇ M.
  • FIG. 8A is a fluorescence image of fluorescence staining with compound (III).
  • FIG. 8B is a fluorescence image of fluorescent staining with the LC3B antibody.
  • FIG. 8C is an image obtained by superimposing the nuclear staining with DAPI on FIGS. 8A and 8B.
  • FIG. 8D is a bright field image.
  • FIG. 9A is a fluorescent image of staining with compound (III).
  • FIG. 9B is a fluorescent image of staining with the LC3B antibody.
  • FIG. 9C is an image obtained by superimposing the nuclear staining with DAPI on FIGS. 9A and 9B.
  • FIG. 9D is a bright field image.
  • Example 8 Method for evaluating the differentiation stage of melanocytes As the differentiation stage of melanocytes progresses, melanosomes increase and mitochondria are localized near the nucleus.
  • compound (II) was used to assess the differentiation stage of melanocyte B16F10 cells by mitochondrial localization. The procedure is shown below.
  • B16F10 cells were seeded in a glass bottom dish and cultured for 24 hours.
  • the medium used was Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose (D6046 (Merck)) added with 1 ⁇ penicillin/streptomyne (26252-94 (Nacalai Techs)) and 10% fetal bovine serum (Nichirei). .
  • Cultivation was performed at 37° C., 5% CO 2 .
  • Compound (II) was added to a final concentration of 0.01 ⁇ M.
  • the medium was removed by aspiration and replaced with new medium, followed by microscopic observation.
  • FIG. 10A A bright-field image is shown in FIG. 10A. Black grains are melanosomes.
  • FIG. 10B is a fluorescence image of mitochondria stained with compound (II). Mitochondria were localized in the vicinity of the nucleus in B16F10 cells, which advanced in the differentiation stage and contained many melanosomes. On the other hand, B16F10 cells with low differentiation stage and few melanosomes had mitochondria at the cell ends.
  • compound (II) can be used to evaluate the differentiation stage of melanocytes.
  • Example 9 Image analysis (1) Detection of mitochondria HeLa cells were stained in the same manner as in Example 3 using compound (III). Using the Detect Peaks algorithm implemented in NIS Elements software manufactured by Nikon Corporation, based on the brightness value information for the image (Fig. 11A) of the stained cells captured using a confocal microscope. , a region where luminance values are continuously distributed at high levels was detected (FIG. 11B). The image was binarized to obtain the image shown in FIG. 11C.
  • the shape of mitochondria can be automatically and clearly detected from images of cells stained with mitochondria.
  • the ratio of the area of mitochondria with a predetermined density or higher to the total area of the cell has decreased.
  • the present invention can provide a novel mitochondrial staining agent and a fluorescent staining method for mitochondria.

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Abstract

【課題】本発明によって、細胞内および／または細胞外の小胞に特異的に結合する新たな化合物、ミトコンドリア染色剤およびミトコンドリアの蛍光染色方法を提供する。本化合物は、下記式（１）で表される化合物である。（式（１）中、Ｒ1、Ｒ２のどちらか一方は、イソシアネートまたはイソチオシアネートであり、一方がイソシアネートまたはイソチオシアネートであれば、他方はＨ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＯＯＨ、カルボキシアミンでも良い。）

Description

化合物、ミトコンドリア染色剤およびミトコンドリアの蛍光染色方法
　本発明は、化合物、ミトコンドリア染色剤およびミトコンドリアの蛍光染色方法に関する。
　ミトコンドリアは、真核細胞が酸素を利用して生体エネルギーであるＡＴＰを合成するための細胞内小器官である。そのため、ミトコンドリア機能不全は細胞死などに直結し、様々な疾患を引き起こす（特開２０１９－１１２３３８号公報）。また、ミトコンドリア機能不全はミトコンドリアの形態とも関連していることから、ミトコンドリアの形態観察は細胞の状態や機能を調べる際に重要な指標となる。そこで、ミトコンドリアの形態観察のため、様々な蛍光低分子化合物や蛍光タンパク質を用いた方法が開発されている（特開２０２０－０９８１９９号公報；特開２０１７－４８２６８号公報）。
　ミトコンドリアにおける蛍光低分子化合物の使用は、簡便で、全ての細胞を染色できる利点があるのに対して、蛍光タンパク質の使用は、遺伝子組換えや細胞内への発現ベクター導入などの操作が必要になるため煩雑である。一方、ミトコンドリアを蛍光低分子化合物で標識する際には、蛍光低分子化合物がミトコンドリア脂質膜に結合するため、蛍光低分子化合物のミトコンドリア膜における局在が不安定であるという問題がある。この問題は、蛍光抗体法などの他の染色方法との併用時に、細胞の固定剤や抗体などの細胞膜透過性をあげるための界面活性剤による処理によって、ミトコンドリア膜が破壊され、蛍光低分子化合物がミトコンドリア膜から脱落することが主な原因である。
　また、蛍光低分子化合物による蛍光の放出波長が問題となることがあり、例えば多重染色において他の標的因子または標的細胞内小器官に由来する放出波長が重なると、ミトコンドリアを特異的に検出できなくなる。
　本発明は、新規なミトコンドリア染色剤およびミトコンドリアの蛍光染色方法を提供することを課題とする。
　本発明にかかる実施態様は以下の通りである。
［１］下記式（Ｉ）で表される化合物、またはその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式中、
　Ｒ１が、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＯＲ３、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＯＮＨ２、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、もしくは－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであって、Ｒ２が、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、もしくは－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであるか、または
　Ｒ２が、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＯＲ３、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＯＮＨ２、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、もしくは－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであって、Ｒ1が、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、もしくは－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであり、
　Ｒ３が、水素またはＣ１～Ｃ６アルキルである。）
［２］Ｒ２が－Ｎ＝Ｃ＝Ｏである、［１］項に記載の化合物、またはその塩。
［３］Ｒ1が－Ｎ＝Ｃ＝Ｏである、［２］項に記載の化合物、またはその塩。
［４］Ｒ1が－ＣＯＮＨ２である、［２］項に記載の化合物、またはその塩。
［５］［１］～［４］項のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を含む、ミトコンドリア染色剤。
［６］［１］～［４］項のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を含む、細胞マーキング剤。
［７］［１］～［４］項のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を含む、細胞状態評価剤。
［８］細胞のオートファジーを検出するための薬剤であって、
　［１］～［４］項のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を含む薬剤。
［９］生細胞を死細胞から識別するための薬剤であって、
［１］～［４］項のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を含む薬剤。
［１０］［１］～［４］項のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を用いて、ミトコンドリアを蛍光染色する工程を含む、ミトコンドリアの染色方法。
［１１］オートファジーを起こした細胞の検出方法であって、
　検査対象の細胞のミトコンドリアを［１］～［４］項のいずれか一項に記載の化合物によって蛍光染色する工程と、
　蛍光染色された前記ミトコンドリアを観察する工程と、
を含む、検出方法。
［１２］［１］～［４］項のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を用いて、ミトコンドリアを蛍光染色する工程と、
　蛍光染色された前記ミトコンドリアを有する細胞を特定する工程と、
を含む、細胞の特定方法。
［１３］［１］～［４］項のいずれか一項に記載の化合物またはその塩によって蛍光染色されたミトコンドリアを有する第１の細胞と、［１］～［４］項のいずれの化合物によっても蛍光染色されていないミトコンドリアを有する第２の細胞を含む細胞群から、第１の細胞を識別する方法であって、
　前記細胞群において、蛍光染色された前記ミトコンドリアを有する細胞を特定する工程を含む、細胞の識別方法。
［１４］［１］～［４］項のいずれか一項に記載の化合物またはその塩によって蛍光染色されたミトコンドリアを有する第１の細胞と、［１］～［４］項のいずれの化合物によっても蛍光染色されていないミトコンドリアを有する第２の細胞を含む細胞群において、前記蛍光染色によって第１の細胞と第２の細胞とを識別する工程と、
　第１の細胞と第２の細胞との間の物質伝達または情報伝達を評価する工程と、
を含む、方法。
［１５］化粧品として、検査対象の化合物を評価する方法であって、
　in vitroにおいて、［１］～［４］項のいずれか一項に記載の化合物またはその塩によって、ケラチノサイトまたはメラノサイトのどちらか一方を蛍光染色する工程と、
　前記メラノサイト及び前記ケラチノサイトを含む細胞群を前記検査対象の化合物の存在下で培養する工程と、
　前記蛍光染色によって、前記ケラチノサイトと前記メラノサイトとを識別する工程と、　前記メラノサイトから前記ケラチノサイトへメラノソームが移動したかどうかを調べる工程と、
　前記メラノソームの移動に変化をもたらす前記検査対象の化合物を化粧品として評価する工程と、
を含む、方法。
［１６］腫瘍細胞をヒト以外の動物の体内で特定する方法であって、
　in vitroにおいて、［１］～［４］項のいずれか一項に記載の化合物またはその塩によって、前記腫瘍細胞を蛍光染色する工程と、
　蛍光染色した前記腫瘍細胞を前記動物に移植する工程と、
　前記動物体内で、前記蛍光染色した前記腫瘍細胞を特定する工程と、
を含む、方法。
［１７］［１］～［４］項のいずれか一項に記載の化合物またはその塩によって蛍光染色された１または２以上のミトコンドリアを有する細胞を撮像して細胞画像を取得する第１の工程と、
　前記細胞画像から、前記１または２以上のミトコンドリアの情報を得る第２の工程と、　得られた前記１または２以上のミトコンドリアの情報に基づき、前記細胞の健康状態を評価する第３の工程と
　を含む細胞画像の解析方法。
［１８］第１の工程において、前記細胞の蛍光画像は顕微鏡画像であって、
　第２の工程において、前記１または２以上のミトコンドリアの情報は、前記１または２以上のミトコンドリアの、面積、長さ、幅、縦横比、円形度、Elongation、Shape Factor、Roughness、隣接ミトコンドリアとの最短距離、Branchingポイント数、核との距離、細胞膜との距離、細胞体からの距離のうち、少なくともいずれか一つの数値を統計処理して得られた統計量であり、
　第３の工程において、前記統計量に基づき、前記細胞の健康状態が評価される、
　［１７］項に記載の解析方法。
［１９］第１の工程において、前記細胞の蛍光画像は顕微鏡画像であって、
　第２の工程において、前記１または２以上のミトコンドリアの情報は、前記２以上のミトコンドリアが前記細胞内において所定の密度以上に凝集している領域の、前記細胞の面積に対する占有率であり、
　第３の工程において、前記占有率に基づき、前記細胞の健康状態が評価される、
　［１７］項に記載の解析方法。
［２０］前記細胞の明視野画像を取得し、前記明視野画像において前記細胞を認識する第４の工程をさらに含む、［１８］項に記載の解析方法。
［２１］前記細胞の明視野画像を取得する第４の工程をさらに含み、
　前記細胞の面積が前記明視野画像より算出される、［１９］項に記載の解析方法。
［２２］第３の工程において、第２の細胞において蛍光染色された１または２以上のミトコンドリアの情報を統計処理して得られた統計量と比較することによって、前記細胞の健康状態が評価される、［１８］または［２０］項に記載の解析方法。
［２３］第３の工程において、第２の細胞において蛍光染色された２以上のミトコンドリアが前記第２の細胞内において所定の密度以上に凝集している領域の、前記第２の細胞の面積に対する占有率と比較することによって、前記細胞の健康状態が評価される、［１９］または［２１］項に記載の解析方法。
［２４］前記第２の細胞が正常細胞である、［２２］または［２３］項に記載の解析方法。
＝＝関連文献とのクロスリファレンス＝＝
　本出願は、２０２１年４月１６日付で出願した日本国特許出願２０２１－０７００２１に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
図１は、本発明の一実施形態において用いる顕微鏡装置の模式図である。 図２は、本発明の一実施形態において用いる顕微鏡装置の、コンピュータによって制御された動作のフローチャートを示す図である。 図３は、本発明の一実施形態において、ミトコンドリアを染色した細胞の画像を解析する方法のフローチャートを示す図である。 図４は、実施例３において、化合物３（化合物（ＩＩ））（図４Ａ）または化合物４（化合物（ＩＩＩ））（図４Ｂ）でミトコンドリアを標識したときの蛍光顕微鏡による観察画像である。 図５は、実施例４において、化合物４でミトコンドリアを標識し、細胞を固定した後、ＣＯＸ４―Ａｌｅｘａ４８８及びＤＡＰＩで３重染色したときの蛍光顕微鏡による観察画像である。図５Ａは化合物４による蛍光、図５ＢはＡｌｅｘａ４８８による蛍光、図５Ｃは化合物４による蛍光、Ａｌｅｘａ４８８による蛍光、及びＤＡＰＩによる蛍光を重ねた画像である。図５Ｄは明視野画像である。 実施例５の結果を示す蛍光顕微鏡による観察画像である。図６Ａは化合物４によって染色した場合、図６Ｂは化合物４によって染色し、その後ミトコンドリア脱共役剤で処理した場合、図６Ｃはミトコンドリア脱共役剤処理を先に行い、その後化合物４によって染色した場合の、蛍光顕微鏡による観察画像である。 実施例６の結果を示す蛍光顕微鏡による観察画像である。画像の上部にある図は、染色工程を示した模式図である。図７Ａは、細胞が存在する場所の明視野画像である。図７Ｂは化合物４（図では化４と記載されている）が放出する蛍光の観察画像である。図７Ｃは、明視野画像と蛍光画像を重ねた画像である。 実施例７の結果を示す蛍光顕微鏡による観察画像である。図８Ａは化合物４が放出する蛍光の観察画像である。図８ＢはＬＣ３Ｂ抗体を用いた蛍光染色の観察画像である。図８Ｃは、化合物４による蛍光、ＬＣ３Ｂ抗体を用いた蛍光染色、及びＤＡＰＩによる蛍光を重ねた画像である。図８Ｄは明視野像である。 実施例８の結果を示す蛍光顕微鏡による観察画像である。図９Ａは化合物１が放出する蛍光の観察画像である。図９ＢはＬＣ３Ｂ抗体を用いた染色の観察画像である。図９Ｃは、化合物１による蛍光、ＬＣ３Ｂ抗体を用いた蛍光染色、及びＤＡＰＩによる蛍光を重ねた画像である。図９Ｄは明視野画像である。 実施例９の結果を示す蛍光顕微鏡による観察画像である。図１０Ａは明視野画像である。図１０Ｂは、化合物３が放出する蛍光の観察画像である。 図１１は、実施例９において、化合物（ＩＩＩ）を用いて染色されたＨｅＬａ細胞を撮像した画像（Ａ）と、輝度値が連続して高く分布している領域を検出した画像（Ｂ）を示した図である。 図１２は、実施例９において、化合物（ＩＩＩ）を用いて染色された正常な間葉系幹細胞を撮像した画像（Ａ）と、ミトコンドリアが所定の密度以上である領域を検出した画像（Ｂ）と、細胞全体が存在する領域を検出した画像（Ｃ）を示す図である。 図１３は、実施例９において、化合物（ＩＩＩ）を用いて染色された老化した間葉系幹細胞を撮像した画像（Ａ）と、ミトコンドリアが所定の密度以上である領域を検出した画像（Ｂ）と、細胞全体が存在する領域を検出した画像（Ｃ）を示す図である。
　本発明の目的、特徴、利点、およびそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態および具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
＝＝化合物＝＝
　本明細書に開示された一実施形態に係る化合物は、下記式（Ｉ）で表される化合物、またはその塩である（本明細書において、下記式（Ｉ）で表される化合物、またはその塩を化合物（Ｉ）と称する）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、
　Ｒ１が、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＯＲ３、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＯＮＨ２、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、もしくは－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであって、Ｒ２が、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、もしくは－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであるか、または
　Ｒ２が、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＯＲ３、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＯＮＨ２、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、もしくは－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであって、Ｒ1が、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、もしくは－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであり、
　Ｒ３が、水素またはＣ１～Ｃ６アルキルである。）
　Ｒ２が－Ｎ＝Ｃ＝Ｏであることが好ましく、下記式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表されるように、Ｒ1が－Ｎ＝Ｃ＝Ｏまたは－ＣＯＮＨ２であることがより好ましい。（本明細書において、以下の化合物を化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＩＩ）と称する。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　化合物（Ｉ）は、５２０ｎｍ～５９０ｎｍの励起光を照射すると、５９０ｎｍ～６６０ｎｍの蛍光を放出する。
　化合物（Ｉ）は、実施例に記載の方法を参照し、適宜技術常識を用いて改変することで、容易に製造することができる。
＝＝ミトコンドリア染色剤およびそれを用いた染色方法＝＝
　化合物（Ｉ）は、ミトコンドリアに結合するため、ミトコンドリアを蛍光染色するための染色剤として利用できる。染色剤のための溶媒は、上記化合物を溶解できるのであれば特に限定されず、アセトン、ＤＭＳＯ、エタノール、アセトニトリルおよびこれらの水溶液が例示できる。
　ミトコンドリア染色剤は、化合物（Ｉ）の他に、例えば、ミトコンドリア、及び細胞膜や細胞内小器官等のミトコンドリアと異なる細胞構成要素を蛍光染色するための蛍光化合物を含んでもよい。それによって複数の要素を同時に染色できる。また、化合物（Ｉ）と蛍光化合物の相互作用により、化合物（Ｉ）の発光を増感させることや化合物（Ｉ）のミトコンドリアへの特異性を向上させることができる。化合物（Ｉ）の発光を増感させる蛍光化合物の例として、（Ｍｉｔｏ　Ｔｒａｃｋｅｒ）などが挙げられ、化合物（Ｉ）の特異性を向上させる蛍光化合物の例として、（ＤＡＰＩ：4,6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride）などが挙げられる。
　本明細書に開示のミトコンドリア染色剤を用いた、ミトコンドリアの染色は、当業者にルーティンな方法で行うことができる。例えば、培養細胞のミトコンドリアを染色する場合、培養中の培地に化合物（Ｉ）を添加してもよい。化合物（Ｉ）の濃度は特に限定されないが、０．００１μＭ～１０μＭが好ましく、０．０１μＭ～０．１μＭがより好ましい。染色時間も特に限定されないが、（１分）～（１週間）が好ましく、（５分）～（１時間）がより好ましい。染色温度も特に限定されないが、（１０℃）～（４５℃）が好ましく、（３０℃）～（４０℃）がより好ましい。染色温度が低いほど、染色時間を長くするのが好ましく、具体的には、（３７）℃、（１５）分などの条件が例示できる。その後、培地を除去し、細胞を洗浄してもよく、洗浄しないで次の工程に進んでもよい。洗浄する場合、洗浄液として、細胞培養用培地やリン酸バッファーなどを用いることができる。洗浄液には、界面活性剤が含まれていてもよい。
　あるいは、培養細胞のミトコンドリアを染色するのに、培養細胞を回収し、遠心した後に上清を除去し、バッファーや培地に懸濁し、その細胞懸濁液に化合物（Ｉ）を添加してもよい。染色条件は、上記と同様である。染色後、プレートやスライドグラスに播種してもよく、懸濁したままで次の工程に進んでもよい。
　ミトコンドリアを蛍光染色した後、細胞に励起波長の光を照射し、染色剤から放出される蛍光を検出することで、細胞内のミトコンドリアを検出することができる。励起光の照射には、一般的な蛍光検出と同様の照射手段を用いればよく、例えば、蛍光顕微鏡が備えるレーザー光源から、必要に応じて所定の波長を選択すればよい。蛍光の検出は、蛍光顕微鏡の鏡筒から行ってもよいし、蛍光顕微鏡に設置されたカメラ等が撮影した画像をモニター等の表示手段に表示してもよい。必要に応じて所定の波長を選択的に通過させるフィルターを用いてもよい。
　染色したミトコンドリアを有する細胞の画像の解析方法の一例を後述する。
＝＝ミトコンドリア染色の利用＝＝
＜生細胞を死細胞から識別するための薬剤＞
　化合物（Ｉ）は、ミトコンドリアの膜電位に依存してミトコンドリアを染色するため、生細胞を染色し、死細胞は染色しない。従って、生細胞を死細胞を含む細胞集団に対し、化合物（Ｉ）による染色を行うことによって、生細胞だけを染色することができ、それによって死細胞を生細胞と識別できる。
＜細胞のマーキング剤＞
　化合物（Ｉ）は非常に簡便な細胞のマーキング剤として用いることができる。
　例えば、ヒトから採取した腫瘍細胞のミトコンドリアを化合物（Ｉ）でマークし、マウスに移植した上で、蛍光発光をトレースすることによって、腫瘍細胞のマウス体内での挙動（例えば、転移しやすさなど）を知ることができる。
　あるいは、化合物（Ｉ）によって蛍光染色されたミトコンドリアを有する第１の細胞と、化合物（Ｉ）によって蛍光染色されていないミトコンドリアを有する第２の細胞を含む細胞群において、化合物（Ｉ）からの蛍光染色を検出し、蛍光によって標識されたミトコンドリアを有する細胞を特定することにより、第１の細胞を識別することができる。
　このような第１の細胞と第２の細胞とを識別する方法を用いて、第１の細胞と第２の細胞との間の物質伝達または情報伝達を評価することができる。例えば、in vitroにおいて、化合物（Ｉ）によってケラチノサイトまたはメラノサイトのどちらか一方を蛍光染色する工程と、これらのメラノサイト及びケラチノサイトを混合し、両者を含む細胞群を、検査対象の化合物及び化合物（Ｉ）の存在下で培養する工程と、蛍光染色によって、ケラチノサイトとメラノサイトとを識別する工程と、メラノサイトからケラチノサイトへメラノソームが移動したかどうかを調べる工程と、を含む方法によって、メラノソームの移動に変化をもたらす検査対象の化合物を化粧品として評価することが可能になる。特に、メラノサイトからケラチノサイトへメラノソームの移動を抑制する化合物は、メラニンが体表面に移動するのを抑制できるため、美白効果のある化粧品として評価できる。
＜細胞状態評価剤＞
　また、化合物（Ｉ）は細胞状態評価剤として用いることができる。細胞状態の例として、細胞分化段階、アポトーシス、低酸素状態、細胞増殖抑制、増殖促進などが挙げられる。
　例えば線維芽細胞では、ミトコンドリアは伸長した形状をしているが、ｉＰＳ細胞に初期化すると、ミトコンドリアは断片化された形状となり、分化細胞に再分化させると、再度、伸長した形状をとるようになる（Biochem Biophys Res Commun. 2018 vol.500(1) pp.59-64.）。そこで、化合物（Ｉ）によってミトコンドリアを蛍光染色し、形状を特定することにより、細胞が初期化または再分化のどの段階にあるかを識別することができる。
　また、メラノサイトは、分化段階が進みメラニン合成が盛んな状態では、ミトコンドリアが核周辺に集積するが、分化段階が低くメラニン合成が盛んでない状態では、ミトコンドリアは細胞内に散在する。そこで、化合物（Ｉ）によってミトコンドリアを蛍光染色し、ミトコンドリアの細胞内局在を観察することによって、メラノサイトの分化段階を評価することができる。
　また、肺動脈内皮細胞が低酸素に曝露されると、微小管と微小管モータータンパク質ダイニンを介したミトコンドリアの逆行性移動が引き起こされ、ミトコンドリアが核周辺でクラスターを形成する（Sci. Signal., 2012vol.5(231) p.ra47）。その時、核内でＲＯＳの蓄積が観察されるが、ミトコンドリアの核周辺でのクラスター化を阻害すると、核内でのＲＯＳの蓄積も観察されない。そこで、化合物（Ｉ）によってミトコンドリアを蛍光染色し、ミトコンドリアの細胞内局在を観察することによって、細胞の低酸素状態や核内でのＲＯＳの蓄積などを判定することができる。
　さらに、細胞がオートファジーを起こすと、余剰なミトコンドリアを選択的に分解する現象が知られており、マイトファジーと呼ばれている。そこで、化合物（Ｉ）によってミトコンドリアを蛍光染色し、細胞内の蛍光染色の様子を調べると、マイトファジーを起こした細胞では、蛍光が細かく散在し、マイトファジー特有の蛍光シグナルが観察される。そこで、化合物（Ｉ）によってミトコンドリアを蛍光染色し、蛍光の分布状態を観察することによって、細胞がオートファジーを起こしているかどうか識別することができる。
＜蛍光による多重染色＞
　化合物（Ｉ）はミトコンドリアに強固に結合するため、化合物（Ｉ）による蛍光染色後に固定剤で固定したり、界面活性剤で膜を透過処理したりしても、従来の蛍光色素ほど化合物（Ｉ）による蛍光強度は弱くならない。しかも、放射する蛍光波長のピークの幅が狭い（すなわち５９０ｎｍ～６６０ｎｍ）ので、他の蛍光色素の蛍光波長とのオーバーラップが少ない。これらのことから、化合物（Ｉ）は他の蛍光色素との多重染色に好適に用いることができる。
　例えば、化合物（Ｉ）によって細胞をミトコンドリアを蛍光染色した後で、その細胞を固定し、抗体を用いた組織化学的手法で多重染色することができる。この時、同時に用いる蛍光色素は、化合物（Ｉ）の蛍光と波長がオーバーラップしないものであればよく、例えば、ＦＩＴＣ、ＡＴＴＯ ４８８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８、Ｃｙ５などが挙げられる。
　あるいは、核やエンドソームなどの他の細胞小器官に結合する蛍光色素と同時に用いることができる。この場合の蛍光色素として、ＤＡＰＩなどが例示できる。
＜化粧品・医薬品の評価方法＞
　上述したようなオートファジー以外にも、ミトコンドリアの形態や分布は、細胞の健康状態を反映する。例えば、断片化したり、核の近くに集積したりするなどのミトコンドリアの形態や分布は、細胞の健康状態を反映する。そこで、培養細胞を化粧品や医薬品であらかじめ処理し、化合物（Ｉ）によって細胞のミトコンドリアを蛍光染色することで、化粧品や医薬品の毒性を評価できる。
＜疾患マーカー＞
　ミトコンドリアの形状は細胞の状態や病態に応じて変化する。例えば、栄養不良状態になると、ミトコンドリアは丸くなることが知られている。あるいは、心血管疾患、ハッチントン病、ALS,などの神経疾患、糖尿病などは、ミトコンドリアの分裂・融合の異常が誘因になることが知られている（日本薬理学会　日薬理誌１４９：２６９－２７３（２０１７）「ミトコンドリア分裂を主眼とした既承認薬のエコファーマ」）。従って、化合物（Ｉ）は、疾患等の診断マーカーとして用いることもできる。例えば、生体から生体組織を採取する工程と、採取された生体組織のミトコンドリアを化合物（Ｉ）で染色する工程と、疾患を評価する工程と、を含む方法によって、化合物（Ｉ）を診断マーカーとして利用することができる。
＝＝細胞画像の解析方法＝＝
　本実施形態にかかる細胞画像の解析方法は、本明細書に開示の化合物またはその塩によって蛍光染色されたミトコンドリアを有する細胞を撮像して細胞画像を取得する第１の工程と、細胞画像から、ミトコンドリアの情報を得る第２の工程と、得られたミトコンドリアの情報に基づき、細胞の健康状態を評価する第３の工程と、を含む。この解析方法により、ミトコンドリア形態に基づいて、細胞の状態を調べることができる。
＜第１の工程＞
　まず、本明細書に開示の化合物またはその塩によって蛍光染色された１または２以上のミトコンドリアを有する細胞を撮像して細胞画像を取得する。
　この細胞画像は、顕微鏡画像であることが好ましい。顕微鏡画像は、実体顕微鏡や電子顕微鏡などを含む顕微鏡に付属の撮像素子付カメラによって撮像され、画像ファイルとして得られるのが好ましい。細胞画像には、細胞が１個撮像されていても、複数個撮像されていてもよい。
＜第２の工程＞
　本工程では、第１の工程で得られた細胞画像から、１個の細胞内に存在する１個または２個以上のミトコンドリアの情報を得る。
　ミトコンドリアの情報とは、そのミトコンドリアの画像から得られた、そのミトコンドリアの特徴を示す数値、例えば、面積、長さ、幅、縦横比、円形度、Elongation、Shape Factor、Roughness、隣接ミトコンドリアとの最短距離、Branchingポイント数、核との距離、細胞膜との距離、細胞体からの距離のうち、少なくともいずれか一つの数値を統計処理して得られた統計量、または蛍光染色されたミトコンドリアが細胞内において所定の密度以上に凝集している領域の、細胞内での占有率などである。
　ミトコンドリアの長さとは、ミトコンドリアの外周上の２点を結ぶ線分の長さのうちの最も長いものをいう。ミトコンドリアの幅とは、ミトコンドリアの外周上の２点を結ぶ線分の長さのうちの最も短いものをいう。ミトコンドリアの円形度とは、ミトコンドリア領域と同じ面積を持つ円の円周の二乗と当該エリアの円周の二乗の割り算の結果をいう。ミトコンドリアのElongationとは、ミトコンドリアの幅に対する長さの割合をいう。ミトコンドリアのShape Factorとは、ミトコンドリア領域の凹凸を埋めた図形の周囲長の二乗に対するミトコンドリア領域と同じ面積を持つ円の周囲長の二乗の割合をいう。ミトコンドリアの隣接ミトコンドリアとの最短距離とは、そのミトコンドリアの外周上の点と隣接ミトコンドリアの外周上の点とを結ぶ線分の長さのうちの最も短いもの、またはそのミトコンドリアの重心と隣接ミトコンドリアの重心との距離のいずれかをいう。ミトコンドリアのBranchingポイント数とは、ミトコンドリアが枝状に分岐した形状を有している場合の枝わかれ部分の数をいう。ミトコンドリアの核との距離とは、そのミトコンドリアの外周上の点と隣接ミトコンドリアの外周上の点とを結ぶ線分の長さのうちの最も短いもの、またはそのミトコンドリアの重心と核の重心との距離のいずれかをいう。ミトコンドリアの細胞膜との距離とは、そのミトコンドリアの外周上の点と細胞膜上の点とを結ぶ線分の長さのうちの最も短いものをいう。ミトコンドリアの細胞体からの距離とは、神経細胞において、神経突起内に存在するミトコンドリアと、神経突起と細胞体の接続地点、細胞体の重心、または核の重心との距離をいう。
　１個のミトコンドリアの場合、得られた値をそのまま、あるいは所定の桁になるように四捨五入などの統計処理をして、統計量を算出してもよい。
　２個以上のミトコンドリアの場合、各ミトコンドリアについて、上記情報を得た後、得られた数値を用いて統計処理を行い、統計量を算出してもよい。統計処理としては、例えば、平均値、中央値、分散値、四分位数などを求めることが例示できる。
　あるいは、統計量の代わりに、蛍光染色されたミトコンドリアが細胞内において所定の密度以上に凝集している領域の、細胞の面積に対する占有率を求めてもよい。具体的には、例えば、まず、そのミトコンドリアが存在する細胞の面積を求める。次に、ミトコンドリアが所定の密度以上に凝集している領域の面積を求める。最後に、細胞の面積に対する、ミトコンドリアが凝集している領域の面積の割合を求め、この割合を占有率としてもよい。
＜第３の工程＞
　本工程では、第２の工程で得られたミトコンドリアの情報から、当該細胞の健康状態を評価する。 
　細胞の健康状態とは、細胞が異常な状態であったり、老化した状態であったりすることをいう。細胞が異常な状態であると、例えば、ネクローシスを生じていたり、アポトーシスを生じていたり、増殖速度が通常より速かったり遅かったり、細胞の形態が変化したり、間葉―上皮分化転換などの分化転換が生じたり、ミトコンドリアの分裂と融合のバランスが崩れたり、異常タンパク質が蓄積したりすることをいう。また、細胞が老化すると、例えば、コラーゲンの産生機能が低下したり、増殖速度が遅くなったり、テロメアが短くなったり、細胞特異的な、または細胞本来の機能を失ったり、細胞質が増大したり、多核化したり、あるいはミトコンドリアが断片化したりする。この細胞の健康状態は個体の状態も含み、例えば、双極性障害などの患者における細胞の状態も含む。
　ミトコンドリアの情報として統計量を利用する場合、細胞画像を解析する細胞とは異なる第２の細胞において蛍光染色された１または２以上のミトコンドリアの情報を統計処理して得られた統計量と、第２の工程で求めた統計量を比較することによって、細胞の健康状態を評価してもよい。また、ミトコンドリアの情報として占有率を利用する場合、細胞画像を解析する細胞とは異なる第２の細胞において蛍光染色された２以上のミトコンドリアが第２の細胞内において所定の密度以上に凝集している領域の、第２の細胞の面積に対する占有率と、第２の工程で求めた占有率を比較することによって、細胞の健康状態を評価してもよい。
　ここで、第２の細胞は、細胞画像を解析する細胞と同じ種類の細胞であることが好ましく、また正常な細胞であることが好ましい。ここで、正常とは、上述したような異常な状態ではないことをいう。例えば、細胞の形態、機能、増殖が正常であることが含まれる。
＜第４の工程＞
　本工程では、ミトコンドリアの情報を得た細胞の明視野画像を取得する。取得した明視野画像は、例えば、細胞の面積を求めるのに利用できる。
＜具体的な画像解析手順＞
　図３を参照し、染色されたミトコンドリアを含む細胞が撮像された画像を解析するための具体的な画像解析手順の一例を説明する。
　まず、撮像素子付蛍光顕微鏡を用いて、染色された１または複数のミトコンドリアを含む１または複数の細胞の蛍光画像を取得する（Ｓ２１）。そして、取得した撮像画像から、ショットノイズを除去する（Ｓ２１）。具体的には、取得された撮像画像に対して、画像内の一定の大きさの領域において輝度値を平均化したり、高周波成分を取り除くことで、撮像画像からショットノイズを除去することができる。
　次に、細胞全体をHCS CellMask（登録商標）等の試薬で染色し、撮像素子付蛍光顕微鏡を用いて得られた蛍光画像を二値化処理することによって、画像内での細胞の領域（以下、「細胞領域」と称する）を検出する（Ｓ２２）。
　あるいは、その他にＤＡＰＩ等の核染色試薬の蛍光画像の二値化することで核を検出し、それを起点として細胞質染色の蛍光画像に対してWatershedアルゴリズムで細胞領域を検出する。細胞質染色試薬の代わりにミトコンドリア蛍光画像を使用してもよい。
　あるいは、位相差画像を用いて細胞領域を検出してもよい。例えば、位相差画像に対してクローズ・オープンフィルタを適用して画像の差分を取り、エッジ情報を取得し、取得したエッジ情報に基づいてGVF（Gradient vector flow）を作成して細胞の輪郭線を取得して細胞領域を検出も良い。更に、GVFの処理に加えて、蛍光画像から最終的に細胞の輪郭線を取得して細胞領域を検出できる。
　ショットノイズの除去された各細胞の撮像画像から、輝度値情報に基づき、（株）ニコン製のNIS Elementsソフトウエアに実装されているDetect Peaksアルゴリズムを使用して、輝度値が連続して高く分布している領域を検出し、さらに高輝度値に輝度を増強する（Ｓ２３）。その結果、各細胞の内部構造として、糸状の構造物の輪郭が強調される。
　こうして得られた輝度値を所定の閾値で二値化処理することで、糸状の構造を有するミトコンドリアの二値画像が得られ、ミトコンドリアとして認識できるようになる（Ｓ２４）。
　この二値画像を用いて、各ミトコンドリアの特徴を示す数値を得る（Ｓ２５）。
　次に、ミトコンドリアが細胞内において所定の密度以上に凝集している領域を検出する（Ｓ２６）。このとき、ミトコンドリアが特定できる二値画像を用いてもよいが、ショットノイズの除去された細胞の撮像画像をもちいてもよい。後者の場合、例えば、区分けした領域ごとに輝度値の総和を算出し、輝度値が相対的に高い領域を特定することによって、ミトコンドリアの凝集している領域を検出してもよい。
　Ｓ２２で検出された細胞領域の面積、およびＳ２６で検出されたミトコンドリアが業種している領域の面積を計測し、ミトコンドリアが細胞内において所定の密度以上に凝集している領域の、細胞の面積に対する占有率を算出する（Ｓ２７）。
　Ｓ２５で得られたミトコンドリアの特徴を示す数値の統計処理を行い、統計量を算出する（Ｓ２８）。
　Ｓ２７で得られた占有率及び/又はＳ２８で得られた統計量に基づき、細胞の健康状態を評価する。
　評価方法は特に限定されないが、例えば、第２の細胞のミトコンドリアの情報を求め、以下に述べる学習機器を使用し、第２の細胞のミトコンドリアの情報と比較することにより、細胞の健康状態を評価してもよい。
　まず、第２の細胞として、異常や老化を生じている細胞や正常細胞を用い、それらの細胞から得られた１または２以上の情報をｎ次元ベクトル空間にマップし、Deep Learning, サポートベクターマシン、決定木等の手法で学習させる。この学習機に対し、目的のミトコンドリアの情報を入力すると、異常や老化を生じているかどうかが判断できる。
＝＝顕微鏡装置＝＝
　以下に、本開示の解析方法で用いる顕微鏡装置の一例を、図１および図２を用いて説明する。
　図１に示すように、顕微鏡装置１は、装置本体１０と、コンピュータ１７０と、表示部であるモニタ１６０と、入力器１８０とを備える。装置本体１０には、顕微鏡部１５０と、透過照明部４０と、撮像装置（以下、デジタルカメラと称する）３００と、励起用光源７０と、光ファイバ７とが備えられる。デジタルカメラは、ＣＣＤカメラやＣＭＯＳカメラなどが例示できる。
　顕微鏡部１５０は、ステージ２３と、対物レンズ部２７と、蛍光フィルタ部３４と、結像レンズ部３８と、偏向ミラー４５２と、フィールドレンズ４１１と、コレクタレンズ４１とを備え、透過照明部４０は、透過照明用光源４７と、フィールドレンズ４４と、偏向ミラー４５とを備える。
　ステージ２３には、透明な培養容器２０を収めたチャンバ１００が載置される。培養容器２０では、ミトコンドリアが蛍光物質で標識された培養細胞が培地中で生育している。
その培養細胞をチャンバ１００の外側から観察するため、チャンバ１００の底面の一部ａと、チャンバ１００の上面の一部ｂとはそれぞれ透明になっている。ここでは、培養容器２０の上面が開放されている場合を説明するが、必要があれば培養容器２０の上面は培養容器２０と同質の蓋で覆われていてもよい。
　対物レンズ部２７には、図１のＸ方向にそって複数種類の対物レンズが装着されており、対物レンズ部２７がＸ方向にそって移動することにより、装置本体１０の光路に配置される対物レンズの種類が切り替わる。この切り替えはコンピュータ１７０の制御下で行われる。
　蛍光フィルタ部３４には、図１のＸ方向にそって複数種類のフィルタブロックが装着されており、蛍光フィルタ部３４がＸ方向にそって移動することにより、装置本体１０の光路に配置されるフィルタブロックの種類が切り替わる。この切り替えもコンピュータ１７０の制御下で行われる。
　コンピュータ１７０は、光路に配置される対物レンズの種類と、光路に配置されるフィルタブロックの種類との組み合わせを、装置本体１０に設定されるべき観察方法に応じて切り替える。本実施の形態では、この切り替えによって、装置本体１０による観察方法が位相差観察と２種類の蛍光観察との間で切り替わるのものとする。
　位相差観察と蛍光観察とでは、光路に配置されるフィルタブロックの種類と、光路に配置されうる対物レンズの種類とが異なり、２種類の蛍光観察では、光路に配置されるフィルタブロックの種類のみが異なり、光路に配置されうる対物レンズの種類は同じである。また、位相差観察と蛍光観察では、照明方法が異なる。
　コンピュータ１７０は、位相差観察時には、透過照明部４０の光路を使用するために透過照明用光源４７を用い、蛍光観察時には、落射照明部の光路（すなわち、励起用光源７０、光ファイバ７、コレクタレンズ４１、フィールドレンズ４１１、偏向ミラー４５２、蛍光フィルタ部３４、対物レンズ部２７を順に経由する光路）を使用するため、励起用光源７０を用いる。なお、透過照明用光源４７を用いるときに励起用光源７０は電源を切り、励起用光源７０を用いるときに透過照明用光源４７は電源を切る。
　明視野観察である位相差観察時、透過照明用光源４７から射出された光は、フィールドレンズ４４、偏向ミラー４５、チャンバ１００の透明部ｂを介して培養容器２０の中の観察ポイントｃを照明する。その観察ポイントｃを透過した光は、培養容器２０の底面、チャンバ１００の透明部ａ、対物レンズ部２７、蛍光フィルタ部３４、結像レンズ３８を介してデジタルカメラ３００の受光面に達し、観察ポイントｃの位相差像を形成する。この状態でデジタルカメラ３００が作動すると、位相差像が撮像され、位相差画像データが生成する。この画像データは、コンピュータ１７０に送信され、そこで記憶される。
　なお、明視野観察による明視野画像には、蛍光観察以外の明視野観察による画像、例えば暗視野観察、位相差観察、微分干渉観察による画像が含まれる。
　蛍光観察時、励起用光源７０から射出された光は、光ファイバ７、コレクタレンズ４１、フィールドレンズ４１１、偏向ミラー４５２，蛍光フィルタ部３４、対物レンズ部２７、チャンバ１００の透明部ａ、培養容器２０の底面を介して培養容器２０の中の観察ポイントｃを照明する。これによって、観察ポイントｃに存在する蛍光物質が励起され、蛍光物質は蛍光を発する。この蛍光は、培養容器２０の底面、チャンバ１００の透明部ａ、対物レンズ部２７、蛍光フィルタ部３４、結像レンズ３８を介してデジタルカメラ１３０の受光面に達し、観察ポイントｃの蛍光像を形成する。この状態でデジタルカメラ３００が作動すると、蛍光像が撮像され、画像データが生成する。この画像データも、コンピュータ１７０へ送信され、そこで記憶される。
　なお、コンピュータ１７０は、ステージ２３のＸＹ座標及び対物レンズ部２７のＺ座標を制御することにより、培養容器２０における観察ポイントｃのＸＹＺ座標における位置を制御する。
　また、チャンバ１００には、シリコーンチューブを介して加湿器が接続されていてもよく、チャンバ１００の内部の湿度及びＣＯ２濃度が、所定の値に制御されてもよい。また、チャンバ１００の周辺の空気は、熱交換器によって適度に循環され、それによってチャンバ１００の内部温度も所定値に制御されてもよい。このようなチャンバ１００の内部の湿度、ＣＯ２濃度、温度は、センサにより測定されてもよい。その測定結果は、コンピュータ１７０へ送信され、そこで記憶されてもよい。一方、デジタルカメラ３００は装置本体１０との他の部分とは別の筐体に収められ、チャンバ１００の内部温度に拘わらず装置本体１０の外気温度と同程度に保たれてもよい。
　次に、タイムラプス撮影に関するコンピュータ１７０の動作を説明する。
　コンピュータ１７０には、観察用のプログラムがインストールされており、コンピュータ１７０はそのプログラムに従って動作する。ユーザからコンピュータ１７０への情報入力は、何れも入力器１８０を介して行われる。
　図２は、コンピュータ１７０の動作フローチャートである。図２に示すように、最初にコンピュータ１７０は、装置本体１０の観察方法を、低倍率の位相差観察に設定し、その状態でバードビュー画像の画像データを取得し、それをモニタ１６０で表示する（Ｓ１１）。バードビュー画像とは、培養容器２０の比較的広い領域の画像をいう。
　バードビュー画像の画像データを取得するに当たって、コンピュータ１７０は、培養容器２０における観察ポイントｃをＸＹ方向へ移動させながら位相差画像の画像データを繰り返し取得し、取得された複数の画像データを１枚の画像の画像データに合成する。個々の画像データは、所謂タイル画像の画像データであり、合成後の画像データがバードビュー画像の画像データである。
　ユーザは、モニタ１６０に表示されたバードビュー画像を観察しながら、タイムラプス撮影の条件（例えば、インターバル、ラウンド数、観察ポイント、観察方法など）を決定する。
　コンピュータ１７０は、ユーザから条件が入力されると（Ｓ１２：ＹＥＳ）、その条件が書き込まれたレシピを作成する（Ｓ１３）。レシピの格納先は、例えばコンピュータ１７０のハードディスクである。以下、レシピに書き込まれたインターバル、ラウンド数、観察ポイント、観察方法をそれぞれ「指定インターバル」、「指定ラウンド数」、「指定ポイント」、「指定観察方法」と称する。
　その後、コンピュータ１７０は、ユーザからタイムラプス撮影の開始指示が入力されると（Ｓ１４）、タイムラプス撮影を開始する（Ｓ１５）。
　タイムラプス撮影では、コンピュータ１７０は、培養容器２０の観察ポイントｃを指定ポイントに一致させると共に、装置本体１０の観察方法を指定観察方法に設定し、その状態で画像データを取得する。指定観察方法が３種類であった場合は、装置本体１０の観察方法を３種類の指定観察方法の間で切り替えながら３種類の画像データを連続的に取得する。これによって、第１ラウンドの撮影が終了する。
　その後、コンピュータ１７０は、第１ラウンドの撮影開始時刻から指定インターバルだけ待機時間をおき、第２ラウンドの撮影を開始する。第２ラウンドの撮影方法は、第１ラウンドの撮影方法と同じである。
　さらに、以下の撮影は、実行済みのラウンド数が指定ラウンド数に達する（Ｓ１６：ＹＥＳ）まで繰り返される。
　さて、タイムラプス撮影の期間中（Ｓ１６：ＮＯ）、コンピュータ１７０は、装置本体１０から取り込んだ画像データを実施経過ファイルへ逐次蓄積する。この実施経過ファイルの格納先は、例えばコンピュータ１７０のハードディスクである。
　さらに、コンピュータ１７０は、タイムラプス撮影の期間中又はタイムラプス撮影の終了後にユーザから確認指示が入力されると、その時点における実施経過ファイルの内容を参照し、それに基づき以下に説明する実施経過確認用画面をモニタ１６０へ表示する。
　例えば、この顕微鏡装置１により取得されたバードビュー画像のうちの各細胞の撮像画像がコンピュータ１７０の画像処理部に入力され、そこで、上述した画像解析処理が実行され、解析結果が出力されてもよい。
＜実施例１＞化合物（ＩＩ）の合成
　以下に記載する手順で、化合物（ＩＩ）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　ＡＴＴＯ５６５―ｆｒｅｅ　ＣＯＯＨ（１ｍｇ）をアセトニトリル（０．５ｍＬ）に溶解させて得られた溶液に対し、２等量のＤＰＰＡと１等量のトリエチルアミンを加え３０分室温で反応させた。反応液に１ｍＬの水と２ｍＬのヘキサンを加えて混合して静置し、ヘキサン層を回収した。その後、脱気処理にて濃縮し、最終的に０．１ｍＬのアセトニトリルに置換し、アセトニトリルで平衡化したシリカゲルカラムに通すことで目的物を精製した。溶出液をすべて回収し、減圧脱気にて乾燥させ、使用前にＤＭＳＯに溶解した。
1 H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 1.23 (t, 3H, J = 14 Hz), 2.25 (broad s, 4H), 3.00 (m, 2H),7.06 (m, 1H), 7.22 (s, 1H).
　合成物は、ＵＰＬＣ-ＭＳ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ）解析で確認した。ＭＳ：５０５．２２、ＭＳ／ＭＳ:　４８９．１９、４７７．１９、４６１．１６が検出され、目的物が得られたことが確認された。
＜実施例２＞化合物（ＩＩＩ）の合成
　以下に記載する手順で、化合物（ＩＩＩ）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　ＡＴＴＯ５６５―ＨＮＳエステル（１ｍｇ）をアセトニトリル（０．５ｍＬ）に溶解させて得られた溶液に対し、１等量のＤＰＰＡと１等量のトリエチルアミンを加え、３０分室温で反応させた。反応液に１ｍＬの水と２ｍＬのヘキサンを加えて混合して静置し、ヘキサン層を回収した。その後、脱気処理にて濃縮し、最終的に０．１ｍＬのアセトニトリルに置換し、アセトニトリルで平衡化したシリカゲルカラムに通すことで目的物を精製した。溶出液をすべて回収し、減圧脱気にて乾燥させ、使用前にＤＭＳＯに溶解した。
　合成物は、ＵＰＬＣ-ＭＳ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ）解析で確認した。ＭＳ：５０７．２５、ＭＳ／ＭＳ：　４７９．２４、４４９．１９、４３５．１８が検出され、目的物が得られたことが確認された。
＜実施例３＞生細胞におけるミトコンドリアの蛍光染色
　実施例１および実施例２で合成した化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＩＩ）によって細胞内ミトコンドリアの蛍光染色を行った。手順を以下に示す。
（１）ガラスボトムディッシュ（マツナミ社製）にマウス悪性黒色腫細胞Ｂ１６Ｆ１０（理研細胞バンクより入手）３×１０4個を播種し、２４時間培養した。培地はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）のＨｉｇｈグルコース（Ｄ６０４６（Ｍｅｒｃｋ））に１×ペニシリン・ストレプトマイン（２６２５２－９４（ナカライテクス））と１０％牛胎児血清（ニチレイ）を添加したものを用いた。培養は３７℃、５％ＣＯ2で行った。
（２）化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＩＩ）を最終濃度が０．０１μＭとなるように培地に添加した。
（３）１５分後に培地を吸引除去し、新しい培地に交換した。
（４）蛍光顕微鏡(ＢＺ－９０００、キーエンス社製）を用いて、化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＩＩ）を５６０ｎｍで励起して放出された蛍光を観察し（波長：６２０ｎｍ）、細胞を撮像した。図４に結果を示す。図４Ａは、化合物（ＩＩ）による細胞全体の画像である。図４Ｂは、化合物（ＩＩＩ）による細胞全体の画像である。図４で示されるように、化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＩＩ）によって、細胞内で線状の構造を有するミトコンドリアが蛍光染色された。
　このように、化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＩＩ）は細胞内ミトコンドリアを染色できる。
＜実施例４＞ＤＡＰＩ及び抗ＣＯＸ４抗体との三重染色
　本実施例では、実施例２で合成した化合物（ＩＩＩ）によって細胞内ミトコンドリアの蛍光染色を行った後に固定し、さらにＤＡＰＩおよびミトコンドリアのマーカーであるＣＯＸ４に対する抗体で細胞を染色した。手順を以下に示す。
（１）ガラスボトムディッシュ（マツナミ）にＨＥＫ２９３Ａ細胞（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒrより入手）３×１０4個を播種し、２４時間培養した。培地はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）のＨｉｇｈグルコース（Ｄ６０４６（Ｍｅｒｃｋ））に１×ペニシリン・ストレプトマイン（２６２５２－９４（ナカライテクス））と１０％牛胎児血清（ニチレイ）を添加したものを用いた。培養は３７℃、５％ＣＯ2で行った。
（２）化合物（ＩＩＩ）を最終濃度が０．０１μＭとなるように培地に添加した。
（３）５分後に培地を吸引除去し、４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液（０９１５４－１４（ナカライテクス））１ｍＬを添加し、室温で１５分固定した。
（４）４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液を吸引除去後、リン酸緩衝液（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（関東化学）含有、以下、ＰＢＳＴと称する。）を１ｍＬ添加した。
（５）ＤＡＰＩ（Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ（登録商標）ＤＡＰＩ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（同仁化学研究所））を１μＬ添加し、１５分放置して核を蛍光染色した。
（６）細胞を、ＰＢＳＴで３回洗浄した。
（７）洗浄後、１０％ＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅ(ナカライテスク)／リン酸緩衝液に抗ＣＯＸ４抗体(ＰＭ０６３ＭＳ（ＭＢＬ）)を１／１０００希釈した反応液１ｍＬを加え、１時間室温に放置した。
（８）細胞を、ＰＢＳＴで３回洗浄した。
（９）洗浄後、１０％ＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅ／リン酸緩衝液（　　）ｍＬに抗マウスＩｇＧ　Ｈ＆Ｌ(Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８)(ａｂ１５０１１３（Ａｂｃａｍ)）を１／１０００希釈した反応液１ｍＬを加え、１時間室温に放置した。
（１０）細胞を、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
（１１）蛍光顕微鏡により細胞を観察した。なお、観察時（波長：６２０ｎｍ）、化合物（ＩＩＩ）は５６０ｎｍで励起し、ＣＯＸ４に結合した抗体は４７０ｎｍで励起した。また、ＤＡＰＩは３６０ｎｍで励起した。
　図５に結果を示す。図５Ａは、化合物（ＩＩＩ）による細胞全体の蛍光顕微鏡像である。図５Ｂは、抗ＣＯＸ４抗体の集積部位である。図５Ｃは、図５Ａ、図５Ｂおよび核（ＤＡＰＩ）の蛍光像を重ね合わせたものである。図５Ｄは、細胞全体の明視野像である。図５ＡおよびＢに示されるように、化合物（ＩＩＩ）およびＣＯＸ４に結合した抗体から蛍光が放出され、そして、図５Ｃに示されるように、化合物（ＩＩＩ）からの蛍光とＣＯＸ４に結合した抗体からの蛍光が重なっていた。
　このように化合物（ＩＩＩ）は、染色後に固定し、ＤＡＰＩや抗体と多重染色を行うことができる。
＜実施例５＞ミトコンドリア膜電位に対する蛍光染色の依存性
　ミトコンドリア膜は他の細胞内器官の膜よりも強い膜電位を有しており、ミトコンドリア集積性の化合物の殆どが、ミトコンドリア膜電位依存的にミトコンドリアに局在する。
本実施例では、化合物（ＩＩＩ）によるミトコンドリアの染色が膜電位に依存することと、一旦染色されれば、膜電位が失われても染色されたままであることを示す。手順を以下に示すが、化合物（ＩＩＩ）によるミトコンドリアの染色の詳細は実施例４と同様である。
（１）ガラスボトムディッシュにＨＥＫ２９３Ａ細胞（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒより入手）３×１０4個を播種し、２４時間培養した。
（２）化合物（ＩＩＩ）を最終濃度が０．０１μＭになるように添加した。
（３）蛍光顕微鏡により細胞を観察した。なお、観察時、５６０ｎｍで化合物（ＩＩＩ）を励起した。
（４）その後、ミトコンドリア膜電位阻害剤（脱共役剤：Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone（ＦＣＣＰ））（Ｃ２９０２（Ｍeｒcｋ社製））を最終濃度が１０μＭとなるように培地中へ添加し、１時間培養した。
（５）再度、蛍光顕微鏡により観察した。
（６）次に、ＦＣＣＰを前処理した後、化合物（ＩＩＩ）を添加する試験を行った。
（７）蛍光顕微鏡により観察した。
　図６に結果を示す。図６Ａは、化合物（ＩＩＩ）のみの処理で放出される蛍光を観察した画像である。図６Ｂは、化合物（ＩＩＩ）の処理後、ＦＣＣＰ処理した時の画像である。図６Ｃは、ＦＣＣＰ処理後に化合物（ＩＩＩ）を処理した時の画像である。
　図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、化合物（ＩＩＩ）は、一旦ミトコンドリアを染色すると、その後ミトコンドリアの膜電位が消失してもミトコンドリアに集積したままであった。また、図６Ｃに示されるように、化合物（ＩＩＩ）のミトコンドリアへの集積はミトコンドリアの膜電位を必要とした。
　このように、化合物（ＩＩＩ）によるミトコンドリアの染色には、ミトコンドリアの膜電位が必要である。従って、ミトコンドリア膜電位がない死細胞は、化合物（ＩＩＩ）によっては染色されず、化合物（ＩＩＩ）は生きた細胞のみを染色できるため、化合物（ＩＩＩ）は生細胞と死細胞の識別に利用可能である。
＜実施例６＞ミトコンドリアの蛍光染色による、複数種の細胞の選別
　本実施例では、化合物（ＩＩＩ）を用いたミトコンドリアの蛍光染色によって、２種類の細胞間の物質の伝達を評価した。
　化合物（ＩＩＩ）を用いてヒトケラチノサイトＰＳＶＫ１細胞のミトコンドリアを染色し、マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０細胞からＰＳＶＫ１細胞へメラノソーム輸送を評価する際に、どちらがケラチノサイトであるかを識別した。以下に手順を示すが、化合物（ＩＩＩ）によるミトコンドリアの染色の詳細は実施例４と同様である。
（１）ガラスボトムディッシュにＰＳＶＫ１細胞(医薬基盤・健康・栄養研究所より入手)を１×１０4個播種し、２４時間培養した。培地はＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２　Ｋｉｔ（Ｃ－２０１１１（ＴＡＫＡＲＡバイオ））を用いた。
（２）化合物（ＩＩＩ）を最終濃度が０．０１μＭになるように添加し、５分間培養した。
（３）培地で細胞を３回洗浄した。
（４）Ｂ１６Ｆ１０細胞を１×１０4個播種し、さらに２４時間培養した。
（５）蛍光顕微鏡により、細胞の蛍光観察および明視野観察を行った。なお、蛍光観察は５６０ｎｍで励起した。結果を図７に示す。
　図７Ａは、Ｂ１６Ｆ１０細胞とＰＳＶＫ１細胞の共存状態を示す明視野像である。小胞である黒色の粒はメラノソームである。図７Ｂは化合物（ＩＩＩ）で染色した細胞を検出する蛍光画像であり、中心部分の３つの細胞はＰＳＶＫ１細胞と判別される。図７Ｃは、図７Ａと図７Ｂを重ねた画像である。
　メラノソームはＢ１６Ｆ１０細胞でのみ生成されるが、図７Ａの視野にあるすべての細胞にメラノソームが存在した。一方、図７Ｂおよび図７Ｃに示すように、細胞集団中に、化合物（ＩＩＩ）で染色されたＰＳＶＫ１細胞も含まれることから、ＰＳＶＫ１細胞に存在するメラノソームは、Ｂ１６Ｆ１０細胞から移動したメラノソームであった。
　このように、化合物（ＩＩＩ）を用いたミトコンドリアの蛍光染色によって、複数種の細胞の選別ができ、このことは細胞間の相互作用の評価に利用できる。
＜実施例７＞マイトファジーの検出
　本実施例では、化合物（ＩＩＩ）によるミトコンドリアの染色を用いて、マイトファジーの検出を行った。
　まず、オートファジーの起きていない定常状態において、化合物（ＩＩＩ）と、オートファジーマーカーであるＬＣ３Ｂに対する抗体と、核染色用ＤＡＰＩとを用いて、三重染色を行った。以下に手順を示す。
（１）ガラスボトムディッシュにＨＥＫ２９３Ａ細胞を播種し、２４時間培養した。培地はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）のＨｉｇｈグルコース（Ｄ６０４６（Ｍｅｒｃｋ））に１×ペニシリン・ストレプトマイン（２６２５２－９４（ナカライテクス））と１０％牛胎児血清（ニチレイ）を添加したものを用いた。培養は３７℃、５％ＣＯ2で行った。
（２）化合物（ＩＩＩ）を最終濃度が０．０１μＭになるように添加した。
（３）１５分後に培地を吸引除去し、４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液（０９１５４－１４（ナカライテクス））１ｍＬを添加し、室温で１５分固定した。
（４）４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液を吸引除去後、ＰＢＳＴを１ｍＬ添加した。
（５）ＤＡＰＩを１μＬ添加し、１５分放置して核を蛍光染色した。
（６）ＰＢＳＴで、３回、細胞を洗浄した。
（７）洗浄後、１０％ＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅ(ナカライテスク)／リン酸緩衝液に抗ＬＣ３Ｂ抗体（ＧＴＸ１２７３７５（ＧＥＮＥＴＥＸ）)を１／１０００希釈した反応液１ｍＬを加え、１時間室温に放置した。
（８）ＰＢＳＴで、３回、細胞を洗浄した。
（９）洗浄後、１０％ＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅ／リン酸緩衝液に抗ウサギＩｇＧ　Ｈ＆Ｌ(Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８)( ａｂ１５００７７（Ａｂｃａｍ)）を１／１０００希釈した反応液１ｍＬを加え、１時間室温に放置した。
（１０）ＰＢＳＴで、４回、細胞を洗浄した。
（１１）蛍光顕微鏡により細胞を観察した。なお、測定において化合物（ＩＩＩ）は５６０ｎｍで励起し、ＬＣ３Ｂに結合した抗体は４７０ｎｍで励起した。また、ＤＡＰＩは３６０ｎｍで励起した。
　図８に結果を示す。図８Ａは、化合物（ＩＩＩ）による蛍光染色の蛍光画像である。図８Ｂは、ＬＣ３Ｂ抗体による蛍光染色の蛍光画像である。図８Ｃは図８Ａ，図８ＢとＤＡＰＩによる核染色を重ね合わせた画像である。図８Ｄは明視野画像である。
　図８Ａ、図８Ｂ，図８Ｃに示されるように、生細胞の状態ではオートファジーが起きていないので、化合物（ＩＩＩ）によるミトコンドリアの蛍光シグナルにＬＣ３Ｂの蛍光シグナルが重ならなかった。
　次に、栄養分を含まない培地で培養することによりオートファジーを誘導した状態で、同様に、三重染色を行った。具体的には、上述の手順中、化合物（ＩＩＩ）を添加した５分後に、培地を吸引除去し、グルタミン、グルコース、ピルビン酸、牛胎仔血清を含まない培地に交換しさらに２４時間培養した。そして、培地を吸引除去し、４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液で固定し、（４）以降は細胞を同様に処理した。
　図９に結果を示す。図９Ａは、化合物（ＩＩＩ）による染色の蛍光画像である。図９Ｂは、ＬＣ３Ｂ抗体による染色の蛍光画像である。図９Ｃは図９Ａ，図９ＢとＤＡＰＩによる核染色を重ね合わせた画像である。図９Ｄは明視野画像である。
　図９Ａ、図９Ｂ，図９Ｃに示されるように、オートファジーを誘導した状態では、化合物（ＩＩＩ）によるミトコンドリアの蛍光シグナルが、生細胞の場合と異なり、細胞内に拡散していた。そして、化合物（ＩＩＩ）によるミトコンドリアの蛍光シグナルにＬＣ３Ｂの蛍光シグナルが重なった。
　このように、化合物（ＩＩＩ）によってミトコンドリアを染色することにより、その蛍光シグナルのパターンから、細胞がオートファジーを起こしているかどうかを判定できる。
＜実施例８＞メラノサイトの分化段階の評価方法
　メラノサイトは分化段階が進むと、メラノソームが増え、ミトコンドリアが核近傍に局在するようになる。本実施例では、化合物（ＩＩ）を用いて、メラノサイトＢ１６Ｆ１０細胞の分化段階をミトコンドリアの局在で評価した。以下に手順を示す。
（１）ガラスボトムディッシュにＢ１６Ｆ１０細胞を播種し、２４時間培養した。培地はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）のＨｉｇｈグルコース（Ｄ６０４６（Ｍｅｒｃｋ））に１×ペニシリン・ストレプトマイン（２６２５２－９４（ナカライテクス））と１０％牛胎児血清（ニチレイ）を添加したものを用いた。培養は３７℃、５％ＣＯ2で行った。
（２）化合物（ＩＩ）を最終濃度が０．０１μＭになるように添加した。
（３）１５分後に、培地を吸引除去し、新しい培地に置換してから顕微鏡観察を行った。
　図１０Ａに明視野像を示す。黒い粒がメラノソームである。図１０Ｂは化合物（ＩＩ）で染色されたミトコンドリアの蛍光画像である。分化段階が進み、メラノソームの多いＢ１６Ｆ１０細胞はミトコンドリアが核近傍に局在した。一方、分化段階が低く、メラノソームが少ないＢ１６Ｆ１０細胞は、ミトコンドリアが細胞末端にまで存在した。
　このように、化合物（ＩＩ）を用いて、メラノサイトの分化段階を評価することができる。
＜実施例９＞画像解析
（１）ミトコンドリアの検出
ＨｅＬａ細胞を、実施例３と同様にして化合物（ＩＩＩ）を用いて染色した。共焦点顕微鏡を用いて、染色された細胞を撮像した画像（図１１Ａ）に対し、輝度値情報に基づき、（株）ニコン製のNIS Elementsソフトウエアに実装されているDetect Peaksアルゴリズムを使用して、輝度値が連続して高く分布している領域を検出した（図１１Ｂ）。その画像を二値化して、図１１Ｃに示す画像を得た。
　このような方法によって、ミトコンドリアを染色した細胞の画像から、自動的にミトコンドリアの形状を明確に検出できる。
（２）ミトコンドリアが所定の密度以上である領域の検出
　老化した間葉系幹細胞及び正常な間葉系幹細胞を、実施例３と同様にして化合物（ＩＩＩ）を用いて染色した（図１２Ａ、図１３Ａ）。細胞内のミトコンドリアの周辺の領域と比較して輝度値情報が相対的に高い領域を検出することによって、ミトコンドリアが所定の密度以上である領域を検出した（図１２Ｂ、図１３Ｂ）。一方、ミトコンドリア蛍光画像を二値化することによって、細胞全体が存在する領域を検出した（図１２Ｃ、図１３Ｃ）。
　このように、老化した細胞では、ミトコンドリアが所定の密度以上である領域の面積の、細胞全体の面積に対する割合が低下している。
　本発明によって、新規なミトコンドリア染色剤およびミトコンドリアの蛍光染色方法を提供することができる。 

Claims (24)

  1. 　下記式（Ｉ）で表される化合物、またはその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、
    　Ｒ１が、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＯＲ３、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＯＮＨ２、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、もしくは－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであって、Ｒ２が、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、もしくは－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであるか、または
    　Ｒ２が、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＯＲ３、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＯＮＨ２、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、もしくは－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであって、Ｒ1が、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、もしくは－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであり、
    　Ｒ３が、水素またはＣ１～Ｃ６アルキルである。）
  2. 　Ｒ２が－Ｎ＝Ｃ＝Ｏである、請求項１に記載の化合物、またはその塩。
  3. 　Ｒ1が－Ｎ＝Ｃ＝Ｏである、請求項２に記載の化合物、またはその塩。
  4. 　Ｒ1が－ＣＯＮＨ２である、請求項２に記載の化合物、またはその塩。
  5. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を含む、ミトコンドリア染色剤。
  6. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を含む、細胞マーキング剤。
  7. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を含む、細胞状態評価剤。
  8. 　細胞のオートファジーを検出するための薬剤であって、
    　請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を含む薬剤。
  9. 　生細胞を死細胞から識別するための薬剤であって、
    　請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を含む薬剤。
  10. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を用いて、ミトコンドリアを蛍光染色する工程を含む、ミトコンドリアの染色方法。
  11. 　オートファジーを起こした細胞の検出方法であって、
    　検査対象の細胞のミトコンドリアを請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物によって蛍光染色する工程と、
    　蛍光染色された前記ミトコンドリアを観察する工程と、
    を含む、検出方法。
  12. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を用いて、ミトコンドリアを蛍光染色する工程と、
    　蛍光染色された前記ミトコンドリアを有する細胞を特定する工程と、
    を含む、細胞の特定方法。
  13. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩によって蛍光染色されたミトコンドリアを有する第１の細胞と、請求項１～４のいずれの化合物によっても蛍光染色されていないミトコンドリアを有する第２の細胞を含む細胞群から、第１の細胞を識別する方法であって、
    　前記細胞群において、蛍光染色された前記ミトコンドリアを有する細胞を特定する工程を含む、細胞の識別方法。
  14. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩によって蛍光染色されたミトコンドリアを有する第１の細胞と、請求項１～４のいずれの化合物によっても蛍光染色されていないミトコンドリアを有する第２の細胞を含む細胞群において、前記蛍光染色によって第１の細胞と第２の細胞とを識別する工程と、
    　第１の細胞と第２の細胞との間の物質伝達または情報伝達を評価する工程と、
    を含む、方法。
  15. 　化粧品として、検査対象の化合物を評価する方法であって、
    　in vitroにおいて、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩によって、ケラチノサイトまたはメラノサイトのどちらか一方を蛍光染色する工程と、　前記メラノサイト及び前記ケラチノサイトを含む細胞群を前記検査対象の化合物の存在下で培養する工程と、
    　前記蛍光染色によって、前記ケラチノサイトと前記メラノサイトとを識別する工程と、　前記メラノサイトから前記ケラチノサイトへメラノソームが移動したかどうかを調べる工程と、
    　前記メラノソームの移動に変化をもたらす前記検査対象の化合物を化粧品として評価する工程と、
    を含む、方法。
  16. 　腫瘍細胞をヒト以外の動物の体内で特定する方法であって、
    　in vitroにおいて、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩によって、前記腫瘍細胞を蛍光染色する工程と、　蛍光染色した前記腫瘍細胞を前記動物に移植する工程と、
    　前記動物体内で、前記蛍光染色した前記腫瘍細胞を特定する工程と、
    を含む、方法。
  17. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩によって蛍光染色された１または２以上のミトコンドリアを有する細胞を撮像して細胞画像を取得する第１の工程と、
    　前記細胞画像から、前記１または２以上のミトコンドリアの情報を得る第２の工程と、
    　得られた前記１または２以上のミトコンドリアの情報に基づき、前記細胞の健康状態を評価する第３の工程と
    を含む細胞画像の解析方法。
  18. 　第１の工程において、前記細胞の蛍光画像は顕微鏡画像であって、
    　第２の工程において、前記１または２以上のミトコンドリアの情報は、前記１または２以上のミトコンドリアの、面積、長さ、幅、縦横比、円形度、Elongation、Shape Factor、Roughness、隣接ミトコンドリアとの最短距離、Branchingポイント数、核との距離、細胞膜との距離、細胞体からの距離のうち、少なくともいずれか一つの数値を統計処理して得られた統計量であり、
    　第３の工程において、前記統計量に基づき、前記細胞の健康状態が評価される、
    　請求項１７に記載の解析方法。
  19. 　第１の工程において、前記細胞の蛍光画像は顕微鏡画像であって、
    　第２の工程において、前記１または２以上のミトコンドリアの情報は、前記２以上のミトコンドリアが前記細胞内において所定の密度以上に凝集している領域の、前記細胞の面積に対する占有率であり、
    　第３の工程において、前記占有率に基づき、前記細胞の健康状態が評価される、
    　請求項１７に記載の解析方法。
  20. 　前記細胞の明視野画像を取得し、前記明視野画像において前記細胞を認識する第４の工程をさらに含む、請求項１８に記載の解析方法。
  21. 　前記細胞の明視野画像を取得する第４の工程をさらに含み、
    　前記細胞の面積が前記明視野画像より算出される、請求項１９に記載の解析方法。
  22. 　第３の工程において、第２の細胞において蛍光染色された１または２以上のミトコンドリアの情報を統計処理して得られた統計量と比較することによって、前記細胞の健康状態が評価される、請求項１８または２０に記載の解析方法。
  23. 　第３の工程において、第２の細胞において蛍光染色された２以上のミトコンドリアが前記第２の細胞内において所定の密度以上に凝集している領域の、前記第２の細胞の面積に対する占有率と比較することによって、前記細胞の健康状態が評価される、請求項１９または２１に記載の解析方法。
  24. 　前記第２の細胞が正常細胞である、請求項２２または２３に記載の解析方法。
     
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