JP4630015B2 - 細胞分離回収方法および細胞分離チップおよび細胞分離装置 - Google Patents
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(1)比重の違いで細胞を分離する方法、
(2)蛍光標識抗体で染色した情報あるいは目視の情報による方法、
(3)セルソーターによる方法。
図5は、本発明の細胞分離のプロトコルを実施するのに好適な細胞分離チップの実施例を模式的に示す平面図である。図6は、図5のA−A,B−B,C−CおよびD−D位置で矢印の方向に見た断面図である。図6では、図が煩雑になるのを避けるために、断面位置近傍に見えるもののみを表示した。図7は、図5、図6で説明した細胞分離チップを複数個積載した細胞分離装置の1例を模式的に示す平面図である。
(細胞分離例1)
具体例としてマウス脳真皮から切除された大脳組織断片を用いる例について詳細に述べる。組織細胞(この場合は大脳組織断片)を直ちに等張培養液にいれ37℃で5%二酸化炭素を含む雰囲気で15分間インキュベーションし、コンディショニングする。神経細胞系で使用できるであろう物質と標識物を表3に従って説明する。これらトランスポーターはhttp://www.bioparadigms.org/slc/intro.aspに記載されている。
表1に示した糖関連のトランスポーターを介する細胞分離を行う。糖の標識方法に関してはCytometry 27,262-268 (1997)に記載されているグルコースの標識法が応用できる。本文献には、蛍光標識グルコースを用いて、実際に細胞を染色し、セルソーターで検出できることが示されている(実際に分離回収はしていない)。
細胞分離例3では、複数の標識アミノ酸や標識ペプチドの細胞透過能の違いを測定することで細胞の違いを識別分離する例について述べる。
細胞分離例3を応用して白血病の原因細胞の分離を試みる一例を示す。急性白血病患者の血液にNDB化葉酸(Ex465/Em540)、4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-8-propionate標識Asn、4,4-difluoro-5-(2-pyrrole)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionate標識Thrを添加し30分間37℃でインキュベートする。NDB化葉酸(Ex465/Em540)をコントロールとして、4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-8-propionate標識Asn(Ex493/Em503), 4,4-difluoro-5-(2-pyrrole)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionate標識Thr(Ex576/Em589)の取り込み量を、DB化葉酸由来の蛍光強度に対する4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceneの各種誘導体由来の蛍光強度として測定し、蛍光波長503nm近傍の蛍光強度の強い細胞、すなわち、4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-8-propionate標識Asnの取り込み量の覆い細胞をセルソーターで分取する。分取した細胞を組織学的に顕微鏡観察すると95%以上の確率でいずれもガン化したロイコサイトである。がん細胞に対する正常は血球細胞における4,4-difluoro-5-(2-pyrrole)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionate標識Thrの取り込みは、4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-8-propionate標識Asnの取り込みほど顕著ではない。
細胞分離例5では、未知の機構で目的細胞内に取り込まれる物質を用いる例について述べる。ここではアルギニンオリゴマーを基質として使用する。アルギニンオリゴマーは、種々蛍光物質のほかに酵素などの巨大分子を修飾物質として結合させても目的細胞に取り込むことができる。また、細胞を問わず細胞膜透過性を示す(J. Mol. Recognit. 16, 260-264 (2003))。細胞のアルギニンオリゴマー取り込みの機構は解明されていないが、エンドサイトーシスやファゴサイトーシスではなく、アルギニンのグアニジル残基が細胞膜に存在するリン脂質と水素結合をつくり分子が膜ギャップを直接乗り越えるモデルとグアニジル基の強い塩基の影響が議論されている。 本発明者らは、これらに加え、カオトロピックイオンの効果によりアルギニンオリゴマーが弱い変性剤として働き、膜を部分的に変性していると考えている。
スルホローダミン101標識アルギニンオクタマー(Em605)とNDB標識Asn(Em540)を目的細胞に取り込ませ、両者の取り込みの違いでがん細胞の分離を試みる。スルホローダミン101標識アルギニンオクタマー(Arg8−Cys−S−スルホローダミン101)はマレイイミド基を有する試薬(モレキュラープローブ社、Texas Red C2 maleimide)を用いてCysのSH基にエーテル結合している。アルギニンオリゴマーの細胞に対する作用は特殊なので、若干の説明を加える。J. Mol. Recognit. 16, 260-264 (2003)によると、アルギニンオリゴマーの長さには最適値があり、6から8の長さのものが最適である。短すぎると細胞膜を透過しづらいし、長すぎると、細胞膜に結合する傾向がある。さらに数10マーの長さになると細胞毒となる可能性が出てくる。本実施例ではオクタマーのものを用いている。実際には蛍光体を結合するためにアルギニンオクタマーのCOOH端にCysを連結し、このCysのSH基にマレイミド基を有する蛍光体を後付で結合させている。あるいは、Cysの代わりにあらかじめε−アミノ基に蛍光体が結合したLysをペプチド合成時に利用して蛍光標識してもよい。この場合はArg8−Lys−ε−NH−スルホローダミン101となる。アルギニンオリゴマーの濃度としては1μMで、処理時間は0.5時間処理でよい。アルギニンの長さが6から8で蛍光標識したものを用いると核の内部構造部分に強く蛍光を発するようになるので、核に特異的に移行していると考えられている。しかし、核のどの部分に濃縮されるかは不明である。細胞質からも核ほどではないが蛍光が観測される。いずれにせよ、細胞にしめる核の投影面積の占める割合を計測することができる。蛍光体としては上記のもののほかに、フルオレッセイン、テトラメチルロータミン,スルホローダミン101、ピレン誘導体、Cy3、Cy5、N,N,N1,N1-[2,6-bis(3'-aminomethyl-1'-pyrazolyl)-4-phenylpyridine] tetrakis (acetic acid)のユーロピウム錯体、各種蛍光ナノ粒子(粒径30nm)が利用できる。このため、必要に応じて励起波長と蛍光波長を得ることができる。
ここでは、試料としては大腸上向結腸の組織で部分的に上皮がガン化している切除組織を用いた細胞分離の操作を説明する。組織断片のまま、上記2種の蛍光標識基質を培地に混入し、30分間37℃でインキュベートする。組織を上記基質が含まれない0.15MのNaClで洗浄後、トリプシンを含む溶液で細胞を分散させる。直ちに本発明の画像解析型セルソーターにかけて、スルホローダミン101標識アルギニンオクタマー由来の蛍光波長605 nm近傍の蛍光強度分布を細胞ごとに測定する。ガン化細胞は細胞サイズが大きくなるとともに、核の占める割合も正常細胞に比べ大きくなることを利用してガン細胞を認識するために、蛍光強度の強い部分(すなわち核の特定部分)の細胞全体に対する面積比が20%以上の細胞を検出する。しかし、これだけでは実際に染まっている構造体が不明で判断に困る場合があり、フォールスネガティブが多くなる問題がある。そこで、同時に、がん細胞がAsn高要求性であることを利用し、NDB標識Asn由来の波長540nm近傍の蛍光強度を観察する。スルホローダミン101標識アルギニンオクタマーと、NDB標識Asnのいずれかが陽性となる細胞をセルソーターで分取する。分離される細胞は組織断片により異なるが、本一切除組織例では1000細胞のうち16細胞が分離される。分離した細胞と同一人物で別の大腸部位(ガン化していないと思われる部位)の細胞を組織学的に目視検査したところ、分離した細胞はいずれもがん化細胞であること推測することができる。分離細胞は培養により増殖させることが可能で、定法に従い培養すると、無限増殖能を示す。このように核がスルホローダミン101標識アルギニンオクタマーで巨大に染まり、細胞質にNDB標識Asnが取り込まれている細胞のダブルで判断することでがん細胞をより正確に分離できる。
細胞分離例8では、ミトコンドリアトランスポーターのように、細胞内のミトコンドリアに特異的に透過する基質を結合しておき、ミトコンドリアを特異的に染色する基質として使用することができることを示す。Arg化合物は多くの場合細胞膜透過性を持つとともにミトコンドリアにも特異的に到達する。実際、ミトコンドリア表面にはArg特異的トランスポーターが存在する(http://www.bioparadigms.org/slc/intro.asp)。よって、細胞分離例5で示したアルギニンオリゴマーにスルホローダミン101が結合したものがミトコンドリアに取り込まれることが予想される。スルホローダミン101−Arg6を細胞に取り込ませ、図8に示す光学系の対物レンズ105には100倍の水浸レンズで観察したところ、細胞質に斑点状の紋様が観測される。スルホローダミン101−Arg6がミトコンドリアに移行していることが示唆される。
Claims (12)
- トランスポーターを介して標識識別用の特定物質を目的細胞内に取り込ませる工程と、
前記目的細胞を含む溶液を流すための流路を備える細胞分離チップを用いて、前記取り込まれた標識識別用の特定物質標識物を光学的に検出して細胞の画像に基づいて前記目的細胞を分離する工程と、
前記細胞分離チップの前記流路上で、前記分離された目的細胞に取り込まれている標識識別用の特定物質をトランスポーターを介して目的細胞外へ排出させて分離する工程と、
を含む、細胞分離方法。 - 前記トランスポーターを介して標識識別用の特定物質を目的細胞内に取り込ませる工程が、所定の条件で前記目的細胞を所定時間培養する培養工程を含み、
前記分離された目的細胞に取り込まれている標識識別用の特定物質をトランスポーターを介して目的細胞外へ排出させて分離する工程が、前記トランスポーターを通過する標識用特定物質を含まない溶液に該目的細胞を所定時間曝露させる工程を含む、
請求項1記載の細胞分離方法。 - 前記トランスポーターを介して標識識別用の特定物質を目的細胞内に取り込ませる工程が前記目的細胞を含む組織断片の状態で実行され、その後細胞分散処理が行われる請求項1記載の細胞分離方法。
- 細胞分離領域に、トランスポーターを介して標識識別用の特定物質を取り込ませた目的細胞を含む流体が導入される流路および該流路に連結され目的細胞を含む流体を供給するための試料穴と、
前記細胞分離領域に目的細胞を含む流体が導入される流路と並行して配置されるバッファの流路および該流路に連結されバッファを供給するためのバッファ穴と、
前記細胞分離領域に目的細胞を含む流体が導入される流路と前記バッファの流路とが合流する位置より下流側にあり、前記目的細胞を含む流体とバッファの合成された流体が層流で流れる流体中の細胞を観察する流路と、
前記細胞を観察する流路の下流側に形成され、該流路の両側に対向し、かつ、流れに対して位置をずらして配置された二つのゲル電極の開口部と、前記流路の延長線上にある目的細胞回収流路と、前記流路から分岐された細胞排出流路とより構成される前記細胞分離領域と、
前記ゲル電極にゲル電極材料を供給する穴と、
前記細胞排出流路に連結され排出細胞を含む流体を収容するための穴と、
前記目的細胞回収流路の下流側に設けられる細胞透析部と、
前記細胞透析部を通過した目的細胞を含む流体が通過する回収流路と前記回収流路に連結され回収細胞を含む流体を収容するための穴とより構成されるとともに、
前記目的細胞を含む流体を供給するための試料穴とバッファを供給するためのバッファ穴とに共通に連通して設けられたバッファを供給するためのバッファ貯留槽と、
前記排出細胞を含む流体を収容するための穴に連通して設けられた排出細胞とバッファを収容するためのバッファ貯留槽と、
前記回収細胞を含む流体を収容するための穴に連通して設けられた目的細胞とバッファを収容するためのバッファ貯留槽とを備え、且つ、
前記細胞透析部は所定の多孔質のメンブレンを介して前記回収細胞を透析してトランスポーターを介して標識識別用の特定物質を排出させるための透析領域と該透析領域に標識識別用の特定物質を含まないバッファを供給するためのバッファ貯留槽および透析後のバッファを回収するためのバッファ貯留槽を備えることを特徴とする細胞分離チップ。 - 所定の厚さと大きさを持つ基板と、
前記基板の底面に形成された前記各流路および前記ゲル電極と、
前記基板の底面に形成された前記各流路および前記ゲル電極と、それぞれ、連通し、前記基板を貫通する穴と、
前記基板の底面に貼り付けられた透光性の薄膜と、
前記基板の上面に設けられた前記流路と連通した貯留槽と、
前記細胞透析部は前記細胞分離領域の下流域の流路と前記穴との間に設けられた前記基板の底面から上面まで連通した流路と、
前記細胞透析部の前記基板の上面に設けられた多孔質のメンブレンと該メンブレン上に、前記回収細胞を透析するための標識識別用の特定物質を含まないバッファを流通させるスペースと該スペースに供給するバッファの貯留槽とよりなる請求項4記載の細胞分離チップ。 - 細胞分離領域に、トランスポーターを介して標識識別用の特定物質を取り込ませた目的細胞を含む流体が導入される流路および該流路に連結され目的細胞を含む流体を供給するための試料穴と、
前記細胞分離領域に目的細胞を含む流体が導入される流路と並行して配置されるバッファの流路および該流路に連結されバッファを供給するためのバッファ穴と、
前記細胞分離領域に目的細胞を含む流体が導入される流路と前記バッファの流路とが合流する位置より下流側にあり、前記目的細胞を含む流体とバッファの合成された流体が層流で流れる流体中の細胞を観察する流路と、
前記細胞を観察する流路の下流側に形成され、該流路の両側に対向し、かつ、流れに対して位置をずらして配置された二つのゲル電極の開口部と、前記流路の延長線上にある目的細胞回収流路と、前記流路から分岐された細胞排出流路とより構成される前記細胞分離領域と、
前記ゲル電極にゲル電極材料を供給する穴と、
前記細胞排出流路に連結され排出細胞を含む流体を収容するための穴と、
前記目的細胞回収流路の下流側に設けられる細胞透析部と、
前記細胞透析部を通過した目的細胞を含む流体が通過する回収流路と前記回収流路に連結され回収細胞を含む流体を収容するための穴と、
前記目的細胞を含む流体を供給するための試料穴とバッファを供給するためのバッファ穴とに共通に連通して設けられたバッファを供給するためのバッファ貯留槽と、
前記排出細胞を含む流体を収容するための穴に連通して設けられた排出細胞とバッファを収容するためのバッファ貯留槽と、
前記回収細胞を含む流体を収容するための穴に連通して設けられた目的細胞とバッファを収容するためのバッファ貯留槽と、
前記細胞透析部は所定の多孔質のメンブレンを介して前記回収細胞を透析してトランスポーターを介して標識識別用の特定物質を排出させるための透析領域と該透析領域に標識識別用の特定物質を含まないバッファを供給するためのバッファ貯留槽および透析後のバッファを回収するためのバッファ貯留槽を備える細胞分離チップとともに、
該細胞分離チップの前記細胞を観察する流路を流下する細胞を検出する光学系が備えられ、前記流路を流下する細胞が目的細胞であるか否かを判定し、判定結果に応じて、前記ゲル電極に電圧を印加するか否かを決定することを特徴とする細胞分離装置。 - 前記ゲル電極に電圧を印加するのは前記流路を流下する細胞が目的細胞で無いと判定されたときである請求項6記載の細胞分離装置。
- 前記細胞分離チップが同一平面上に複数個並設され、これらのいくつかに共通に標識識別用の特定物質を含まないバッファを供給するための配管および透析後のバッファを回収するための配管を備え、それぞれの貯留槽で中継して前記細胞透析部の該透析領域に標識識別用の特定物質を含まないバッファを供給する請求項6記載の細胞分離装置。
- 前記細胞分離チップが、
基板上に、前記特定物質を取り込ませた前記目的細胞を含む溶液を流すための流路と、
前記流路上に前記細胞の画像を得るための細胞監視領域と、
前記流路上の前記細胞監視領域の下流に配置された、前記細胞の画像に基づいて細胞を分離するための細胞分離領域と、
前記流路上の前記細胞分離領域の下流に配置された、前記分離された目的細胞に取り込まれている標識識別用の特定物質をトランスポーターを介して目的細胞外へ排出するための透析部と、
を備える、請求項1に記載の細胞分離方法。 - 基板上に、トランスポーターを介して標識識別用の特定物質を取り込ませた目的細胞を含む流体を流すための流路と、
前記流路上に前記細胞の画像を得るための細胞監視領域と、
前記流路上の前記細胞監視領域の下流に配置された、前記細胞の画像に基づいて細胞を分離するための細胞分離領域と、
前記流路上の前記細胞分離領域の下流に配置された、前記分離された目的細胞に取り込まれている標識識別用の特定物質をトランスポーターを介して目的細胞外へ排出するための透析部とを備える、細胞分離チップ。 - 前記透析部が、
前記分離された目的細胞を流下させるための流路と、
前記流路と多孔質メンブレンもしくは透析膜により隔てられた標識物質を含まない溶液を流下させるための流路と、
を備える、請求項10に記載の細胞分離チップ。 - トランスポーターを介して標識識別用の特定物質を取り込ませた目的細胞を含む流体を流すための流路、
前記流路上に前記細胞の画像を得るための細胞監視領域、
前記流路上の前記細胞監視領域の下流に配置された、前記細胞の画像に基づいて細胞を分離するための細胞分離領域、および
前記流路上の前記細胞分離領域の下流に配置された、前記分離された目的細胞に取り込まれている標識識別用の特定物質をトランスポーターを介して目的細胞外へ排出するための透析部を備える細胞分離チップと、
前記細胞監視領域において前記細胞の画像を得るための光学系と、
前記細胞分離領域において前記細胞に電界を作用させるための手段と、
を備える、細胞分離装置。
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