JP2004113223A

JP2004113223A - 細胞分離方法、細胞分離装置および細胞分離装置の製造方法

Info

Publication number: JP2004113223A
Application number: JP2002313496A
Authority: JP
Inventors: Zen Takamura; 高村　禅; Hiroyuki Onoda; 斧田　博之; Yasuhiro Horiike; 堀池　靖浩
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-09-23
Filing date: 2002-09-23
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2022-09-23
Also published as: JP4203548B2

Abstract

【課題】特異な特性を有する細胞を選別して抽出し、細胞を評価するために、使い捨て可能な安価なチップ上で細胞分離・分取し、更に後続の工程に細胞を高速に輸送する際、細胞に物理的、化学的影響を与えず行う。
【解決手段】一つのマイクロ流路に導入した細胞を２つの分岐した流路に分離する際、その分岐流路の各々に、電気浸透流ポンプの出入り口用流路が接続される。電気浸透流ポンプは、ギャップの広い流路とポンプ作用を行う狭い流路が２本並べられ、一つの流路として結合し、その両端が出入り口用流路を構成し、この近傍に２本の流路の一端が設けられ、その一端は塩橋からなるゲル電極を介して、接地電位あるいは電圧が印加され、２本の流路の他端は、流路であると同時にゲル電極と接してゲル電極を介して電圧が印加される。このポンプは分岐流路の間に置くだけで独立して動作するので、後段の流路に細胞を次々と送ることができる。
【選択図】　図６

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、種々の細胞を分離・分取する際、その細胞に電気的、化学的ダメージを与えずに行う装置ならびに製作方法に関する。特に、これらの少なくとも一つの機能が少なくとも一体のチップ基板上に集積されており、さらにそのチップ基板は小さく、その取り扱いに専門の医学の知識、資格が必要とせず、簡単に上述の細胞分離を短時間に行うことを特徴とする細胞分離デバイスに関する。
【０００２】
【従来の技術】
個々の細胞の諸性質を高速に決定し、特異な特性を有する細胞を選別して抽出し、単一細胞レベルで培養、計測、分画、ＤＮＡやｍＲＮＡなどの細胞の成分評価などは、生物全般の研究は勿論、病理における診断・治療のためにも極めて重要である。
【０００３】
この細胞分離、即ちセルソータをの研究としては、例えば、蛍光認識した細胞の蛍光により分離する（Ｎ．Ｇｏｒｔｈ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．＆Ｂｉｏｅｎｇ．，７１（４），ｐｐ．２６６−２７３，（２００１）），磁石を担持させた細胞を分離する（Ｓ．Ｍｉｌｔｅｎｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ｔｈｅ　ｍｉｌｌｈｏｕｓｅ　ｍａｎｕａｌ，Ｄｙｓｏｎ：Ａｌｐｈａ　Ｍｅｄ　Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．２０１−２１３，（１９９４））、二本のレーザビームで細胞を捕獲して分離する（Ｓ．Ｃ．Ｇｒｏｖｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．ｏｆ　Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔｉｃｓ，６１（１），ｐｐ．１４−２２，（２００１））などが報告されているが、利点と共にコストや狭い空間での使用は難しいなど欠点もある。一方、生物学や医療の現場での細胞分離装置として、フローサイトメータが広く用いられている。これは、細胞の表面や内部を蛍光標識物質で染色し、光源のレーザからの光束中を１個ずつ通過する細胞から発した散乱光と複数の異なる波長の蛍光などを測定し、蛍光陽性細胞を自動的に算定する装置である。本細胞分離の代表的な装置として米Ｂｅｃｋｍａｎｎ　Ｃｏｕｌｔｅｄ社のＥＰＩＣＳ　ＡＬＴＲＡが広く使用され、３万個／秒の分離能力がある。しかしこれは大規模かつ高価な装置である。しかも、細胞を蛍光標識物質で染色、それに強いレーザ光を照射し、目的の細胞集団を分取（ソーティング）するためには、細胞を含んだ液滴を数千ポルトの電界で荷電させ、更に数千ボルトの電界で偏向して行う。このような外界からの光照射や電界付与受けた細胞はその本来の特性を失うことが懸念される。また、人血の場合、相互汚染を防ぐためには使用後に全系の完全な洗浄が不可欠である。
【０００４】
一方、半導体製品に伴う微細加工技術の進歩を土台に、近年、μ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ　Ｔｏｔａｌ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍ）や、Ｌａｂ．ｏｎ　ａ　Ｃｈｉｐ（チップ上の研究施設）と言われるような、数ｃｍ四方の平板の基板上に種々の薬液の微小流路や微小分析器を配置し、その基板上で種々の化学合成や物理化学分析を行う試みが盛んに行われている。このような、指の先と同寸法のチップ上で前記の化学合成、分析を行う利点として、従来のいわゆる化学実験室のように広い空間や大規模・高価な測定装置を必要とせず、チップ自体が可搬であること、使用する薬液量や分析に必要とされる電力量が著しく少なくなり、環境に優しいなどが挙げられる。このようなチップの一つの大きな応用として、無痛針より採取した極微量の血液をチップ上の数十〜数百μｍの幅と深さを有するマイクロ流路に導入し、当該チップ上において血液から血球を分離し、得られた血漿から健康マーカを測定する使い捨て可能な安価なヘルスケアチップ（特願２００１−２５８８６８）や、ＤＮＡを高速で分離するチップ、プロテインチップなどが、極細の流路内で流体が動くことに基づく微小流体力学（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）の基礎として盛んに研究・開発されている。
【０００５】
上述のμ−ＴＡＳの一応用として、一つのチップ上で細胞を分離・分取するセルソータチップの研究・開発が盛んである。例えば、マイクロ流路内に導いた蛍光標識した細胞に光を当てて生じた蛍光を検出して細胞を水圧により分離し、所望の細胞を並べた小さな容器内に容器を動かし分取する（Ａ．Ｔｒｉｐａｔｈｉ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．ｏｆ　ｔｈｅ　μ−ＴＡＳ２００１　Ｓｙｍｐ．，Ｍｏｎｔｅｒｅｙ，ＣＡ，ＵＳＡ，２１−２５　Ｏｃｔ．，２００１，ｐｐ．３０７−３０８，（２００１））、細胞が通るマイクロ流路の左右にシースフローと呼ばれる流路を並べ、計３本の流路に圧力を掛け、層流を利用して、細胞の分取点で電極が設けられ、電界を掛けないとそのまま細胞は真っ直ぐに流れて分取され、電界を印加すると左右のシースフロー側の流路に細胞が捨てられる（Ｔ．Ｉｃｈｉｋｉ，ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｃ．ｏｆ　ｔｈｅ　μ−ＴＡＳ２００１　Ｓｙｍｐ．，Ｍｏｎｔｅｒｅｙ　ＣＡ，ＵＳＡ，２１−２５　Ｏｃｔ．，２００１，ｐｐ．２７１−２７２，（２００１））などが報告されている。特に後者は極めて巧妙な仕組みを有しているが、細胞の分取に電界を用い、所望の細胞には電界には触れないが、捨てる細胞は電界が印加されているので、その細胞は利用できないことや、シースフロー用流路が必要なため、細胞を更に選別したり、後続の流路に送り込むことがかなり困難である。
【０００６】
細胞をマイクロ流路内を移動させるには、上述のように圧力が広く用いられているが、マイクロチップ内にポンプを有していると、ポンプへの入力によって細胞を分離できる。マイクロ流路を用いたポンプ作用として、電気浸透流を用いたものが知られている。この原理は特願２００１−２５８８６８に述べられている
が、電気浸透流はポンプ力を増すためには、
【００１１】で詳しく説明するように、流路内にギャップの狭い構造の流路の形成が発明された。その結果、従来電気浸透流によるポンプに必要であった数キロボルトの１００分の一に低下が実現した。
【０００７】
前述のように細胞は多くの生命、疾病などの情報を有しており、特にリンパ球は免疫機構の中心であり、免疫応答に対する多くの情報を持っている。非常に多種多様にわたる細胞群を個々に無駄無く分別・処理するにはセルソータ等の様々なデバイスを一つのチップ上に集積化した「細胞コンビナートチップ」なるものが必要であり、このコンセプトは一つのチップ上で機能を集積化し作業を連続化させることによって高速化、高効率化が図られる。更に、人血や異常細胞を取り扱うので、バイオハザードの観点から再使用は許されず、当該チップには使い捨ての安価性が求められる。前述のフローサイトメータのような高価な装置では対応できず、またセルソータ装置は前後の作業を考えると、個々の細胞を取り扱うには適していない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
個々の細胞を分離・分取するためには、まず、マイクロ流路が形成されたマイクロチップ内に低電圧で駆動する強力なポンプを内蔵する必要である。しかし、細胞に電気的な刺激を一切与えないためには、低電圧といえどもポンプに印加される電圧による電界が流路に漏れてはならない。また、電極を経て電圧がポンプに印加されると、電解液の電気分解によりｐＨの変化が生じ、細胞に化学的な影響を与え、この防止も必要である。更に、後続の流路に細胞を伝達して行くには、脈流や電界の漏れ、特に変動するものを発生させてはならない。
【０００９】
本発明の目的は、使い捨て可能な安価な基板を用いて、個々の細胞に電気的、化学的刺激や悪影響を与えずに細胞を分離・分取し、更に後続の工程に細胞を輸送する細胞分離を小さなチップ上で行う方法とその装置、及びその作製方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決させるための手段】
一つのマイクロ流路に導入した細胞を２つの分岐した流路に分離する際、当該２つ分岐流路の各々に、電気浸透流ポンプの出入り口用流路が接続され、当該電気浸透流ポンプは、ギャップの広い流路と狭い流路が２本並べられ、一つの流路として結合し、その両端が当該出入り口用流路を構成し、当該出入り口用流路の位置近傍に２本の流路の一端が存在し、当該一端は塩橋からなるゲル電極を介して、接地電位あるいは電圧が印加され、２本の流路の他端は、流路であると同時にゲル電極と接し、当該ゲル電極を介して電圧が印加されるこれらを機能を一つの使い捨て可能な安価な基板に形成して当該細胞分離チップを作製する。
【発明の実施の形態】
【００１１】
まず、初めに当該発明の根幹をなす低電圧駆動電気浸透流ポンプの原理を説明する。第１図は低電圧化の発見の契機となった電気浸透流ポンプ構造の概略図を示す。（ａ）は平面図で、（ｂ）は断面図であり、流路の（１０１）は石英製である。まず、流路全体に電解液で満たし、（ａ）の（１０２）の注入口と（１０３）の廃液口の間に電圧を印加する。（１０４）のポンプ用流路は（ｂ）図のように１００ｎｍ幅程度の狭いギャップが形成され、当該流路の両端に電界が印加される。ここで、このように狭いとなぜ電気浸透流によるポンプ力が大きくなるかを、第２図（ａ）の広いギャップの流路の場合と第２図（ｂ）の幅の狭いギャップの流路の場合を示して説明する。まず、第２図（ａ）において、（２０１）の石英板の表面（２０２）はＳｉＯ−Ｈのシラノール基で覆われており、石英表面が電解液（２０３）に接触すると、水素が電解液中に逃げて、石英表面は負の電荷（２０４）を帯びる。その負の表面に（２０５）の正イオンが寄って来るが、これは負電圧方向にクーロン力（２０６）で引かれて流れ、電気浸透流となる。その正イオンの周りには水が分極して集まり、水同士は水素結合で結合しているので、結局電解液全体は正イオンの流れの方向に流れる。しかし、ギャップが広い場合、幅の中程に存在する正と負のイオンからなる電解液（２０７）は、幅が広いとはいえ微細な流路故に注入口と廃液口間のコンダクタンスが悪いため閉じた系に近くなり、電気浸透流による圧力を緩和するため逆の方向に流れ、電気浸透流による流れを低下させる。同時に、その正イオン（２０８）と負イオン（２０９）の一部は等量で負と正の電圧方向に引かれ電気泳動によるイオン電流（２１０）が負の方向に流れる。一方、第２図（ｂ）では、電気浸透流の流れは（ａ）と同様だが、流路深さの中央部付近に存在している正イオン（２０８）と負イオン（２０９）が負と正の電圧方向に流れる電気泳動が本来生じるが、これらはほぼ等量なので電気泳動による流れは生ぜず、この結果、表面壁付近の正イオンによる電気浸透流が卓越するようになるため、狭いギャップの方が電気浸透流によるポンプ作用が増す。
【００１２】
第３図は、本発明のセルソータの心臓部の電気浸透流ポンプを構成しているマイクロ流路の概略図を示す。まず、（３０１）の入り口又は出口と（３０２）の深さ１２０ｎｍの流路と（３０３）の接続部の流路と（３０４）の深さ２５μｍの流路と（３０５）の出口又は入り口は、一つの流路で接続されている。流路幅は、（３０２）を除いて３０μｍであり、（３０２）の幅は１００　μｍとした。理由はポンプ流量を増加させるためである。（３０６）と（３０７）はゲル電極（特願２００１−３０４１）である。ゲルはポリアクリルアミド、塩化ナトリウム、光ラジカル重合剤をイソプロピルアルコールに溶解させたものをキャピラリ内に充填させ、蛍光顕微鏡でＵＶ光を照射し、部分的に光硬化させた。ゲル電極で電極と流路を分離した理由は、一つには電気分解によって金属電極表面で発生する気泡のポンプ内への流入によるポンプ圧力の低下を防止し、もう一つは、電解液の電極による電気分解をによるｐＨ変化した溶液を流路への混入を防止することにある。（３０９）と（３１０）は電界印加用電解液溜めであり、（３１１）と（３１２）は金属電極である。全流路に電解液で満たし、電極（３１１）は接地にし、（３１２）に正負の電圧を印加すると、ゲル電極を介して、（３０２）と（３０４）流路に同電圧が印加されるが、（３０２）と（３０４）の流路には電気浸透流ポンプ作用が同方向に働くため一つの流路のポンプ作用としては
逆になる。しかし、
【００１１】で述べたように、狭いギャップの（３０２）の流路には広いギャップの（３０４）と比べて圧倒的に電気浸透流ポンプ作用は強く、（３０２）の流路のポンプ作用が（３０４）のそれを凌駕し、当該一つの流れを（３０２）のポンプ作用が実質的に支配する。ここで、（３０２）と（３０４）の位置は入れ替えても等価なので同じ動作をする。（３１４）に正負の電圧を印加するとポンプの流れの方向を順方向と逆方向に変えることができ、（３０１）と（３０５）から吸入、放出を行う。
【００１３】
本発明の実施では石英基板を用いたが、理由はゼータ電位が高いためであり、安価な使い捨てチップにするためには、基板はＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）のような高分子ポリマーの使用が望ましい。しかし、高分子ポリマーのゼータ電位は一般に低く、従って、流路基板はＰＥＴなどで製作し、ポンプ部にはゼータ電位の高い物質、例えばＣＶＤによりＳｉ酸化膜をコートするとか、石英で予め製作しておいたポンプをはめ込むことで本課題はゼータ電位解決できる。
【００１４】
第４図は、セルソータの動作原理を示す概略図である。（４０１）は第３図に占めした電気浸透流ポンプを示す。まず、状態（ａ）では電気浸透流ポンプ（４０１）は作動してなく、外部のシリンジポンプ（４０２）による定常的な流れにより、細胞（４０３）は移動する。ここで、（ｉ）は流路（４０４）であり、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）はポンプの出入り口までの流路（４０５）、（４０６）を示す。（４０７）と（４０８）は電気浸透流ポンプ（４０１）出入り口である。状態（ａ）では、（ｉ）と（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の流量比は、流れの矢印で示すように２：１：１である。次に（ｂ）状態で細胞（４０３）が分岐点（４０９）に達したときにポンプ（４０１）をある流量１で作動させ、細胞（４０３）を例えば左側の流路（４０５）に分別する。細胞（４０３）が流路（４０５）に取り込まれた後、（ｃ）状態で第３図の電界印加用電解液溜めの（３０６）と（３０７）の：ゲル電極により、電解液が僅かに電気分解されて生じるｐＨ変動を防ぐために同時間で逆方向にポンプを作動させ、（４０８）から流れはポンプへ向かう。このとき、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の流量比は状態（ｂ）で２：２：０、状態（ｃ）で２：０：２である。（ｉｖ）と（ｖ）は、ポンプの出入り口の後の流路（４０９）、（４１０）を示し、夫々流路（４０３）と（４０６）に接続している。いずれの状態でも（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）の流量比は常に２：１：１にする。これらのサイクルを繰り返すことにより細胞を分取する。
【００１５】
【実施例】
第５図は、第３図で示した電気浸透流ポンプの変形例の概略図を示す。第３
図において、（３０９）の電極は接地したが、
【００１１】で説明したように、（３０２）では内壁近くの正イオンのみが電気浸透流として流れるが、（３０４）のギャップの広い流路では、中心付近の正イオンと負イオンが等量で電気泳動によって流れるため電流を発生し電圧降下を起こす。そのため、（３０１）の電位は（３０５）の電位と比べて若干高くなる。測定では、（３１２）へ２０Ｖの電圧を印加すると、（３０１）の電位と（３０５）の電位の差は印加電圧の約１０％の２Ｖとなった。しかし、２Ｖの電位差でもマイクロ流路では寸法がμｍオーダなので電界はそう低くなく、細胞に影響を与えることが懸念される。従って、（３０１）の電位と（３０５）の電位を同電位にするため、第４図では、第３図の（３０９）を（５０１）と（５０２）に分割し、例えば、（５０３）の電極に−２Ｖを印加し、（５０４）の電極は接地する。又は、（５０３）の電極は接地し、（５０４）の電極に＋２Ｖを印加する。
【００１６】
第６図は当該細胞分離チップの平面図の概略図である。（６０１）は細胞の導入口、（６０２）は流路分岐の分岐点、（６０３）は当該電気浸透流ポンプ、（６０４）は出入り口側のゲル電極と接続された液溜め、（６０５）は高電圧印加用液溜め、（６０６）は細胞の取り出し口である。
【００１７】
第６図に示した当該細胞分離チップの製作プロセスを以下に示す。２０ｍｍ×２０ｍｍ×０．５ｍｍの石英板上にクロム膜をスパッタで作製し、フォトリソグラフィでパターンニングした。これをハードマスクにしてフロロカーボン系ガスでドライエッチングし、溝パターンを作製した。これと、超音波加工機でリザーバ用の孔を開けた他の一枚の石英板のキャップを１％ＨＦディップ後、１．３ＭＰａの圧力で２４時間放置して圧着させ、マイクロチップとした。
【００１８】
第７図は、第６図に示した当該細胞分離チップを使用してリンパ球のＢとＴ細胞に分離する際。マイクロチップの流路の内壁を生態適合化した効果を示す。実験はリンパ球は５週令のＳＰＦ、ウィスター系ラット腸間膜中のリンパ節から抽出、精製後、ＨＢＳＳ（ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｈａｎｋ’ｓ　ｂａｌａｎｃｅｄ　ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）緩衝液を加え、６×１０３／ｍｌの濃度にしたものを使用した。キャピラリ内壁を生体適合化し、リンパ球の吸着を防ぐためにシランカップリング基をもつＭＰＣポリマー（２−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；参考文献Ｋ．Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｈ．Ｏｓｈｉｄａ，Ｔ．Ｕｅｄａ，Ｙ．Ｅｎｄｏ，Ａ．Ｗａｔａｎａｂｅ　ａｎｄ　Ｎ．Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ：Ｊ．Ｂｉｏｍａｔ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ：２６（１９９２）１５４３．）で表面処理した。生体適合性を評価するためにリンパ球を２５μｌ／ｓで流し、キャピラリ底面に吸着するリンパ球数を計測した。（７０１）と（７０２）はＭＰＣポリマーを石英内壁にコートの有り、無しの細胞の平方ｍｍ当たりの単位秒での付着個数を示す。（７０１）のＭＰＣポリマーを石英内壁にコートの有りの場合、吸着率が１／２００以下に抑えられ、付着防止効果に優れていることが分かる。
【００１９】
第８図は、
【００１３】に述べた動作により実際にリンパ球を輸送・分離した際の流速を測定したものである。（８０１）、（８０２）、（８０３）は、第４図の各動作状態に対応しており、（８０１）は定常状態（ａ）、（８０２）は左側の輸送状態（ｂ）、（８０３）は右側の輸送状態（ｃ）の各状態における流速である。（８０４）、（８０５）、（８０６）はそれぞれの場所（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）を表している。（８０１）の定常状態での流速は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の各部位で２：１：１であり、これが（８０２）と（８０３）では２：１：０、２：０：１となり、ほぼ設計どおりであることがわかる。また（ｉ）での流速は、（８０１）、（８０２）、（８０３）の各動作状態で、８３μｍ／ｓ±３μｍ／ｓであり、脈流は５％内に抑えられていることがわかる。
【００２０】
第９図は、当該細胞分離チップにより細胞を分別するための、外部駆動回路の動作の一例である。（ａ）に示すように、分別対象（９０１）が検出地点（９０２）を通過するとき、蛍光強度などから、右の流路に分別するか左の流路に分別するかを決定する。例えば蛍光強度がある閾値（９０５）を超えたものを左に分別するには、（ｂ）に示すように蛍光強度をコンパレータで比較することによって、左分別対象検出信号（９０６）を得る（（ｃ））。この信号を基に、タイマー１（９０７）を働かせ、分別対象（９０１）が分岐点（９０３）までの距離（９０４）を移動するための時間（９０８）待つ。つぎにこのタイマー１（９０７）の立下りをトリガーとしてタイマー２（９０９）を駆動する。このタイマー２の信号でポンプを左輸送状態に駆動する。タイマー２は、分別対象を左の流路に送り込むための十分な時間（９１０）を計時しオフとなる。この立下りを待ってタイマー３（９１２）がオンとなり、この信号を基に、リカバリーのためにポンプは右輸送状態で駆動される。リカバリー時間（９１３）を計時後、タイマー３（９１２）がオフとなり、一連の動作がおわる。
【００２１】
第１０図は、当該セルソータの変形例の一つであり、第４図で説明したものとは、入り口が（１００１）と（１００２）の２つあるところが異なる。その動作は第４図とほぼ同じであるが、第４図では、（４０４）からきた（４０３）が、（ｂ）の状態では、（４０５）へ、（ｃ）の状態では（４０６）へ分別されるところ、第１０図では、（１００１）、（１００２）のどちらからきた（４０３）も（ｂ）の状態では、（４０５）へ、（ｃ）の状態では（４０６）へ分別される。流速の比は、第４図では、（４０４）：（４０９）：（４１０）は常に２：１：１であったが、第１０図では（１００１）：（１００２）：（４０９）：（４１０）は常に１：１：１：１である。また、重要なのは（４０１）が動作していない（ａ）の状態では、第４図では、（４０３）はどちらの流路に分岐するかわからないが、第１０図では、（１００１）からきたものは（４０５）側へ、（１００２）からきたものは（４０６）側に分岐される。したがって、いくつもの細胞が混ざったものから、あるものだけを（４０５）へ分別したいような場合、第４図のものでは、（４０５）へ分岐するものも（４０６）へ分岐するものも、両方とも検出して、（４０１）を駆動する必要があったが、第１０図のものでは、（１００２）から（４０３）を流し、（４０５）側へ分別するものだけを検出して（４０１）を駆動し、それ以外はすべて（４０６）側へ流すといった使い方が可能である。
【００２２】
第１１図は、本セルソータの接続の一例である。脈流と電界を外に漏らさないために、この図のように自由に接続できる。
【００２３】
第１２図は、本ソータの利用形態の一例であり、全血からＴ型リンパ球をダメージレスでより分けるものである。第１２図（ａ）はその主要部であり、入り口（１２０１）から、全血や、全血を遠心分離後の沈殿など、血球が含まれる液を流す。流路の内壁など、血球や血の成分と接触するところは、必要に応じてＭＰＣポリマーコーティング等で生態適合化が施される。この液は、まず染色剤リザーバ（１２０２）内の、染色剤と混合される。染色剤にはＢ型リンパ球と特異的に結合する蛍光抗体が入っている。混合された試料液は、反応用流路（１２０３）を通過する間に染色される。染色された血球は最初のセルソータ（１２０４）で、リンパ球とそれ以外（主に赤血球）に分別する。リンパ球と赤血球は、可視吸光や散乱強度、画像の特徴などにより分別できる。次にリンパ球を次のセルソータ（１２０５）で、Ｔ細胞とＢ細胞に分別する。Ｂ細胞は蛍光抗体により染色されているので、蛍光強度により分別可能である。
第１２図（ｂ）は、さらに処理速度を上げるためにこれを並列に並べたものである。例えばリンパ球は赤血球よりも遥かに少なく１０００個に１個程度であり、数を得るためには大量の赤血球を処理しなくてはならない。本セルソータは非常に小さいので、用意に並列化し処理速度を上げることが可能である。例えば、ひとつのソータが２００μｍの大きさとすれば、２ｃｍの中に１００個を集積化可能であり、１００倍の処理速度が得られる。第１２図（ｂ）では、無痛針（１２０９）で採取された血液を、まず遠心分離により血球と血漿にわける。次に血球を含む液（１２１０）はポンプ（１２１２）により、第１２図（ａ）で説明した分離要素（１２１３）に輸送され、Ｔ型リンパ球とそれ以外の細胞に分別される。Ｔ型リンパ球は、分取路（１２１４）に集められ、それ以外の細胞は廃細胞溜（１２１５）に集められる。
【００２４】
【発明の効果】
以上のように、細胞の分離・分取を細胞に電気的、化学的なダメージを与えずに行うため、電気浸透流ポンプの出入り口の電位を接地電位近傍で同じ電位にし、更にゲル電極を用いて流路内をｐＨ変動を起こさせず、ｐＨ変動が僅かに起こってもポンプの逆流により中和するような構造を細胞の分離・分取用マイクロチップ内に内臓させたため、例えばリンパ球からＢとＴ細胞を細胞が生きたまま分離できた。このチップは安価であるため、異常細胞を分離して診断・治療に活用しても、使い捨てができ、バイオハザードが防止される。また、チップ面積は小さくても、種々の機能が集積化できるため、従来多量の血液や検体を必要としていた医療現場では、それらが極少量で検査ができるので、患者にとって大変な福音をもたらすと共に、短期間に検査できるので、無痛針を設けたチップではベッドサイドのみならず、在宅でも高度診断が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】低電圧化電気浸透流ポンプ構造の概略図である。（ａ）は平面図、（ｂ）は断面図である。
【図２】（ａ）の広いギャップの流路の場合と（ｂ）の幅の狭いギャップの流路の場合に対する電気浸透流と電気泳動を説明する図である。
【図３】本発明のセルソータの電気浸透流ポンプの概略図である。
【図４】セルソータの動作原理を示す概略図である。
【図５】第３図で示した電気浸透流ポンプの変形例の概略図である。
【図６】細胞分離チップの平面図の概略図である。
【図７】第６図に示した細胞分離チップの内壁のＭＰＣポリマーコートの有無によるリンパ球の付着率を示す図である。
【図８】第４図に述べた動作によりリンパ球を輸送・分離した際の流速測定を示す図である。
【図９】当該細胞分離チップにより細胞を分別するための外部駆動回路の動作の一例を示す図である。
【図１０】当該セルソータの変形例を示す図である。
【図１１】当該セルソータの接続の一例を示す図である。
【図１２】（ａ）当該ソータの利用形態の一例を示す図である。
（ｂ）当該ソータの並列化による全血の血球分離、白血球からＴ、Ｂ細胞分離利用の形態の一例を示す図である。
【符号の説明】
（１０１）　　石英製流路
（１０２）　　注入口
（１０３）　　廃液口
（１０４）　　ポンプ用流路
（２０１）　　石英板
（２０２）　　石英表面
（２０３）　　電解液
（２０４）　　負の電荷
（２０５）　　正イオン
（２０６）　　クーロン力
（２０７）　　電解液
（２０８）　　正イオン
（２０９）　　負イオン
（２１０）　　イオン電流
（３０１）　　入り口又は出口
（３０２）　　深さ１２０ｎｍの流路
（３０３）　　接続部の流路
（３０４）　　深さ２５μｍの流路
（３０５）　　出口又は入り口
（３０６）　　ゲル電極
（３０７）　　ゲル電極
（３０９）　　電界印加用電解液溜め
（３１０）　　電界印加用電解液溜め
（３１１）　　金属電極
（４０１）　　電気浸透流ポンプ
（４０２）　　外部のシリンジポンプ
（４０３）　　細胞
（４０４）　　流路
（４０５）　　ポンプの出入り口までの流路
（４０６）　　ポンプの出入り口までの流路
（４０７）　　電気浸透流ポンプ
（４０８）　　出入り口
（４０９）　　流路
（４１０）　　流路
（５０１）　　電解液溜め
（５０２）　　電解液溜め
（５０３）　　電極
（５０４）　　電極
（６０１）　　細胞の導入口
（６０２）　　流路分岐の分岐点
（６０３）　　電気浸透流ポンプ
（６０４）　　出入り口側のゲル電極と接続された液溜め
（６０５）　　高電圧印加用液溜め
（６０６）　　細胞の取り出し口
（７０１）　　ＭＰＣポリマーを石英内壁にコートの有りの効果
（７０２）　　ＭＰＣポリマーを石英内壁にコートの無しの効果
（８０１）　　定常状態（ａ）における流速
（８０２）　　左側の輸送状態（ｂ）における流速
（８０３）　　右側の輸送状態（ｃ）における流速
（８０４）　　流路（ｉ）
（８０５）　　流路（ｉｉ）
（８０６）　　流路（ｉｉｉ）
（９０１）　　分別対象
（９０２）　　検出地点
（９０３）　　分岐点
（９０４）　　分岐点までの距離
（９０５）　　閾値
（９０６）　　左分別対象検出信号（９０６）
（９０７）　　タイマー１
（９０８）　　分岐点までの距離を移動するための時間
（９０９）　　タイマー２
（９１０）　　分別対象を左の流路に送り込むための十分な時間
（９１２）　　タイマー３
（９１３）　　リカバリー時間
（１００１）　入り口
（１００２）　入り口
（１２０１）　入り口
（１２０２）　染色剤リザーバ
（１２０３）　反応用流路
（１２０４）　セルソータ
（１２０５）　セルソータ
（１２０９）　無痛針
（１２１０）　血球を含む液
（１２１３）　ポンプ
（１２１４）　分離要素
（１２１５）　廃細胞溜

Claims

一つあるいは複数の基板内に形成された少なくとも１つの流路から複数本接続された流路に細胞を導入手段と、導入した細胞を流路に流入させる手段と、少なくとも１つの流路に導入された細胞を複数の分岐した流路に分離される際、分岐流路の各々に電気浸透流ポンプの２つの出入り口の流路が接続され、当該電気浸透流ポンプは、ギャップの広い流路と狭い流路が少なくとも２本並べられ、一つの流路として結合し、その両端が当該出入り口用流路を構成し、当該出入り口用流路の位置近傍に２本の流路の一端が存在し、当該一端は塩橋からなるゲル電極を介して接地電位が印加され、２本の流路の他端は、流路であると同時にゲル電極と接し、当該ゲル電極を介して電圧が印加されることから構成されたことを特徴とする細胞分離装置。
請求項１記載の細胞分離装置は、全血から赤血球と白血球に分離し、白血球からＴ細胞とＢ細胞に分離することを特徴とする細胞分離装置。
請求項１記載の当該細胞を流路に導入する手段は圧力を使用することことを特徴とする細胞分離装置。
請求項１記載の少なくとも細胞が輸送される流路の内壁はＭＰＣポリマーがコートされることを特徴とする細胞分離装置。
請求項１記載のチップに採血手段とろ過や遠心分離を用いた血球分離手段と細胞標識手段を少なくとも備えたことを特徴とする細胞分離装置。
請求項１記載の細胞分離装置を構成する基板がポリマー樹脂で構成されていることを特徴とする細胞分離装置。
請求項６記載のポリマー樹脂の電気浸透流ポンプ部はゼータ電位の高い基板を用いたことを特徴とする細胞分離装置。
請求項１記載の電気浸透流ポンプは、細胞を分離すると同時に逆方向にポンプを作動させることを特徴とする細胞分離装置。
請求項１記載の電気浸透流ポンプの出入り口近傍に存在するゲル電極と電解液溜めを二分割し、電解液溜め中の金属電極において、一方の電極は接地電位であり、他の電極に電圧を印加して当該出入り口用流路の電位が等しくなるようにした電気浸透流ポンプであること特徴とする細胞分離装置。