KR20220150266A - 루테리온 및 그 분리·배양방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미토콘드리아 유사 미세물질인 루테리온, 이 의 분리방법 및 배양방법에 관한 것으로, 구체적으로는 특정 크기의 공극을 가지는 필터를 이용하여 루테리온을 분리하는 방법, 이러한 방법에 의해 분리된 특정 특성을 가지는 루테리온 및 이를 증식시키 는 배양방법에 관한 것이다.

Description

루테리온 및 그 분리·배양방법 {Luterion and Method for Isolating and Culturing the Same}
본 발명은 미토콘드리아 유사 미세물질인 루테리온, 이의 분리방법 및 배양방법에 관한 것으로, 구체적으로는 특정 크기의 공극을 가지는 필터를 이용하여 루테리온을 분리하는 방법, 이러한 방법에 의해 분리된 특정 특성을 가지는 루테리온 및 이를 증식시키는 배양방법에 관한 것이다.
본 출원의 발명자들은 환자 또는 정상인에서 기 배출된 체액 내에 존재하는 미세물질인 루테리알을 효과적으로 분리할 수 있는 방법을 개발하고, 분리된 루테리알의 특성을 규명한 내용을 2014년 5월 9일자로 특허출원 한 바 있다(WO2015/108246). 또한, 환자에서 기 배출된 체액 내에 존재하는 미세물질의 특성을 관찰함으로써 질병을 진단 및 예측할 수 있음을 발견하고 이에 대한 내용을 2014년 1월 14일자로 특허출원을 한 바 있다(WO2015/005553).
이러한 루테리알은 (1) 원핵세포와 진핵세포의 중간단계 융합특성을 지닌 세포 또는 세포유사체로써; (2) 혈액, 정액, 장액, 타액 세포액 등의 체액에 존재하며; (3) 면역형광시험에서 야누스 그린 B(Janus green B), 아크리딘 오렌지(Acridine Orange), 및 로다민123(Rhodamine123)에 양성의 발색반응을 나타내고; (4) 최적상태(pH 7.2~7.4)에서는 베타-프로티오박테리아와 감마-프로티오박테리아 유래 유전자의 발현특성을 나타내고, 30~800 nm의 크기를 가지고; (5) 산성화 상태에서는 베타-프로티오박테리아와 감마-프로티오박테리아 유래 유전자뿐만 아니라, 진핵세포 유래 유전자의 발현특성을 나타내는데, 주로 Sterptophyta 유전자와 Homologue 특징이 나타나며, 400 nm 이상부터 2000 nm 이상까지 크기가 커지며; (6) 정상조건에서 ATP 생성에 관여하고; 및 (7) 미토콘드리아와는 상이하고, 엑소좀과는 전혀 다른 세포 또는 세포 유사체이다.
이러한 루테리알은 주로 사람을 포함한 동물의 혈액 내에 존재하는 데 반해, 루테리알과 유사한 구조와 가능을 가지는 미세물질인 주로 식물 또는 식품에 존재하는 루테리온(Luterion)의 존재를 확인하였다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자는 루테리온을 임상에 적용할 수 있도록 효과적으로 분리 및 배양하기 위하여 예의 노력한 결과, 식물 또는 식품에 용매를 첨가하고 진탕시키면서 발생하는 기화 가스를 수집한 다음, 필터링 및 원심분리를 통해 상기 기화가스에 함유된 루테리온을 효과적으로 분리할 수 있고, 이로부터 분리된 루테리온을 특정 조건 및 배지 중에서 배양할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 루테리온을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 특정 크기의 공극을 포함하는 필터를 이용하여 루테리온을 임상에 적용할 수 있도록 효과적으로 분리하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 루테리온의 효과적 배양방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음에서 선택된 하나 이상의 특성을 가지는 루테리온을 제공한다:
(a) 50~800nm의 원형 내지 타원형으로, 운동성이 있음;
(b) 핵산 함유;
(c) 면역화학형광염색시 미토콘드리아와 유사한 반응을 나타냄;
(d) 퓨전(fusion) 및/또는 피션(fission) 생태양식을 나타냄;
(e) 퓨전이 없을 경우 크기가 500nm까지 성숙하고, DNA 함유 유사 미토콘드리아로 성숙하며, SEM 또는 TEM 전자현미경사진상에서 미토콘드리아와 유사한 구조를 나타냄;
(f) 엑소좀과는 다른 빛 반응을 나타냄;
(g) IR 조사시 또는 가압시 피션 (fission)이 발생함;
(h) 표면항원으로 CD332, CD133, CD73 또는 CD39를 발현함;
(i) 자가형광 (autofluorescence)을 나타냄;
(j) 200~400nm 크기에서 ATP를 생성함;
(k) 이중막 또는 다중막 구조;
(l)부착성이 있음;
(m) 암세포의 텔로머라제 활성 억제;
(n) 정상세포의 텔로머라제 활성 촉진;
(o) 세포 투과능 보유; 및
(p) 혈뇌장벽 (BBB) 투과능 보유.
본 발명은 다음 단계를 포함하는 루테리온의 분리방법을 제공한다: (a) 식물 또는 식품의 수증기 또는 가스 진탕 추출물을 냉각하여 수득한 응축액을 0.8~1.2μm의 공극을 가지는 필터를 이용하여 필터링하는 단계;
(b) 상기 필터링된 응축액을 원심분리하는 단계; 및
(c) 상기 원심분리된 상등액으로부터 루테리온을 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 루테리온의 분리방법을 제공한다: (a) 루테리온을 함유하는 추출물에 루테리온 표면항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머가 고정된 입자를 첨가하여 루테리온과 입자의 결합을 유도하는 단계; 및 (b) 상기 입자에 결합된 루테리온을 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 루테리온에 수분을 첨가하고 IR광선 조사 또는 가압하에 18~30℃에서 증식시키는 단계를 포함하는 루테리온의 배양방법을 제공한다.
본 발명은 더욱이, 상기 루테리온을 당 포함 배지에서 pH 5-9 및 18~30℃ 조건으로 증식시키는 단계를 포함하는 루테리온의 배양방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 식물 또는 식품 내에 존재하는 미세물질인 루테리온을 효과적으로 분리할 수 있고, 상기 분리된 루테리온을 일정 크기로 성장하도록 배양할 수 있어, 질병의 예방 및 치료를 위한 다양한 용도 개발에 이용할 수 있다.
도 1은 루테리온을 공초점 레이저 주사현미경 (Confocal Laser Scanning Microscope, Zeiss)으로 촬영한 사진으로 그 크기를 함께 나타낸 것이다.
도 2는 루테리온을 미토트랙커(Mito-tracker)로 염색한 다음, 그 발색 유무를 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 루테리온을 로다민123(Rhodamine123)으로 염색한 다음, 그 발색 유무를 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 루테리온의 형광/비형광 사진을 비교하여 나타낸 것이다 (A: 야누스 그린B(Janus Green B) Positive; B: 로다민 123(Rhodamine 123) Positive; C: 미토트랙커(Mito-tracker) Red Positive; D: 무염색).
도 5는 루테리온이 로다민 123, 미토트랙커 레드, 야누스 그린B(Janus green B)에 의하여 공통적으로 염색한 뒤 그 발색 유무를 나타낸 것이다 (A: 야누스 그린B(Janus Green B) Positive; B: 로다민 123(Rhodamine 123) Positive; C: 미토트랙커(Mitotracker) Red Positive; D: 무염색).
도 6은 루테리온의 형광 염색 부위 크기를 측정하여 루테리온의 크기(50~800nm)를 나타낸 것이다 (A: 야누스 그린B(Janus Green B) 반응 크기 측정; B: 로다민 123(Rhodamine 123) 반응 크기 측정; C: 미토트랙커(Mito-tracker) Red 반응 크기 측정: D: 무염색 반응 크기 측정).
도 7은 정상적인 루테리온의 life cycling A와 돌연변이된 루테리온의 life cycling B를 나타낸 것이다.
도 8은 루테리온이 이중막 구조를 가진다는 것을 확인한 TEM 전자 현미경 사진이다.
도 9는 루테리온이 내부에 핵산을 함유하는 것을 확인한 원자 현미경 사진이다.
도 10a는 루테리온 내부에 RNA가 함유되어 있는지 여부를 분석한 바이오 아날라이저 결과이다 (L: control; 1: 50nm이하, 2: 50∼100nm, 3: 100∼200nm, 4: 200∼400nm).
도 10b는 200~400nm 루테리온의 전체 RNA를 나타낸 것이다.
도 11은 5,000 psi 및 10-20℃ 조건에서 루테리온의 피션 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 15,000 psi 및 10-20℃ 조건에서 루테리온의 피션 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 35,000 psi 및 10-20℃ 조건에서 루테리온의 피션 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 루테리온을 PKH26-1, PKH26-2, PKH26-3 적색형광으로 형광 염색하여 핵 내로 루테리온이 도입되는 결과를 나타낸 것이다.
도 15 및 도 16은 적색형광으로 형광 염색된 루테리온이 세포 내 핵으로 도입됨을 확대하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 형광 염색된 루테리온을 경구 위관투여한 결과를 나타낸 것이다.
도 18 및 도 19는 형광 염색된 루테리온을 복강 내 주사한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 루테리온 처리에 의한 정상세포(Fibroblast) 및 암세포(폐암, 유방암, 대장암)에서의 텔로머라아제 활성을 나타낸 것이다.
도 21은 루테리온 처리 농도에 따른 정상세포(Fibroblast) 및 여러가지 암세포(폐암, 유방암, 대장암, 간암, 백혈병)의 세포 생존능을 나타낸 것이다.
도 22는 다양한 유래의 루테리온을 처리한 췌장암 세포주(AsPC-1)에서의 세포 증식 억제를 나타낸 것이다.
도 23은 다양한 유래의 루테리온을 처리한 폐암 세포주(A549)에서의 세포 증식 억제를 나타낸 것이다.
도 24는 다양한 유래의 루테리온을 처리한 유방암 세포주(BT-20)에서의 세포 증식 억제를 나타낸 것이다.
도 25는 루테리온 처리에 의한 정상세포(Fibroblast)에서의 텔로머라아제 활성을 나타낸 것이다.
도 26은 루테리온 처리에 의한 ATP 생성 및 억제 여부를 확인하기 위한 ATP 어세이 디자인에 대한 모식도이다.
도 27은 Carl Zeiss의 스캐닝 전자현미경(SEM)으로 루테리온을 촬영한 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 Bruker Fast Scan AFM 원자현미경으로 루테리온을 촬영한 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 루테리온을 항-CD39 항체 결합 및 미토트랙커(Mito-tracker), DAPI 에 의하여 공통적으로 염색한 뒤 그 발색 유무를 각각 또는 병합하여 나타낸 것이다.
도 30은 루테리온을 항-CD73 항체 결합 및 미토트랙커(Mito-tracker), Hoechst에 의하여 공통적으로 염색한 뒤 그 발색 유무를 각각 또는 병합하여 나타낸 것이다.
도 31은 루테리온이 항-CD332 항체에 양성인지 여부를 형광 발광을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 루테리온이 항-CD133 항체에 양성인지 여부를 형광 발광을 통해 확인한 결과를 나타낸 것으로 상단은 PE(Phycoerythrin) 형광염색한 결과를 나타낸 것이고, 하단은 항-FITC로 형광염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 33은 루테리온 표면항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 입자에 탄소, 카르복실기 코팅을 하는 단계를 나타낸 것이다.
도 34는 루테리온과 자성입자가 고정된 루테리온 표면항원에 특이적으로 결합하는 항체가 결합된 복합체를 자석을 사용하여 분리하는 단계를 나타낸 것이다.
도 35는 루테리온 분리 후 현광현미경으로 촬영한 사진을 나타낸 것으로, a는 루테리온을 나노필터를 사용하여 분리한 후 현광현미경으로 촬영한 사진을 나타낸 것이고, b는 루테리온을 루테리온 표면항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 입자를 이용한 분리방법을 사용하여 분리한 후 현광현미경으로 촬영한 사진을 나타낸 것이며, c는 루테리온을 나노필터를 사용하여 분리한 후 전자현미경으로 촬영한 사진을 나타낸 것이고, d는 루테리온을 루테리온 표면항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 입자를 사용한 분리방법을 사용하여 분리한 후 전자현미경으로 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 36은 루테리온의 추출수를 나타낸 것으로, a는 루테리온을 나노필터를 사용하여 분리한 후 루테리온의 추출수를 나타낸 것이고, b는 루테리온을 루테리온 표면항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 입자를 사용한 분리방법을 사용하여 분리한 후 루테리온 추출수를 나타낸 것이다.
도 37은 루테리온의 추출 단계를 구체적으로 도시한 모식도이다.
도 38은 루테리온 처리에 의한 암세포에서의 ATP 생성 감소를 나타낸 것이다.
도 39는 루테리온 처리에 의한 정상세포(Fibroblast)에서의 ATP 생성을 나타낸 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서 사용하는 용어 "루테리알(luterial)" 및 "루테리온(luterion)"은 동물 및 식물을 포함하는 모든 생명체에 존재하는 50~400nm 크기의 나노생명체로, 바이러스와 유사한 정도부터 퓨젼시 800~1200 nm까지의 크기를 가지는 반면, 1200nm 이상에서 유전자 이상 및 병리 현상을 발현하는 변이체로 분류되는 미세물질을 본 발명자가 명명한 것이다.
상기 루테리알 및 루테리온은 DNA 및 RNA를 포함하며, 운동성과 부착성을 가진다는 점에서 엑소좀(exosome)이나 미소포(microvesicle)와는 구별된다. 미토콘드리아는 야누스 그린 B(Janus green B) 및 형광염색인 로다민123(Rhodamine123), 미토트랙커(Mitotracker), 아크리딘 오렌지(Acridine Orange), 및 DAPI에 의해 발색이 확인되는데, 상기 루테리온 및 루테리알도 미토콘드리아와 동일한 염색약에 의해 발색이 확인되며(도 1 ~ 도 6), 미토콘드리아와 유사하게 이중막을 가진 막구조로서 내부 크리스테(cristae) 구조를 완성하지 않은 상태의 구조를 가지고, 미토콘드리아와 동일한 레이저 파장 범위에서 관찰된다는 점에서 "유사 미토콘드리아", "미토콘드리아 유사체" 혹은 "미토콘드리아 전구체 (proto-mitochondria)"라고도 지칭할 수도 있다.
루테리알은 생태계에서 숙주 체내에 존재하는 나노 생명체의 의미하고, 인간을 포함한 동물의 경우에는 혈액, 타액, 림프관, 정액, 질액, 모유(특히, 초유), 제대혈, 뇌세포, 척수, 골수에 존재할 수 있다. 반면, 루테리온은 숙주가 음식물 등으로 사용할 수 있는 나노 생명체를 의미하고, 식물이나 식품에 주로 존재할 수 있다.
루테리온은 혈액 유래 루테리알과는 달리 실온에서도 빠른 시간 내에 용해되거나 소멸되지는 않으며, 장기간 보관하여도 퓨전(fusion)하여 돌연변이화되지 않는 특성이 있다.
본 발명은 일 관점에서, 다음 중 선택된 하나 이상의 특성을 가지는 분리된 루테리온에 관한 것이다:
(a) 50~800nm의 원형 내지 타원형으로, 운동성이 있음;
(b) 핵산 함유;
(c) 면역화학형광염색시 미토콘드리아와 유사한 반응을 나타냄;
(d) 퓨전(fusion) 및/또는 피션(fission) 생태양식을 나타냄;
(e) 퓨전이 없을 경우 크기가 500nm까지 성숙하고, DNA 함유 유사 미토콘드리아로 성숙하며, SEM 또는 TEM 전자현미경사진상에서 미토콘드리아와 유사한 구조를 나타냄;
(f) 엑소좀과는 다른 빛 반응을 나타냄;
(g) IR 조사시 또는 가압시 피션 (fission)이 발생함;
(h) 표면항원으로 CD332, CD133, CD73 또는 CD39를 발현함;
(i) 자가형광 (autofluorescence)을 나타냄;
(j) 200~400nm 크기에서 ATP를 생성함;
(k) 이중막 또는 다중막 구조;
(l)부착성이 있음;
(m) 암세포의 텔로머라제 활성 억제;
(n) 정상세포의 텔로머라제 활성 촉진;
(o) 세포 투과능 보유; 및
(p) 혈뇌장벽 (BBB) 투과능 보유.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 루테리온은 생명인자 (living organism)로서, 바이러스와 유사한 정도부터 약 500nm까지 (정상 피션단계 50~500nm/ 비정상 퓨전단계 800nm이상)의 크기를 가지는 미세물질을 본 발명자가 명명한 것이다. DNA 및/또는 RNA를 포함하며, 운동성을 가진다는 점에서 미소포(microvesicle)와는 구별된다. 또한, 자가형광 (autoflurescence) 및 광합성의 특성을 가진다. 미토콘드리아는 형광염색인 로다민123(Rhodamine123), 미토트랙커(Mitotracker), 아크리딘 오렌지(Acridine Orange), DAPI, 및 야누스 그린 B (Janus green B)에 의해 발색이 확인되는데, 루테리온도 미토콘드리아와 동일한 상기 염색약에 의해 발색이 확인되므로, 상기 염색약에 의하여 루테리온이 제대로 분리되었는지 확인할 수 있다(도 1 내지 도 6).
또한, DAPI 및 아크리딘 오렌지(AO) 염색법에 의하여 루테리온 내에 RNA뿐 아니라 DNA도 함유되어 있음을 확인할 수 있다. 구체적으로, RNA는 아크리딘 오렌지 염색약에 의하여 여기 460nm, 방출이 650nm인 level에서 오렌지로 염색되고, DNA는 여기 502nm, 방출이 525nm인 level에서 녹색으로 염색되며, DAPI 염색법에 의하면 DNA가 함유되어 있음을 확인할 수 있다. 본 발명의 루테리온은 상기 염색법을 이용하여 루테리온 내에 RNA와 DNA가 함유되어 있음을 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 루테리온의 구조를 확인한 결과, 이중막 또는 다중막을 가진다는 것을 확인할 수 있었고(도 8), 루테리온 내부에 핵산, 특히 RNA를 함유하는 것을 확인하였다(도 9 및 도 10).
종래에는 식물 또는 식품 내에 루테리온이 존재한다는 사실이 알려져 있지 않아, 루테리온의 분리방법이나 배양하는 방법에 대한 기술은 전무하다고 할 수 있다. 본 발명에 의하면 루테리온을 효과적으로 분리·배양하는 방법을 제공하는 것이 가능하다.
본 발명은 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 루테리온의 분리방법에 관한 것이다: (a) 식물 또는 식품의 수증기 또는 가스 진탕 추출물을 냉각하여 수득한 응축액을 0.8~1.2μm의 공극을 가지는 필터를 이용하여 필터링하는 단계;
(b) 상기 필터링된 응축액을 원심분리하는 단계; 및
(c) 상기 원심분리된 상등액으로부터 루테리온을 분리하는 단계.
먼저, 상기 단계 (a)는 식물 또는 식품의 수증기 또는 가스 진탕 추출물을 냉각하여 수득한 응축액을 0.8~1.2μm의 공극을 가지는 필터를 이용하여 필터링하는 단계이다.
하나의 실시예에서, 상기 진탕 추출은 식물 또는 식품에 용매를 첨가하고, 50~90℃에서 기체를 이용하여 간헐적으로 버블링시키면서 진탕하는 진행할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 루테리온은 그 밀도가 1 이하로 지방 및 지질보다는 높은 밀도를 가지며 단백질보다는 낮은 밀도를 나타내므로, 수증기 증류법에 의하여 식물 또는 식품으로부터 분리할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
50~90℃의 기체를 이용하여 간헐적으로 버블링시키면서 진탕하면 루테리온이 기체와 함께 수증기 또는 가스 형태로 유리되는데, 수증기 또는 가스와 함께 진탕하면 루테리온을 포함하는 식물 또는 식품의 비등점이 떨어지게 되어 루테리온의 분해, 변질 또는 손상을 막을 수 있다.
경우에 따라서, 상기 (a) 단계에서 8~10시간 동안 진탕하고, 2~3시간마다 20~30분 동안 버블링하여 식물 또는 식품의 루테리온이 엉기지 않도록 하는 단계를 추가로 수행함으로써, 루테리온의 분리 효율을 증가시킬 수 있다.
상기 단계 (a)에서의 추출-필터링에 대한 구체적 내용은 도 37에 나타내었다. 식물 또는 식품에 용매 예를 들어 증류수를 첨가하고, 진탕을 통해 추출한 후 약 100-250g 바람직하게 190g으로 1차 원심분리 하고 스핀 다운하여 불순물을 제거하고, 약 1000-5000g, 바람직하게 약 3000g로 2차 원심분리 하여 수분-수 십분 (바람직하게는 두 시간 내외) 동안 안정시킨 후 상층액을 수집할 수 있다. 경우에 따라서, 이 때 CD332를 염색하고 운동성을 확인한 후 루테리온의 존재 여부를 일차적으로 확인할 수 있다. 이후, 순수한 루테리온을 얻기 위해 100,000-150,000g, 바람직하게 120,000g로 3차 원심분리하는 단계를 수행할 수 있다.
이후, 약 800nm의 필터로 필터링된 하층부를 수집하고, 플라즈마 등 내부 식물 또는 엑소좀 등 세포 찌꺼기 (Debris) 펠렛을 제거한다. 이후 다시 140,000g 이상으로 원심분리하여 펠렛이 포함되지 않는 상층액을 수집할 수 있다. 상층액을 400nm 필터로 필터링하고 하층부를 수집한 다음 다시 CD332를 염색하고 운동성을 확인할 수 있다. 추가로, 500nm 필터로 필터링하고, 필터 위에 걸러진 상층액을 모아 루테리온을 수집할 수 있으며, pH1 또는 -90℃ 이하의 온도에서 고정시킬 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 식물은 표 1~4에서 선택된 약용식물을 사용할 수 있다. 루테리온은 모든 식물에 존재하므로 표 1~4에 기재된 약용식물로 제한되지는 않는다.
[표 1]
Figure pat00001
[표 2]
Figure pat00002
[표 3]
Figure pat00003
[표 4]
Figure pat00004
또한, 식물에 포함된 루테리온은 식물의 줄기 쪽에 다량 분포하는 것으로 예상되는바, 줄기 부분을 포함하여 루테리온을 분리하는 것이 바람직하다.
상기 응축액은 상기 진탕에 의해 기화되는 수증기 또는 가스를 포집한 다음, 냉각시켜 수득할 수 있다. 포집된 기화 수증기 또는 가스와 분리된 상태의 루테리 온을 수득하거나, 이와 혼합된 상태의 루테리온을 수득할 수 있으며, 기화 수증기 또는 가스와 루테리온이 혼합된 경우 별도의 분리 절차를 추가로 거쳐 루테리온을 수득할 수 있다.
경우에 따라서, 상기 (a) 단계에서 수득된 응축액에 IR광선을 조사하는 단계 를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, IR광선을 20~60분, 바람직하게는 30-40분 조사하여 루테리온이 변형되는 것을 방지할 수 있고, 단계 (c) 수행 전에 IR광선 조사에 의해 운동성을 가지는 루테리온이 모이도록 함으로써 높은 농도의 루테리온 을 수득할 수 있도록 한다.
상기 단계 (b)는 0.8~1.2μm의 공극을 가지는 필터를 이용하여 상기 수득된 응축액을 필터링하는 단계이다. 0.8~1.2μm의 공극을 가지는 필터는 루테리온의 장 직경을 고려하여 본 출원의 발명자에 의해 도출된 최적의 크기로, 이를 통해 상기 (a) 단계에서 수득된 응축액 중 목적하는 루테리온 포함 용액을 필터링할 수 있다.
상기 단계 (c)는 상 기 필터링된 응축액을 원심분리하는 단계이다. 이를 통해 더욱 순도 높은 루테리온을 수득할 수 있다. 상기 원심분리는 1200~5000 rpm에서 5~10분간 반복적으로 수행될 수 있으나, 순도 향상을 위한 어떠한 원심분리 조건이 라도 조정되어 적용될 수 있다.
상기 단계 (c)는 원심분리된 상등액으로부터 루테리온을 분리하는 단계 이다. 예를 들어, 상기 원심분리된 상등액에 200-600um 파장의 IR광 선을 조사하여 운동성을 가지며 모여드는 루테리온 입자를 분리하거 나, 루테리온 표면항원 CD332, CD133, CD73 또는 CD39를 인지하는 결 합체와의 결합 여부를 확인하여 루테리온 입자를 분리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이와 같이 단계 (c)를 통해 루테리온을 분리한 이후에도, 분리된 루테리온 입자를 50nm 미만의 공극을 가지는필터로 필터링한 다음, 필터에 걸린 부위를 수집 하여 필터에 걸린 루테리온만을 분리할 수도 있다. 상기 과정을 통하여 루테리온 이외의 미세물질은 제거할 수 있으며, 50nm 이상의 크기를 가지는 루테리온을 수득 할 수 있다.
경우에 따라서, 추가로 200nm, 400nm, 600nm, 800nm 및 1000nm 필터를 순차 적으로 이용하여, 각각 50~200nm, 200~400nm, 400~600nm, 600~800nm 및 800~1000nm 크기의 루테리온으로 분류할 수 있다. 본 발명에 따른 루테리온은 암시야 현미경 또는 공초점 현미경을 통하여 관찰이 가능하며, 각각 200nm, 400nm, 600nm 및 800nm 필터를 순차적으로 이용하여 크기에 따라 50-200nm (발생기)/ 200-400nm (성 숙기)/ 400-600nm (분열기)/ 600-800nm (과분열기)로 구분할 수 있다 (도 27 및 도 28).
이후, 특정 pH 조건 및 온도 조건에서 루테리온을 고정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, pH 7 이하 및 0℃ 이하의 조건에서 고정할 수 있다. 바람직하게, pH 1-5 및 -90℃~0℃에서 고정시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 서, 특히 pH 1-3 조건에서 0℃ 이하의 온도에서 고정하는 경우 운동성을 가지는 루 테리온을 고정할 수 있음을 확인하였다. 루테리온을 고정하면 분리 효율을 향상시 킬 수 있다.
또한, 추가 증식 단계 예를 들어 피션 (fission) 유도 단계를 포함할 수 있 다. 25,000 psi(pound per square inch) 이상의 압력을 가하여 피션을 유도할 수 있는데, 본 발명의 일 실시예에서, 특히 25,000-35,000 psi의 압력을 가하면 피션 이 유도됨을 확인하였다. 이 때, 온도는 10-20℃로 유지하였으며, 고정시 사용하였 던 pH 1-3 조건을 유지하였다.
본 발명은 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 루테리온의 분리방법에 관한 것이다: (a) 루테리온을 함유하는 추출물에 루테리온 표면항원 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머가 고정된 입자를 첨가하여 루테리온과 입자의 결합을 유도하는 단계; 및 (b) 상기 입자에 결합 된 루테리온을 회수하는 단계.
본 발명에서는 루테리온 표면에 특이항원이 발현되는 것에 기반하여 대량 의 루테리온을 효율적으로 분리하고자 상기 특이항원에 대한 항체 또 는 압타머가 고정된 입자를 이용하여 루테리온의 분리를 시도하였다 . 그 결과, 본 발명의 일 실시예에서는 기존방법보다 단시간에 대량 으로 루테리온을 분리할 수 있다는 것을 확인하였다.
상기 루테 리온을 함유하는 추출물은 예를 들어, (i) 식물 또는 식품의 열수 추 출물 (ii) 식물 또는 식품의 용매 추출물 또는 (iii) 용매 존재하에 식물 또는 식품의 가열에 의해 발생하는 가스의 응축액일 수 있다.
상기 열수 추출물은 예를 들어 40℃ 이상의 물 을 이용하여 식물로부터 생리활성 물질을 추출한 것이라면, 특별히 제한되지 않으며 열수 추출을 사용하면 유기 용매의 독성에서 기인한 문제가 발생하지 않는다. 상기 용매 추출물은 예를 들어, 에테르(et her), 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 헥산(hexane)과 같은 용매을 사용하여 추출된 것일 수 있다.
상기 응축액은 식물 또는 식품에 증류수를 첨가하고 50~90℃에서 기체 를 이용하여 간헐적으로 버블링시키면서 진탕하는 단계와 상기 진탕 에 의해 기화되는 수증기 또는 가스를 포집한 다음, 냉각시켜 수득된 응축액일 수 있다.
본 발명에 따른 "루테리온 표면항원"은 루테리온 막의 지질층에 놓여 있는 소수성 아미노산을 함유하는 카르복시 말단 도메인을 통해 세포표면 막에 접착되어 있고 생물학적인 항원 효과를 발휘할 수 있는 것으로, 예를 들어 CD 39(Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1; ENTPD1), CD73(Ecto- 5'nucleotidase; NT5E), HBsAg, SLC3A2, CD109, LY9, CD332, CD133 또는 CD53 일 수 있으며, 바람직하게는 CD332, CD133, CD39 또는 CD73일 수 있다.
"항체"는 항원성 부위에 대해서 지 시되어 특이적으로 결합하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명은 루 테리온 표면항원에 특이적으로 결합할 수 있는 물질에 입자를 고정하 여 사용하였는데, 상기 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 사용할 수 있다. 본 발명에서 이용 가능한 항체는 예를 들어, 항-CD332 항체, 항-CD133 항 체, 항-CD39 항체 또는 항-CD73 항체일 수 있다. 항체는 시중에 판매하는 제조된 것을 사용할 수 있다. 이러한 항체 대신에 상기 표면발현되는 항원에 결합하는 압 타머를 이용할 수도 있다.
"입자"는 특성에 따라 자성특성, 발광특성, 정전기 특성 및 이온성을 띨 수 있는 것과 크기에 따라 마이크로 또는 나노의 크기를 가지는 것을 의미하며, 항체 와 결합을 통해 루테리온을 분리할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 예 를 들어 자성입자, 실리카입자, 양자점입자, 유리입자, 고분자입자, 섬유입자 및 형광입자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또한 상기 입자는 자성특성과 형광 특성을 동시에 갖는 입자, 자성입자에 양자점 및 금, 은 입자를 결합시킨 입자를 포함할 수 있다.
상기 입자는 예를 들어, 자성입자(magnetic particle)일 수 있고, 상기 자성 입자는 자성을 띠며, 자기장에 의해 움직이는 입자를 의미한다. 상기 자성은 상자 성을 갖는 것일 수 있다. 자성 입자는 예컨대, 금속 물질(metal material), 자성 물질(magnetic material) 또는 자성 합금(magnetic alloy)을 포함할 수 있다. 자성 입자는 자성을 띠는 입자가 될 수 있으나, 본 발명에서 자성 입자는 이에 한정되지 아니하고, 그 자체가 자성을 띠지 아니하나, 자성을 가질 수 있는 또는 자력에 끌 리는 금속 입자가 될 수 있다. 또한, 상기 금속입자는 예를 들어, 철, 알루미늄, 코발트, 니켈, 망간, 주석, 아연, 카드뮴, 마그네슘, 구리, 바튬, 리튬 또는 이트 륨의 산화물로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나로 제조될 수 있다. 이중 바람직 하게는 철이 선택될 수 있다. 상기 입자는 마이크로 미터 크기일 경우에는 강자성 을 띠지만, 나노미터 크기의 작은 입자들은 초자성을 띤다. 이러한 입자들은 합성 이 쉽고, 크기를 쉽게 조절할 수 있다. 예를 들어, 1~1,000nm의 크기를 가질 수 있 으며, 바람직하게는 10~1,000nm 더욱 바람직하게는 10~500nm 매우 바람직하게는 10~100nm 크기의 입자를 사용할 수 있다.
경우에 따라서, 상기 자성입자에 분산성과 안전성을 유지하기 위해 자성입자를 개질 시킬 수 있으며, 예를 들어 탄소를 코팅하여 개질할 수 있다.
추가로 항체 또는 압타머 결합에 적합한 작용기를 더 포함할 수 있다. 상기 작용기는 예를 들어 아마이드기(amide group), 에스테르기(ester group), 아민 기(amine group), 카르복실기(carboxyl group), 싸이올기(SH), 에폭시기(epoxy group), 페닐기(phenyl group), 술폰기(sulphone), 알콕시기(alkoxy group), 알데 히기(aldehyde), 케톤기(ketone) 에서 선택된 것일 수 있다. 상기 아민기(NH2)는 모 노아민기(monoamine), 다이아민기(diamine), 트리아민기(triamine), 에틸렌 다이아 민(ethylene diamine) 또는 다이에틸렌트리아민(diethylenetriamine)일 수 있다.
상기 입자에 결합된 루테리온을 회수하는 단계에서, 입자가 자성입자일 경우, 상기 (b) 단계는 외부에서 자성을 가하여 루테리온이 결합된 자성나노입자를 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다
상기 자성을 가하여 루테리온이 결합된 자성나노입자를 모은 다음, 회수하는 방법은 상기 루테리온과 루테리온 표면항원에 결합하는 항 체 또는 압타머가 고정된 자성입자가 포함된 시료를 혼합하여 반응 한 후, 상온에서 자석 또는 자성활성 세포 분류기(Magnetic-activat ed cell sorting: MACS)를 이용하여 수집 후 상등액을 제거하고, 완 충용액에 재현탁시킨 후, 응집용 필름 및 포획용 여과막에 순차적으로 통과시켜 결과적으로 루테리온-항체-자성입자 복합체를 확인할 수 있다.
본 발명에서, 상기 입자가 형 광입자일 경우, 상기 (b)단계는 형광이용 분류기를 이용하여 루테리 온이 결합된 입자를 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 형광이용 분류기를 이용한 회수방법은 형광의 종류와 정도에 따라 세포와 같은 형태의 미세물질을 분류하는 방법으로 정량적 분석과 분류를 위해 형광을 띄는 세포가 소정의 관 을 통하여 흐를 수 있게 하는 "흐름 제어계(fluidic system)"와, 흐 름 제어 시스템에 제어에 따라 흐르는 미세물질을 관찰하기 위한 "광 학계(optical system)"와 광학계의 광신호를 전기신호로 바꾸어 처리하는 "전자 계(ectronic system)"이루어진다. 형광활성 세포분류 장치는 각종 세포를 특성에 따라 효율적으로 분류 수집하는 장치로서 생명과학(동물학, 식물학, 미생물학, 농 학, 수산학, 임학 등)과 의학연구에서 많이 활용되는 장치이다. 본 발명의 형광입 자에 포함되는 형광물질은 생체 이미징에 사용할 수 있는 형광 물질이면 어떠한 것 이든 가능하다. 상기 형광물질은 이에 제한되는 것은 아니나, 로다민과 그의 유도 체, 플루오레신과 그의 유도체, 쿠마린과 그의 유도체, 아크리딘과 그의 유도체, 피렌과 그의 유도체, 에리트로신과 그의 유도체, 에오신과 그의 유도체, 및 4-아세 트아미도 -4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'디설폰산으로 구성된 군으로부터 선택되 는 것일 수 있다. 형광 물질을 보다 구체적으로 예시하면 다음과 같다:
로다민 및 그의 유도체: 6-카복 시-X-로다민 (ROX), 6-카복시로다민 (R6G), 리사민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민 (Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티 오시아네이트, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 설포로다민 101의 설포 닐 클로라이드 유도체(Texas Red), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카복시로다민 (TAMRA), 테트라메틸 로다민, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), 리보플라빈, 로졸산, 터븀 킬레이트 유도체, Alexa 유도체, Alexa-350, Alexa-488, Alexa-547, Alexa-647; 플루오레세인 및 그의 유도체: 5-카복시플루오레세인 (FAM), 5-(4,6-디 클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인(DTAF), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6- 카복시플루오레세인 (JOE), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, QFITC (XRITC), 플루오레스카민(fluorescamine), IR144, IR1446, 말라카이트 그린 이소티오시아네이트, 4-메틸움벨리페론, 오르토 크레졸 프탈레인, 니트로티로신, 파라로자닐린, 페놀 레드, B-피코에리트린, o-프탈디알데히드; 쿠마린 및 그의 유 도체: 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린 (AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-4-트리플루오 로메틸쿠마린 (쿠마린 151), 시아노신, 4'-6-디아미니디노-2-페닐인돌 (DAPI), 5',5''-디브로모피로갈롤-설폰프탈레인(Bromopyro- gallol Red), 7-디에틸아미노- 3-(4'-이소티오시아나토페닐)-4-메틸쿠마린 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 4- (4'-디이소티오시아나토디하이드로-스틸벤-2,2'-디설폰산, 4,4'-디이소티오시아나 토스틸벤-2,2'-디설폰산, 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-설포닐 클로라이드 (DNS, dansyl chloride), 4-(4'-디메틸아미노페닐아조) 벤조산(DABCYL) 4-디메틸아미노페 닐아조페닐-4'-이소티오시아네이트 (DABITC); 아크리딘 및 그의 유도체: 아크리딘, 아크리딘 이소티오시아네이트, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS), 4-아미노-N-[3-비닐설포닐)페닐]나프탈이미드-3,5디설포네이트(LuciferYellow VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸) 말레이미드, 안트라닐아미드, Brilliant Yellow; 피렌 및 그의 유도체: 피렌, 피렌 부티레이트, 숙신이미딜 1-피렌 부티레이트, Reactive Red 4 (Cibacron Brilliant Red 3B-A); 에리트로신 및 그의 유도체: 에리트로신 B, 에리트로신 이소티오시아네이트, 에티듐; 에오신 및 그의 유도체: 에오신, 에오신 이소티오시아네이트; 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'디설폰산.
본 발명에서, 상기 입자 가 정전기를 띤 입자일 경우, 상기 (b) 단계는 불균일한 전기장을 형 성하여 입자에 쌍극자 모멘트를 형성시키고, 정전기적 인력으로 루테 리온이 결합된 이온성 입자를 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 불균일한 전기장을 형성하여 입 자에 쌍극자 모멘트를 형성시키고, 정전기적 인력으로 루테리온이 결 합된 이온성입자를 회수하는 방법은 입자분리 장치의 일종인 전기적 입자 분급장치(Different mobility analyzer; DMA)를 통해 가능할 수 있다. 전기적 입자 분급장치는 정전기력에 의한 입자의 이동도 차이를 이용하여 입자를 분류하는 장치로, 미분형 전기이동도 분서기 또는 미분형 정전분급기라고도 불린다. 구체적으로 전기적 입자 분급장치는 하전된 입자의 이동속도가 입자 지름 의 함수인 것을 이용하여 다분산(poly-disperse) 입자에서 원하는 지름을 가진 단 분산(mono-disperse)입자를 선별하는 장비이다.
본 발명에서, 상기 입자가 이온성 입자 예를 들어, 음 이온성 또는 양이온성 입자일 경우, 상기 (b) 단계는 정전기적 인력 을 이용하여 루테리온이 결합된 이온성 입자를 회수할 수 있다.
상기 정전기적 인력으로 루테리온이 결합된 섬유입자를 회수하는 방법은 상 기 전기적 입자 분급장치(Different mobility analyzer; DMA)를 통해 가능할 수 있 다.
본 발명은 입자에 결합된 루테리온에서 루테리온 만을 분리하는 단계를 추가 로 포함할 수 있다.
상기 입자에 결합된 루테리온에 BSA/PBS 완충용액을 가하여 25℃에서 인큐베 이팅(incubating) 시킨 후, 자성 또는 이온성을 이용하여 BSA가 흡착된 입자만을 분리하고, BSA(Bovine Serum Albumin)가 흡착된 입자에 다시 PBS를 가해 인큐베이 팅(incubating)을 하여 입자를 탈착시켜 루테리온 만을 분리할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 루테리온에 수분을 첨가하고 IR광선 조사하에 18~30℃에서 증식시키 는 단계를 포함하는 루테리온의 배양방법에 관한 것이다.
하나의 실시예에서, 상기 배양시 첨가되는 수 분은 식염수 또는 PBS 용액일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 루테리온을 당 포함 배지에서 pH 5-9 (고정시 는 pH 1-3) 및 18~30℃ 조건으로 증식시키는 단계를 포함하는 루테리온의 배양방법 에 관한 것이다.
하나의 실시예에서, 상기 당은 람노스(rhamnose), 글루코스(glucose), 갈락 토스(galactose), 프럭토스(fructose) 또는 자일로스(xylose)일 수 있고, 바람직하 게 글루코스일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 글루코스를 포함하는 배지 예를 들어 DMEM 배지 또는 혈액 배지에 글루코스를 약 1~10%, 바람직하게 2~8%의 농도로 첨가하고, pH 7 및 약 20℃의 조건을 유지하는 최적으로 루테리온을 배양할 수 있 음을 확인하였다. 배양된 루테리온의 수는 루테리온 특이적 표면항원인 CD332, CD133, CD73 또는 CD39을 포함하는 루테리온과 미토트래커 레드에 염색된 루테리온 수를 카운팅하여 확인하였다.
배양 전의 루테리온은 그 크기가 50~200nm일 수 있으나, 본 발명의 배양 방법에 따라 배양된 루테리온의 배양 후 크기는 300~500nm일 수 있다 . 이때, 현미경으로 관찰하면서 루테리온의 크기가 500nm을 넘지 않 도록 할 수 있으며, 배양이 끝나면 크기별로 분류하여 -80℃로 냉각 하여 보관하거나 질소로 충진하여 보관 또는 영상에서 보관할 수 있 으며 보관시 보존제를 첨가할 수 있다.
상기와 같이 배양된 루테리온은 일정기간 특성에의 변화 없이 원하는 크기(500nm 이하)로 보관이 가능하여 루테리온을 이용한 질병 의 치료에 효과적으로 활용할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 루테리온은 세포 내 핵에 도입될 수 있다. 루테리온을 적색형광 으로 형광 염색하여 루테리온이 세포 내 핵으로 도입되는지 여부 확 인한 결과, 루테리온이 DAPI로 염색된 세포 내 핵에 도입됨을 확인하였다.
또한, 본 발명에 따른 루테리 온을 형광염색하고, 형광염색된 루테리온을 복강 내 주사(IP) 및 경 구 위관투여법으로 투여한 결과, 경구 투여시에는 적어도 3시간 이후 , 복강 내 주사시 5분 이내에 BBB를 통과함을 확인할 수 있다. 이러한 특성 을 활용하여 본 발명에 따른 루테리온은 퇴행성 뇌질환 등의 치료에서 혈뇌장벽을 통과하지 못하여 치료제로 사용되지 못하였던 약물들의 한계를 극복할 수 있으며, 이를 이용하여 혈뇌장벽 통과 가능한 퇴행성 뇌질환 치료제로 사용하거나, 종래 알 려진 약물이 혈뇌장벽으로 통과할 수 있도록 하는 약물전달체로도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따 른 루테리온은 암세포에서 텔로머라아제 활성을 저해하고, 정상세포 에서는 영향이 없거나 또는 텔로머라아제 활성을 증진시켜, 효과적으 로 암세포의 증식만을 억제시키는 항암 효과가 있다.
한편으로, 정상세포에서는 루테리온 처리에 의해 텔로머라아제 발현이 증가되고 텔로미어의 길이가 증가되며, 루테리 온은 정상세포에서는 텔로머라제 활성을 증진시키는 항노화 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
"정상세포"는 암세포와 같이 증가된 텔로머라아제 활성을 가져, 무한 증식을 하는 표현형을 가지는 세포가 아닌 정상적인 노화 프로세스를 가지는 세포를 의미한다.
"텔로머라아제"는 텔로미어의 말단에 대한 텔로미어(telomeric) 반복의 첨가를 촉매하는 리보핵산 단백질 을 의미한다. 텔로미어는 염색체의 말단을 덮는 반복 서열의 긴 확장 이며 염색체를 안정시키는 것으로 여겨진다. 사람에서, 텔로미어는 전형적으로 길이가 7-10 kb이고 서열 -TTAGGG-의 다중 반복을 포함한다. 텔로머라 아제는 대부분의 성인 세포에서 발현되어 있지 않으며, 텔로미어 길이는 연속적인 원형의 복제를 감소시킨다. 세포 복제가 특정 회수 이상이 되면, 텔로미어는 점차 축소되어, 세포가 말단 붕괴 단계에 들어가게 되고, 이로 인해 세포는 노화하게 된 다. 텔로머라아제는 체세포에서 불활성이지만, 암세포의 90%에서는 활성이며, 텔로 머라아제 억제제는 암과 싸우는 데 유용할 수 있다.
더욱이, 정상 사람 섬유아세포에 루테리온을 처리한 결과, 상기 인간 정상세포의 텔로머라아제 발현이 증가되고, ATP 생 성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 루테리온이 정상세포의 텔로머라이제 활성 증가를 통해 노화를 억제할 수 있다는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 루테리온은 증대된 텔로머라아 제 발현 및/또는 텔로머라아제 활성에 의해 영향받기 쉬운 질환 또는 증상의 치료 에 사용될 수 있고, 치료가 필요한 환자에 투여하는 것을 포함하는 환자의 세포 또 는 조직 내 텔로머라아제 활성을 증가시킬 수 있다.
"노화에 수반되는 질병 또는 질환"은 종양 형성 및 암의 악성 발전, 심근 경색(심장 마비), 소뇌 경색, 뇌졸중, 파킨슨 병, 심부전, 아테롬성 동맥경화증, 고혈압, 백내장, 노화에 수반되는 시력 감퇴, 근육감소증, 골관절염, 골다공증, 골수 손실, 다중 경화 증, 쇼그렌 증후군, 류머티스성 관절염, 면역 기능 저하, 당뇨, 특발 성 폐섬유증, 및 신경퇴행성 질병, 알츠하이머, 헌팅튼병, 및 테스토스테론, 에 스트로겐, 성장 호르몬, IGF-I, 또는 에너지 생성의 감소로 초래된 장애를 의미한 다.
"노화 방지 효과"는 증가된 미토콘드리아 생물발생 및 기능, 감소된 ROS 레 벨, 노화 세포 및 뉴론 세포와 같은 체세포분열 후 세포의 연장된 수명, 종양 형 성, 암의 악성발전, 소뇌 경색 및 심근 경색과 같은 노화에 수반되는 현상의 방지 를 포함하는 표현형을 의미한다.
세포의 발전소인 미토콘드리아(mitochondria)는 호흡작용이 가장 활발 한 산소 소모처로서 모든 세포가 신진대사 활동을 수행하는 장소이며 , 이 활동은 세포외 다른 모든 활동에 필요한 에너지를 공급한다 (B overis A et al., Biochem. J. 134：707-716, 2973). 미토콘 드리아의 산소로 운반되는 전자전달 과정에서 생성되는 O2·- 또는 OH· 같은 reactive oxygen species(ROS)는 미토콘드리아의 구조와 성 분을 파괴하고 이는 호흡률과 산화적 인산화 반응에 변화를 유발하여 결국 세포대 사를 결정하는 ATP 생성이나 NADH/NAD+ 비율에 영향을 주게 된다. 고등동물의 대부 분의 에너지는 미토콘드리아에서 합성되는 ATP로 충당되며, 미토콘드리아에서 일어 나는 에너지대사 작용은 노화와 밀접한 관계에 있다고 보고 있다 (Lee JW et al., J Korean Med Assoc.52(10)：1007-19, 2009).
루테리온 처리에 의한 정상세포에서의 ATP 생성 증가 를 확인하였다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "노화에 수반되는 질병 또는 증상을 예방하는 것"은 그것이 발생하는 경우를 줄이고, 노화에 관련된 질병을 지연시키거나 뒤집는 것을 가리킨다.
본 명세서 에서 사용된, 용어 "노화 또는 "노화 세포는 텔로미어 기능 장애, D NA 손상, 또는 종양유전자(oncogene) 활성화에 의해 유발될 수 있는, 유사 분열 세포에서의 세포 사이클 정지 상태를 가리킨다. 출아효모에서, 텔로미어 기능 장애 에 의해 초래된 노화 세포가 세포 사이클의 G2/M기에 정지되어 있다. 포유류 세포 에서는, 노화 세포가 세포 사이클 외부의 비-분열기인 G0기에 정지되어 있다. WI- 38 섬유아세포에서의 노화는 현미경으로 관찰 시 패시지 이후 10일 동안 그 수가 증가하지 않으며 β-갈락토시다아제(galactosidase) 양성 착색을 보이는 세포를 의 미한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "체세포분열 이후 세포"는 세포 사이클 외부의 비-분열기인 G0기에 정지되어 있지만, 나머지 생물의 생명을 위해 그 주요 기능은 수행하는 세포의 그룹을 가리킨다. 체세포분열 이후 세포는 뉴론 세포, 심장 근육 세포, 및 근육 세포를 포함한다. 간 및 신장의 조직질실(parenchymal) 세포와 같 이, 성숙한 생물의 일부 세포 종류는 반-영구적으로 G0기에 들어가고 매우 특별한 환경에서만 다시 분열을 시작하도록 유발될 수 있다. 이러한 종류의 세포들은 그들 이 G0기에 있을 때 체세포분열 이후 세포로 고려된다.
상기 노화에 수반되는 질병 또는 증상은 미토콘드 리아 기능 손실, 텔로미어 기능 장애, 노화세포 퇴화 및 수명-의존적 (age-dependent) 세포 손실, 또는 미토콘드리아 퇴화 또는 체세포분 열 후 세포의 세포 사이클 정지상태와 연관된다.
일 실시양태에서, 루테리온은 텔로머라아제 효소와 상 호작용하고, 개체의 조직 또는 세포에서 텔로머라아제 발현 및/또는 활성을 자극 및/또는 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 이러한 활성은 감소되거나 없을 수 있으며, 이로 인해 개체의 질환, 또는 증상과 관 련된 병인 또는 증후군의 증대 또는 발달을 초래한다. 이러한 질환 또는 증상은 특히 (a) 알쯔하이머 질환; (b) 파킨슨 질환; (c) 헌팅톤 질환; (d) 발작; (e) 신경 손상, 운동 뉴런 질환, 다발성 경화증(MS), 말초 및 중추 신경 계 손상(척추 손상 및 뇌졸중을 포함함); (f) 피부의 노화-관련 질환 예컨대 피부 위축 및 박화, 탄력섬유융해증 및 피부 주름, 피지선 과다형성증 또는 형성저하증, 노인 흑색점, 색소 이상, 백발 및 모발 손실 또는 박화(대머리, 탈모), 또는 만성 피부 궤양; (g) 퇴행성 관절 질환; (h) 골다공증, 관절염 및 기타 골격계의 퇴행성 증상; (i) 죽상경화증, 석회화, 혈전증, 고혈압 및 동맥류를 비롯한 혈관계의 노화 - 및 스트레스-관련 질환; (j) 노화-관련 황반 변성; (k) AIDS; (l) 자연적인 노 화, 암, 암 치료, 급성 또는 만성 감염, 퇴행성 염증성 질환 또는 가속화된 세포 회전율을 야기하는 유전적 질환 및 관련된 빈혈 및 기타 퇴행성 증상과 함께 발생 하는, 조직 회전율 손상을 비롯한 노화- 및 스트레스-관련 면역계 손상; (m) 표피 의 상처, 화상, 찰과상 또는 기타 급성 또는 만성 증상의 치료; (n) 선천성 각화이 상; (o) 사르코페니아 및/또는 기타 근육계 질환 또는 증상; p)황체기 결함; (q) 조기 난소 부전증(원발성 난소 부전 또는 성선 저하증); (r) 손상된 정자 생산; (s) 손상된 정자 전달; 및/또는 (t) 메모리 T 세포에서의 텔로머라아제 발현 및/또 는 활성을 증가시킴으로써 면역 메모리 반응 및 백신에 대한 반응을 강화시키고; 및/또는 (u) 건강한 조직에서의 텔로머라아제 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로 써, 개체의 수명을 연장하면서 개체의 건강을 유지하거나/하고 본원에 기재된 바와 같은 "치료"란 용어에 포함되는 임의의 실시양태를 비롯한 임상 치료 및/또는 진단 분야를 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 루테리온의 분리
(1) 루테리온 추출
약용식물 인 옻나무 (Rhus verniciflua stokes) 100g을 20-30배 크기 즉 2-3리 터 용기 크기에 맞추어 절단하여 용기에 넣고, 식물의 5~8배인 500~800g(바람직 하게는 식물의 6배 즉 600g)의 증류수를 용기에 투입한 후, 80℃ 이하에서 전탕을 수행하였다. 약 8시간 정도 전탕을 하되, 약 3시간마다 20~30분 동안 산소로 버블 링을 가하여 식물의 루테리온이 엉기지 않도록 하였다. 상기 버블링 후 추출시 스 팀되는 기화된 수증기를 플라스크에 수집하였다. 상기 수집한 수증기를 냉각하고 응축시켜 수득한 응축액에 IR 광선(파장: 3∼1000㎛ 내외 바람직하게는 200~600㎛) 을 1-2시간 조사하여 루테리온이 변이되지 않고 피션이 유도되도록 하였다. 이러한 과정을 도 37에 모식적으로 나타내었다.
(2) 원심분리 및 필터링에 의한 분리
(1)에서 수집한 응축액을 190g으로 1차 원심분리 하고 스핀 다운하여 불순물을 제거 하고, 3000g로 2차 원심분리 하여 수분-수 십분 (바람직하게는 두 시간 내 외) 동안 안정시킨 후 상층액을 수집하였다. 이 때 CD332를 염색하고 운동성을 확 인한 후 루테리온의 존재 여부를 일차적으로 확인하였다. 이후, 순수한 루테리온을 얻기 위해 120,000g로 3차 원심분리하였다.
약 800nm의 필터로 필터링된 하층부를 수집하고, 플라즈마 등 내부 식물 또는 엑소좀 등 세포 찌꺼기 (Debris) 펠렛을 제거한 다음, 다시 140,000g 이상으로 원심분리하여 펠렛이 포함되지 않는 상층액을 수집하였다. 상층액을 400nm 필터로 필터링하고 하층부를 수집한 다음 다시 CD332를 염색하고 운동성을 확인하였다. 500nm 필 터로 필터링하고, 필터 위에 걸러진 상층액을 모아 루테리온을 수집하였으 며, pH1 또는 -90℃ 이하의 온도에서 고정시켰다.
상기 과정에 의해 장직경 50-800nm인 루테리온을 수 득할 수 있으며, 이는 암시야 현미경 또는 공초점 현미경을 통하여 관찰 확인이 가능하였다. 상기 수득한 루테리온은 크기에 따라 50-2 00nm (발생기)/ 200-400nm (성숙기)/ 400-600nm (분열기)/ 600-800n m (과분열기)로 구분하였다.
같은 방법으로 표 1~4에 기재된 약용식물, 당귀, 칠피 및 키위로부터 루테 리온을 수득하였다.
(3) 표면항원 특이적 항체에 의한 분리
3-1) 루테리온 표면항원 확인
식물에서 분리한 루테리온에 항-CD39 항체(sc-18766, Santa Cruz Biotechnology), 항-CD73 항체(sc-25603, Santa Cruz Biotechnology) 또는 항- CD332 항체(BS-0675R,Bioss Inc)를 결합시키고, 항-FITC를 결합시켜 발색 유무를 관찰 (푸른색 형광: CD133/1-VIOBRIGHT-FITC 제조)하였다. 붉은색 형광은 PE (Phycoerythrin: : Miltenyi Bitech GmbH 제조)로 염색하였다. 또한, 미토트랙커 (Mito-tracker)와 DAPI, Hoechst 로 염색한 뒤 그 발색 유무를 형광현미경을 통해 관찰하였다.
그 결과, 미토트랙커와 DAPI 또는 Hoechst에 의해 염색된 루테리온에 항- CD39 항체, 항-CD73 항체, 항-CD133 항체 또는 항-CD332 항체가 결합함을 확인함으 로써, CD39, CD73, CD133 또는 CD332이 루테리온의 표면항원임을 확인할 수 있었다 (도 29 내지 도 32).
3-2) 항체가 고정된 입자 제조
단계 1. 탄소가 코팅된 철(Fe) 자성나노입자 의 제조
철아세틸아세토네이트하이드레이트 (0.5) mmol을 옥틸에테르 10mL가 들어있 는 삼각플라스크에 넣고 교반하면서 금속 전구체 용액을 제조한 다음, 초음파 조사 기를 이용하여 10분간 20 kHz(50%)강도로 초음파를 조사하였다. 금속 전구체 용액 에 초음파를 조사함에 따라 초기에 주황색이었던 용액이 시간이 지남에 따라 흑갈 색으로 변하는 것을 관찰할 수 있었는데, 상기와 같은 변화는 산화철(Fe2O3) 자 성나노입자가 성공적으로 제조되었다는 것을 의미한다. 상기 산화철 자성나노입자가 제조된 혼합용액에 과량의 에탄올을 첨가하여 생성된 자성나노입자를 석출한 뒤, 원심분리를 수행하여 자성나노입자와 상 층액을 분리하였고 상층액은 제거하였다. 상기의 세척과정을 3회 이 상 반복한 뒤, 자성나노입자를 50℃의 온도에서 12 시간 동안 건조하 여 300 nm 크기를 가지는 산화철 자성나노입자를 제조하였다. 상기 제조 된 산화철 자성나노입자를 600℃에서 3시간 동안 아르곤(Ar) 분위기하에서 열처리 하여 탄소가 코팅된 철-자성나노입자를 얻었다.
단계 2. 카르복실기가 코팅된 자성나노입자 제조
단계 1에서 얻은 탄소 코팅된 철-자성나노입자 (0.5g)과 succinic anhydride 1g을 실란 폴리에틸렌글리콜 카르복실산 5ml와 함께 에탄올 25ml에 분산시킨 후 24 시간 동안 반응하였다. 반응이 종료된 후 원심분리하여 얻어진 침전물은 에탄올을 이용하여 세척한 뒤 진공 오븐에서 건조하여 탄소와 카르복실기가 이중 코팅된 철- 자성나노입자를 얻었다. 상기 이중 코팅된 입자 제조 단계를 모식도로 나타내었다 (도 33 전단).
단계 3: 항체가 고정된 입자 제조
항-CD39 항체, 항-CD73 항체, 항-CD133 항 체 또는 항-CD332 항체를 티올 반응성 시약과 반응시켜 티올화 시켰 다. 단계 2에서 제조된 카르복실기 작용기가 도입된 철자성나노입자 와 상기 티올기를 가지는 항체를 반응시켜 상기 철자성나노입자에 상 기 항체를 부착시켰다. 상기 항체가 고정된 입자를 모식도로 나타내었다(도 33 후단).
3-3) 식물 또는 식품 유래 루테리온의 분리
100~200ul 식물추출물과 5ul CD39 항체- 철자성나노입자 또는 CD73 항체-철자성나노입자를 비커에 넣고, 30분 간 결합시킨 후 자석분리기에 1~2분 놓아 두어 루테리온-자성나노입 자를 모으고 상청액을 버려 세척하였다. 상기 루테리온과 결합된 철 자성나노입자에 0.033wt% BSA(Bovine Serum Albumin)/PBS완충용액을 가하여, 25℃에서 1 시간 동안 인큐베이팅(incubating) 시킨 후, 자석을 이용하여 BSA가 흡 착된 철자성나노입자 만을 분리하고, BSA가 흡착된 철자성나노입자에 다시 일정량 의 PBS를 가해 인큐베이팅(incubating)을 통해 탈착시켰다. 흡착된 BSA는 FP-640 스펙트로플루오로미터 (spectroflurorometer) (JASCO)에 의해 280nm에서 표준 검량 선법을 이용하여 정량분석을 하였다. (방출슬릿: 0.5nm, 흡수슬릿: 0.5 nm) 상기 철자성나노입자를 사용한 식물 또는 식물의 루테리온 분리 단계를 모식도로 나타내 었다(도 34).
3-4) 분리된 루테리온의 확인
위 3-3)에서 분리한 루테리온과 (2) 필터링에 의한 분리방법으로 분리한 루테리온 각각 중 CD39, CD73, CD133 또는 CD3 32에 결합하는 항체에 항-FITC를 결합시켜 발색 유무를 관찰하였다 (도 35의 a, b, c, d). 형광활성 세포 분류기를 통해 상기 두 분리방 법의 추출 수율을 비교하였다.
그 결과, 나노필터링 방법을 이용하여 분리한 경우 루테리온 수는 1.5x1 08 개/ml인 반면, CD39, CD73, CD133 또는 CD332 표 면항원에 결합하는 입자를 이용하여 분리한 경우 루테리온의 수는 7 .18x108 개/ml로 나노필터링 방법에 비해 루테리온의 수가 4배 이상 증가한 것을 확인하였다(도 36의 a 및 b).
[표 5]
Figure pat00005
표 5에 나타난 바와 같이, 나노필터링 방법을 이용할 경우, 50~400nm 크기의 루테리온 최 종 추출률은 40~45%, 분실률은 50~60%인 반면, 본 발명의 CD39, CD73, CD133 또는 CD332 표면항원에 결합하는 항체-철나노입자 분리방법을 이용할 경우, 50~400nm 크기의 루테리온 최종 추출률은 90~95% 이상이며, 분실률은 10% 이하로 추출률 및 효율이 매우 높아지는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과로부터, 나노 필터를 사용한 종래 의 루테리온 분리방법보다 본 발명의 루테리온 표면항원에 결합하는 항체 또는 압타머가 고정된 입자를 이용한 분리방법이 최종 추출률은 늘어나고 분리 과정 중 생기는 분실률은 줄어드는 것을 확인할 수 있 었다.
(4) 식물 미토콘드리아와 루테리온의 차이 확인
표 6에서와 같이 식물 미토콘드리아는 C D332, CD39, CD73, CD133 및 CD326 중 어느 하나의 표면항원도 발현 하지 못할 뿐 아니라, 140,000g 이상으로 원심분리시 미토콘드리아는 터지나, 루테리온은 형상을 유지한 채로 존재함을 확인하였다. 또한 , 피션을 유도하기 위한 가압 예를 들어, 35,000psi 이상을 적용하면 미토콘드 리아는 터지나, 루테리온은 형상을 유지한 채로 존재함을 확인하였다.
[표 6]
Figure pat00006
실시예 2: 루테리온의 고정
운동성이 있는 루테리온 및 CD39, CD73, CD133 또는 CD332을 표면항원으 로 포함하는 루테리온을 고정하여 수를 확인하였다. IR을 조사하여 모여드는 루테리온을 확인하고, 루테리온에 항-CD332, 항-CD39, 항- CD133 또는 항-CD73 항체를 결합시키고 항-FITC를 결합시켜 발색이 확인된 루테리온, 미토트래커로 염색하여 염색된 루테리온의 수를 카 운팅하였다. 이 때, pH 1-3, 0℃ 이하, -90~0℃ 조건에서 루테리온을 고정하고 루테리온 수를 카운팅한 결과를 pH 및 온도 조건에 따라 아래 표 7 및 8에 나타내었다 (+는 카운팅된 루테리온의 수를 나타냄).
[표 7]
Figure pat00007
[표 8]
Figure pat00008
표 7 및 8에 따르면 , pH 1-3 및 -90~0℃ 조건에서 1-3개월 유지하는 경우 루테리온 수에 영향없이 고정된 채로 보존될 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 3: 압력을 이용한 루테리온의 피션 유도
실시예 1에서 분리된 루테리온에 표 9에서와 같이 프렌치 프레스 (french Press)를 통해 압력을 가하였다. 또한, 온도에 따라 루테리온의 피션 유도에의 영 향을 확인하였다 (+는 피션 정도를 나타냄).
[표 9]
Figure pat00009
표 9 및 도 11 내지 13에 따르면, pH 1-3, 25000~35,000psi, 10-20℃의 온도 조건에서 피션이 유도되어 루테리온의 증식이 이루어짐을 확인할 수 있다.
실시예 4: 루테리온의 특성
(1) 구조
실시예 1에서 수득된 루테리온 중 약 50-400nm의 크기를 가지는 루테리온을 공초점 레이저 주사현미경 (Confocal Laser Scanning Microscope, Zeiss), 투과전 자현미경 (Transmission Electron Microscope), 주사전자현미경 (Scanning Electron Microscope), 원자힘현미경 (Atomic Force Microscope) 및 공초점 스캐너 (Leica TCS-SP8)으로 촬영하여 루테리온도 미토콘드리아와 유사하게 이중막 또는 다중막을 가진 막구조로서 내부 크리스테(cristae) 구조를 완성하지 않은 상태의 구조를 가지며, 미토콘드리아와 동일한 레이저 파장 범위에서 관찰됨을 확인하였 다. 또한, 그 형태는 원형 내지 타원형임을 관찰할 수 있었다 (도 6).
아울러, 실시예 1에서 분리된 루 테리온을 TEM 전자현미경으로 촬영한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 , 이중막 또는 다중막 구조를 가진다는 것을 확인할 수 있었다.
(2) 염색 특성
실시예 1에서 수득된 루테리온 중 약 50-800nm의 크기를 가지는 루테리온을 미토트랙커(Mito-tracker), 로다민123(Rhodamine123), 야누스 그린B(Janus green B)으로 염색한 뒤 그 발색 유무를 관찰하였다. 그 결과, 루테리온도 미토트랙커, 로다민 123, 야누스 그린 B에 의해 발색이 확인됨을 확인하였다 (도 2, 도3 및 도 5 참조).
(3) 자가형광
실시예 1에서 의해 수득된 루테리온 중 약 50-800nm의 크기를 가지는 루테리온은 빛 반응을 나타냄을 형광 사진을 통해 확인하였다(도 4 참조).
(4) 루테리온에 RNA 함유 여부 분석
실시예 1에서 분리된 200~400nm 루테리온의 원자현 미경 촬영결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 루테리온에 RNA나 DNA와 같은 핵산이 함유되어 있는 것으로 추정할 수 있다.
실시예 1에 서 분리된 200~400nm 루테리온으로부터 총 RNA와 DNA를 분리하기 위 하여, QIAGEN 킷트(AllPrep DNA/RNA icro kit: Cat 80284)를 사용하여 분리한 다 음, Experion RNA(DNA) StdSens(Bio-Rad사) 칩을 이용하여 정량하였다.
루테리온을 원심분리(8000g, 1 시간 30분)하여 회수한 후 키트 내 분해 완충액 RLT plus (Guanidin e isothiocycanate, detergents) 50㎕에 베타 멀캅토에탄올 3.5㎕를 첨가하여 20 게이지 바늘이 부착된 주사기를 이용하여 5-10회 통과시켜 루 테리온을 용해시켰다. 샘플 분해 완충액을 AllPrep DNA spin 컬럼에 옮긴 후 원심 분리(≥8000g 15초)하여 컬럼에 걸려 있는 DNA와 컬럼을 통과한 RNA가 포함된 버퍼 에서 각각 분리하였다.
우선 컬럼을 통과한 버퍼에 동일한 부피의 350㎕ 70% 에탄올을 넣어 잘 섞은 후, 700㎕의 혼합액을 RNease MinElute spin 컬럼에 옮겨 원심분리(≥8000g 15초) 하고 컬럼을 통과한 버퍼는 제거하였다. 각각의 700㎕ RW1, 500㎕의 RPE 버퍼와 80% 에탄올을 이용하여 단계적으로 컬럼 세척을 진행하였다. 위에 사용된 모든 원 심분리(≥8000g 15초)는 동일 조건으로 진행하였다. RNA를 얻기 위하여 14㎕ RNeasy-free 용액을 컬럼에 넣은 후 원심분리((≥8000g 60초)하여 루테이온 RNA를 분리하였다.
지노믹 DNA는 위의 처음 과정에서 AllPrep DNA spin 컬럼에 부착된 DNA를 각 각의 500㎕ AW1과 500㎕ AW2 버퍼를 이용하여 세척하였다. 위에 사용된 모든 원심 분리(≥8000g 15초) 속도와 시간은 RNA 분리과정과 동일 조건하에 진행하였다. 50 ㎕ EB 버퍼를 컬럼에 넣은 후 실온에 2~5분간 방치 후 원심분리((≥8000g 60초)하 여 루테리온 DNA를 분리하였다. Experion RNA(DNA) StdSens(Bio-Rad사) 칩을 이용 하여 정량한 결과, 도 10a 및 도 10b에 나타난 바와 같이, 루테리온에 RNA가 함유 되어 있을 분만 아니라, 도 10c에 나타난 바와 같이, DNA도 함유되어 있는 것을 확 인할 수 있었다. 특히 200~400nm 루테리온에 RNA와 DNA가 함유되어 있는 것을 확인 할 수 있었다.
실시예 5: 루테리온의 배양
(1) 실시예 1에서 수득된 루테리온 중 크기가 약 50~200nm인 루테리온에 PBS를 첨가하고 IR 광선을 조사한 뒤, 약 3시간 동안 18~30℃에서 배양하였다. IR 광선을 조사한 직후부터 약 1시간 간격으로 루테리온의 크기를 현미경으로 확인하였다. 약 1~6시 간 뒤, 배양 전 그 크기가 약 200nm인 루테리온이 약 500nm으로 성장 하였음을 확인할 수 있었다. 이로써, 루테리온에 수분을 첨가하고 IR광선 조사하에 18~30℃에서 배양하는 경우, 그 크기를 500nm정도까지 성장시킬 수 있음을 알 수 있었다.
(2) 실시예 1에서 수득된 루테리온 중 크기가 약 400~800nm인 루테리온에 PBS를 첨가하고 IR광선 조사한 뒤, 약 3시간 동안 18~30℃에서 배양하였다. IR 광 선을 조사한 직후부터 약 1시간 간격으로 루테리온의 크기와 상태를 현미경으로 확 인하였다. 약 1~6시간 뒤, 배양 전 그 크기가 약 400~800nm인 루테리온이 성장하지 는 않고 피션(fission)되는 것을 확인하였다.
(3) 글루코스를 5% 농도로 첨가한 배지 (DMEM 또는 혈액 배지)를 사용하고, pH 7 및 20℃ 조건에서 루테리온을 배양하였다. IR을 조사하여 모여드는 루테리온을 확인하고, 루테리온에 항-CD332 , 항-CD73, 항-CD133, 항-CD39 항체를 결합시키고 항-FITC를 결합시 켜 발색이 확인된 루테리온, 미토트래커로 염색하여 염색된 루테리온 의 수를 카운팅하였다. 그 결과를 아래 표 10에 나타내었다 (+는 루테리온 수의 상대적 비율을 나타냄).
[표 10]
Figure pat00010
실시예 6: 세포 내 도입 여부 확인
루테리 온을 PKH26-1, PKH26-2, PKH26-3 적색형광으로 형광 염색하고, A549 비소세포성 폐암 세포 (ATCC #: CCL-185)와 24시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포 를 고정하고 형태를 현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 14 내지 도 16에 나타내 었다.
도 14를 참조하면, PKH26-1, PKH26-2, PKH26-3 적색형광으로 염색된 루테리 온이 DAPI로 염색된 세포 내 핵에 도입됨을 확인할 수 있으며, 도 15 및 16의 확대 이미지를 확인한 결과 세포 내 핵에 루테리온이 도입됨을 더욱 구체적으로 확인할 수 있다.
실시예 7: BBB (blood-brain barrier) 투과 여부 확인
마우스에 PKH26으로 형 광염색된 루테리온을 복강 내 주사(IP) 및 경구 위관투여법으로 투여 하고, 투여된 루테리온이 BBB를 통과하는지 여부를 확인하였다. 도 17에 따르면, 경구 위관투여시 적어도 3시간 이후 BBB를 통과함을 확인할 수 있다.
또한, 도 18에 따르 면 복강 내 주사시 5분 이내에 BBB를 통과함을 확인할 수 있으며, 도 19에 따르면 복강 내 주사 후 24시간 경과 후에도 심장, 폐, 비장, 간, 췌장, 신장, 고환, 복부 및 장 전신에 분포함을 확인할 수 있다.
실시예 8: 루테리온의 항암 ( 텔로미어/텔로머라제 활성) 효과 확인
(1) 암세포의 텔로머라아제 활성 저해
정상세포(Fibrobl ast) 및 암세포(NCl-H1975, MDA-MA-468, WiDr) 1X106 세포 /ml를 각각 60mm 플레이트에 접종한 다음, 약 12시간 후에 실시예 1에서 분리된 루 테리온을 50㎍/ml의 농도로 처리하여 배양하였다. 세포 배양은 항생제 PSF(antibiotic-antimycotic)가 없는 조건에서, 1% FBS 조건에서 37℃, 5% CO2 배 양기에서 수행하였으며, 1% FBS DMEM 배지를 사용하여 세포 접종 48hr 후에 각각 수확하여 텔로머라아제 활성을 측정하였다.
TRAP 분석으로 (TRAPeze￠c Telomerase Detection Kit (Mil lipore)) 텔로머라아제 활성을 분석한 결과, 루테리온 처리에 의해 암세포(NCl-H1975, MDA-MA-468, WiDr)의 텔로머라아제 발현 및 활성 이 감소되는 것을 확인할 수 있었다 (도 20의 B).
또한, 정상세 포인 Fibroblast를 대상으로, 동일한 실험과 분석을 수행한 결과, 인 간 정상세포에서는 대조군(루테리온 미처리군)에 비해 텔로머라아제 발현 및 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다 (도 20의 A).
(2) 루테리온 처리에 의한 암세포 증식 억제
여러 종류의 인간 암세포주 (폐암(NCI-H1975), 대장암(WiDr), 유방암(MDA- MB-486), 간암(HCC38), 백혈병(AGH-77)) 및 정상세포주 (fibroblast)에서 루테리온 의 암세포에 대한 세포독성을 측정하기 위해 MTT 분석을 실시하였다.
5x104 세포/ml (8 x 103 / well)의 세포 부유물을 96-웰(well) 바닥이 평편한 마이크로타이터 판의 각 웰(well)에 100 ㎕씩 접종하고 24 시간 동안 배양시킨 후, 여러 가지의 농도의 루테리온를 포함하고 있는 배지로 교체한 후, 다시 48 시간 배 양시켰다. 그 후 각 웰에 배지로 10배 희석된 비수용성의 노란색 MTT (3-(4,5- dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액 100 ㎕를 첨가한 다. 세포 내 포마잔 결정이 생성되도록 37℃ 온도 및 5% 이산화탄소 농도의 인큐베 이터에 보관하였다. 약 4시간 후 여분의 배지를 제거한 후 세포내 형성된 비수용성 의 포마잔을 용해시키기 위해 각 웰에 DMSO를 200 ㎕씩 첨가한 후 마이크로플레이 트 리더를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 분석하였다.
루테리온을 처리하지 않은 대조군의 흡광도를 10 0%로 하여 각각의 농도에 대한 암세포의 생존율을 측정한 결과, 농도 의존적으로 암세포의 생존율을 감소시켰다. 반면, 정상세포에서는 세 포독성이 없었다 (도 21).
아울러, 상기 암세포주 외에 AsPC-1 췌장암 세포주, A549 폐암 세포주, BT- 20 유방암 세포주에서 다양한 유래의 루테리온의 암세포 증식 억제효과를 확인하였 다. 세포 생존률 측정은 상기 MTT 분석법과 동일하게 수행하였으며, 실시예 1의 방 법으로 분리한 다양한 유래의 루테리온은 암세포에 대해 세포 증식 억제효과를 나 타냈다 (도 22 내지 도 24).
따라서, 본 발명의 루테리온은 암세포의 증식을 억제하여 암을 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 9: 루테리온의 정상세포에서 텔로머라아제 활성 증가
정상세포(Fibroblast) 1X106 세포/ml를 각각 60mm 플레이트에 접종한 다음, 약 12시간 후에 실시예 1에서 분리된 루테리온을 50㎍/ml의 농도로 처리하여 배양하였다. 세포 배양은 항 생제 PSF(antibiotic-antimycotic)가 없는 조건에서, 1% FBS DMEM 배 지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 수행하였다. 세포 접종 48시간 후에 수확하여 텔로머라아제 활성을 측정하였다.
TRAPeze￠c Telomerase Detection Kit (Millipore)를 이용한 TRAP 분석으로 텔로머라아제 활성을 분석한 결과, 루테리온 처리에 의해 정상세포인 Fibroblast의 텔로머라아제 발현 및 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다 (도 25).
실시예 10: 루테리온의 ATP 생성에의 영향
루테리온 처리에 의한 암세포 및 Fibroblast 정상세포에서의 ATP 생성증가를 확인하기 위해, 암세포 3종 A549, WTM266-4 및 AsPC-1 및 정상세포(MRC-5) 1X106 세 포/ml를 일반 DMEM 배지의 60mm 플레이트에 접종하여 1일간 배양한 후, 항생제 PSF(antibiotic-antimycotic)가 없는 조건에서, 0.1% FBS DMEM 배지를 사용하여 영 양 기아 (serum starvation) 상태로 다시 1일간 배양하였다. 그 다음 3일째, 실시 예 1에서 분리한 루테리온을 50㎍/ml의 농도로 처리한 후, 0, 10, 30, 120분에 ATP 생성을 측정하였다 (도 26). ATP 측정 kit는 Abcam (Cambridge, MA, USA)사에서 구 입하여 사용하였다.
그 결과, 루테리온을 처리한 정상세포에서 ATP의 생성이 현저히 증가한 것을 확인하였다 (도 39). 또한, 루테리온을 처리한 암세포에서 ATP 생성이 저하됨을 확 인하였다 (도 38).
따라서, 본 발명의 루테리온은 정상세포의 에너지 생성을 증가시켜 노화를 억제할 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 암세포의 에너지 생성을 저하시켜 암 치료 에 적용할 수 잇다. 이를 통해 정상세포에는 영향을 미치지 않으면서 암세포 특이 적 항암 치료를 고려할 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실 시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구 항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (35)

  1. 다음에서 선택된 하나 이상의 특성을 가지는 루테리온:
    (a) 5 0~800nm의 원형 내지 타원형으로, 운동성이 있음;
    (b) 핵산 함유;
    (c) 면역화학형광염색시 미토콘드 리아와 유사한 반응을 나타냄;
    (d) 퓨전(fusion) 및/또는 피션(fission) 생태양식을 나타냄;
    (e) 퓨 전이 없을 경우 크기가 500nm까지 성숙하고, DNA 함유 유사 미토콘드 리아로 성숙하며, SEM 또는 TEM 전자현미경사진상에서 미토콘드리아와 유사한 구조 를 나타냄;
    (f) 엑소좀과는 다른 빛 반응을 나타냄;
    (g) IR 조사시 또는 가압시 피션 (fission)이 발생함;
    (h) 표면항원으로 CD332, CD133, CD73 또는 CD39를 발현함;
    (i) 자가형광 (autofluorescen ce)을 나타냄;
    (j) 200~400nm 크기에서 ATP를 생성함;
    (k) 이중막 또는 다중막 구조;
    (l)부착 성이 있음;
    (m) 암세포의 텔로머라제 활성 억제;
    (n) 정상세포의 텔로머라제 활성 촉진;
    (o) 세 포 투과능; 및
    (p) 혈뇌장벽 (BBB) 투과능.
  2. 제1항에 있어서, 로다민123(Rhodamine123), 미토트랙커(Mito- tracker), 아 크리딘 오렌지(Acridine Orange), DAPI, 및 야누스 그린 B (Janus green B)로 구성 되는 군에서 선택되는 1 이상의 염색약으로 염색할 경우, 발색되는 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 루테리온.
  3. 다음 단계를 포함하는 루테리온의 분리방법:
    (a) 식물 또는 식품의 수증기 또는 가스 진탕 추출물을 냉각하여 수득한 응 축액을 0.8~1.2μm의 공극을 가지는 필터를 이용하여 필터링하는 단계;
    (b) 상기 필터링된 응축액을 원 심분리하는 단계; 및
    (c) 상기 원심분리된 상등액으로부터 루테리온을 분리하는 단계.
  4. 제3항에 있어서, 상기 식물은 표 1~4에서 선택되 는 약용식물인 것을 특징으로 하는 분리방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 식물은 당귀, 칠피 및 키위로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  6. 제3항에 있어서 , 상기 (a) 단계의 진탕 추출은 식물 또는 식품에 용매를 첨가하고, 50~90℃에서 기체를 이용하여 간헐적으로 버블링시키면서 진탕하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 진탕 추출은 8~10시간 동 안 진탕하며, 2~3시간마다 20~30분 동안 버블링하여 식물 또는 식품 의 루테리온 엉기지 않도록 하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  8. 제3항에 있어서 , 상기 (a) 단계에서 수득된 응축액에 IR광선을 조사하는 단계를 추 가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  9. 제3항에 있어서, 상기 (b) 단계의 원심분리는 1 200~5000 rpm에서 5~10분간 반복적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  10. 제3항에 있어서, 상기 (c) 단계는 원심분리된 상등액에 200-600um 파장의 IR광선을 조사하여 운동성을 가지며 모여드는 루테 리온 입자를 분리하거나, 루테리온 표면항원 CD39, CD73, CD133 또는 CD332를 인지하는 결합체와의 결합 여부를 확인하여 루테리온 입자를 분리하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  11. 제3항에 있어서, 상기 분리된 루테리온 입자를 50nm 필터로 필터링한 다음, 필터에 걸린 부위를 수집하는 단계를 추 가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  12. 제11항에 있어서, 200nm, 400nm, 600nm, 800nm 및 1000nm 필터를 순차적으로 이용하여, 각각 50~200nm, 200~ 400nm, 400~600nm, 600~800nm 및 800~1000nm 크기의 루테리온으로 분 류하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  13. 제3항에 있어서,
    pH 7 이하 및 0℃ 이하에서 고정시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으 로 하는 분리방법.
  14. 제3항에 있어서,
    pH 1-5 및 -90℃~0℃에서 고정시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  15. 제3항에 있어서,
    25,000-35,000 psi(pound per square inch) 이상의 압력을 가하여 피션을 유도하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  16. 제3항에 있어서,
    pH 1-3 및 10-20℃에서 피션을 유도하여 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  17. 다음 단계를 포함하는 루테리온의 분리방법:
    (a) 루테리온을 함유하는 추출물에 루테리온 표면항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머가 고정된 입자를 첨가하여 루테리온과 입자의 결합을 유도하 는 단계; 및
    (b) 상기 입자에 결합된 루테리온을 회수하는 단계.
  18. 제17항에 있어서, (c) 입자에 결합된 루테리온 에서 루테리온 만을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 루테리온의 분 리방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 루테리온을 함유하는 추출물은 식물 추출물 또는 식품추추물인 것을 특징으로 하는 루테리온 분리방법.
  20. 제17항에 있어 서, 상기 루테리온을 함유하는 추출물은 (i) 식물 또는 식품의 열수 추출물, (ii) 식물 또는 식품의 용매 추출물, 또는 (iii) 용매 존재하에 식물 또는 식품의 가열에 의해 발생하는 가스의 응축액인 것을 특징으로 하는 루테리온 분리방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 응축액은 다음 단계를 거쳐 제조 된 것임을 특징으로 하는 분리방법.
    (i) 식물 또는 식품에 용매를 첨가하고, 50~90℃에서 기체를 이용하여 간헐 적으로 버블링 시키면서 진탕하는 단계;
    (ii) 상기 진탕에 의해 기화되는 수증기 또는 가스를 포집한 다 음, 냉각시켜 응축액을 수득하는 단계.
  22. 제17항에 있어서, 상기 루테리온 표면항원은 C D39, CD73, CD133 또는 CD332인 것을 특징으로 하는 루테리온의 분리 방법.
  23. 제17항에 있어서, 상기 입자는 자성입자, 실리카입자, 양자점입자, 유리입자, 고분자입자, 섬유입자 및 형광입자로 구성된 군으로부터 선택되는 것임 을 특징으로 하는 루테리온의 분리방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 자성입자는 철, 알루미 늄, 코발트, 니켈, 망간, 주석, 아연, 카드뮴, 마그네슘, 구리, 바튬 , 리튬 또는 이트륨의 산화물로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징 으로 하는 루테리온의 분리방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 자성입자는 탄소 및 항 체 또는 압타머 결합을 위한 작용기로 이중 코팅된 것임을 특징으로 하는 루테리온의 분리방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 작용기는 아마이드기(a mide group), 에스테르기(ester group), 아민기(amine group), 카르 복실기(carboxyl group) 로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 루테리온의 분리방법.
  27. 제17항에 있어서, 상기 입자의 크기는 10~1,00 0nm인 것을 특징으로 하는 루테리온의 분리방법.
  28. 제17항에 있어서, 상기 입자는 자성나노입자이고, 상기 (b) 단계는 외부에서 자성을 가하여 루테리 온이 결합된 자성나노입자를 모은 다음, 회수하는 것을 특징으로 하는 루테리온의 분리방법.
  29. 제17항에 있어서, 상기 입자는 형광입자이고, 상기 (b) 단계는 형광이용 분류기를 이용하여 루테리온이 결합된 형 광입자를 회수하는 것을 특징으로 하는 루테리온의 분리방법.
  30. 제17항에 있어서, 상 기 입자는 정전기를 띤 입자이고, 상기 (b)단계는 불균일한 전기장을 정전기적 인력으로 루테리온이 결합된 입자를 회수하는 것을 특징으 로 하는 루테리온의 분리방법.
  31. 제17항에 있어서, 상기 입자는 이온성 입자이고 , 상기 (b)단계는 정전기적 인력을 이용하여 루테리온이 결합된 입자 를 회수하는 것을 특징으로 하는 루테리온의 분리방법.
  32. 제1항의 루테리온에 수분 을 첨가하고 IR광선 조사 또는 가압하에 18~30℃에서 증식시키는 단 계를 포함하는 루테리온의 배양방법.
  33. 제1항의 루테리온을 당 포함 배지에서 pH 5-9 및 18~30℃ 조건으로 증식시키는 단계를 포함하는 루테리온의 배양방 법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 당은 람노스(rhamnose), 글루코스(glucose), 갈락토 스(galactose), 프럭토스(fructose) 또는 자일로스(xylose)인 것을 특징으로 하는 배양방법.
  35. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 배양 전 및 후 투테 리온의 크기는 각각 50~200nm 및 300~500nm인 것을 특징으로 하는 배 양방법.
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