CN114621926B - 一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法和应用 - Google Patents

一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请实施例提供了一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法，包括以下步骤：提供含有微纳米生物活性物质的待测样品；用含DNA探针的第一缓冲溶液对所述待测样品进行预处理后，转移至含有第一茎环结构链的第二缓冲溶液中，得到第一溶液；使用微液滴生成装置，将第一溶液形成油包水微液滴，每个所述油包水微液滴均注入有等量含第二茎环结构链的第三缓冲溶液，收集所述油包水微液滴，经恒温培养后，所述含有所述微纳米生物活性物质的油包水微液滴固化形成水凝胶微胶囊；过膜处理，收集所述水凝胶微胶囊，以实现对所述微纳米生物活性物质分离捕获。该方法简单、高效，有效保留微纳米生物活性物质的高生物活性。本申请还提供了该方法的应用。

Description

一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法和应用
技术领域
本申请涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法和应用。
背景技术
CTC(Circulating Tumor Cell,循环肿瘤细胞)是进入人体外周血的肿瘤细胞的通称。研究表明，CTC在导致超过90％的癌症相关的死亡的肿瘤细胞恶性转移过程中均扮演着重要角色，因此，CTC被认为是一种非常具有潜力的标志物，对癌症诊断、病情预测和治疗效果评估都发挥重要作用。目前，对于一些小尺寸的生物活性物质(例如CTC)的高效分离捕获还没有一种有效的方法。像通过流式细胞仪分选或激光捕获显微切割技术等方法对CTC的分离，存在设备笨重且操作流程复杂的问题，大大影响CTC的生物活性。传统微流控技术分离CTC过程中又容易对细胞造成损伤，且很难实现对CTC的高效分析鉴定，同样容易对CTC的活性和功能造成伤害。
因此，有必要开发一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法，能够实现高效、高灵敏度地分离和捕获，且保留高生物活性。
发明内容
有鉴于此，本申请实施例提供了一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法和应用，该方法能够实现对微纳米生物活性物质高效、高灵敏度地分离和捕获，且保留高生物活性。该方法操作简单，成本低，适用于包括细胞、囊泡、核酸和蛋白质等小尺寸的生物活性物质的分离和捕获，尤其是对于单细胞。
第一方面，本申请提供了一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法，包括以下步骤：
提供待测样品，所述待测样品内含有微纳米生物活性物质；
用含DNA探针的第一缓冲溶液对所述待测样品进行预处理后，转移至含有第一茎环结构链的第二缓冲溶液中，得到第一溶液，所述DNA探针包括引发链和连接在所述引发链一端的靶向序列，所述靶向序列用于靶标所述微纳米生物活性物质；
使用微液滴生成装置，将所述第一溶液形成油包水微液滴，每个所述油包水微液滴形成过程中，均注入有等量含第二茎环结构链的第三缓冲溶液，收集所述油包水微液滴，经恒温培养后，靶标在所述微纳米生物活性物质上的引发链触发所述第一茎环结构链和所述第二茎环结构链杂交，以使所述含有所述微纳米生物活性物质的油包水微液滴固化形成水凝胶微胶囊；
将所述经恒温培养后的所述油包水微液滴进行过膜处理，收集所述水凝胶微胶囊，以实现对所述微纳米生物活性物质分离捕获。
本申请实施方式中，当引发链、第一茎环结构链和所述第二茎环结构链共存于一个体系之中时，所述引发链能够触发第一茎环结构链和所述第二茎环结构链杂交，自组装形成稳定三维网状结构的DNA水凝胶。由于DNA探针中的引发链被靶标在待分离捕获的微纳米生物活性物质上，因此，只用包含有微纳米生物活性物质的油包水微液滴才能顺利固化形成水凝胶微胶囊。
本申请实施方式中，所述水凝胶微胶囊为一种DNA水凝胶，其为高度含水的三维网络状“软物质”，对于包裹在其中的微纳米生物活性物质可以起到很好的保护作用。所述水凝胶微胶囊的微观结构和性质类似于细胞外基质，当微纳米生物活性物质为细胞时，可以直接将其置于水凝胶微胶囊内进行培养，对细胞的生物活性影响可以忽略。本申请所述方法形成的水凝胶微胶囊可以很好地保持微纳米生物活性物质的高生物活性。
可选地，所述恒温培养的温度为0-37℃，时间为3-24小时。可选地，所述恒温培养的温度为25-37℃，时间为3-12小时。进一步地，可选地，所述恒温培养的温度为35-37℃，时间为3-5小时。例如，所述恒温培养的温度为37℃，时间为3小时。本申请实施方式中，所述恒温培养条件下，含有所述微纳米生物活性物质的油包水微液滴能够更快、更好地固化形成水凝胶微胶囊，减少对其生物活性的不利影响。
可选地，所述引发链包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
所述第一茎环结构链包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，第二茎环结构链包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，或者所述第一茎环结构链包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，第二茎环结构链包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
本申请实施方式中，每个一所述微纳米生物活性物质粒子独立分布在一个所述油包水微液滴之中。通过调节微液滴生成装置的参数，从而可以调节油包水微液滴的尺寸大小，以使由所述微液滴生成装置生成的含有微纳米生物活性物质的油包水微液滴内仅单独分布一个所述微纳米生物活性物质粒子。例如，当所述微纳米生物活性物质为细胞时，所述水凝胶微胶囊内仅存在单细胞。
可选地，所述微纳米生物活性物质的横向尺寸小于或等于80μm。可选地，所述微纳米生物活性物质的横向尺寸小于或等于50μm。可选地，所述微纳米生物活性物质的横向尺寸小于或等于30μm。例如，所述微纳米生物活性物质的横向尺寸为1-20μm。或者，所述微纳米生物活性物质的横向尺寸为1-10μm。
本申请实施方式中，所述方法能够对小尺寸的微纳米生物活性物质进行分离和捕获，灵敏度高，分离纯度高。例如对CTC的分离捕获，由于CTC本质上仍然是尺寸仅有10微米左右的单个细胞，传统方法中很难高灵敏性、高纯度地分离获得CTC，分离的CTC中还混合有其他物质，如其他细胞或蛋白，本申请所述方法可以很好地解决这种小尺寸且含量低的微纳米生物活性物质的分离和捕获。
可选地，所述微纳米生物活性物质包括细胞、囊泡、核酸和蛋白质中的至少一种。
可选地，所述微纳米生物活性物质包括肿瘤细胞、囊泡、核酸和蛋白质中的至少一种。例如，所述微纳米生物活性物质包括肿瘤细胞、囊泡、核酸或蛋白质。或者，所述微纳米生物活性物质包括肿瘤细胞或囊泡。或者，所述微纳米生物活性物质为肿瘤细胞。所述肿瘤细胞可以但不限于为恶性肿瘤细胞。例如，所述肿瘤细胞选自人非小细胞肺癌细胞、人卵巢癌细胞、人肝癌细胞、人乳腺癌细胞、人喉癌细胞、人结直肠癌细胞和人黑色素瘤细胞中的至少一种。可选地，所述肿瘤细胞还可以为循环肿瘤细胞(CTC)。
可选地，所述微纳米生物活性物质为循环肿瘤细胞，所述DNA探针的所述靶向序列包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。本申请实施方式中，包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的DNA探针能够特异性的识别CTC细胞，并固定在CTC细胞表面，以使含有CTC细胞的油包水微液滴内存在用于触发第一茎环结构链和所述第二茎环结构杂交形成DNA水凝胶的引发链，从而所述方法最后收集的每个水凝胶微胶囊内均含有单个CTC细胞。
可选地，所述DNA探针中，所述引发链与所述靶向序列直接连接，或所述引发链与所述靶向序列之间包括由至少一个核苷酸组成的linker。一实施方式中，所述DNA探针包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
本申请实施方式中，由于微纳米生物活性物质尺寸很小，难以在实际操作中实现高效分离捕获，而水凝胶微胶囊的尺寸要明显大于微纳米生物活性物质，所述水凝胶微胶囊的尺寸可以为50-200μm，利用水凝胶微胶囊包裹微纳米生物活性物质，通过分离捕获水凝胶微胶囊，就能更高效地获得待测样品中的微纳米生物活性物质。
可选地，所述微液滴生成装置包括微流控芯片，所述微流控芯片包括液滴生成单元和液体注入单元，所述液滴生成单元用于将所述第一溶液形成初始油包水微液滴，所述液滴生成单元至少包括油相微流道、水相微流道和液滴输出流道，所述油相微流道和所述水相微流道十字交汇，所述液体注入单元用于向所述初始油包水微液滴内注入所述等量含第二茎环结构链的第三缓冲溶液，得到所述油包水微液滴，所述液体注入单元设置在所述液滴输出流道上。
可选地，所述液体注入单元包括至少一个设置在所述液滴输出流道上的液体注入口，所述液体注入口采用电极诱导方式控制所述含第二茎环结构链的第三缓冲溶液的注入量。
可选地，所述第一溶液还含有BSA(牛血清白蛋白)，所述BSA的质量浓度为0.1％-0.3％。本申请实施方式中，含有所述浓度范围BSA的第一溶液，可以有效防止第一溶液中的待测的微纳米生物活性物质之间聚集成团，使微纳米生物活性物质更好地分散。在通过微液滴生成装置中，含有所述浓度范围BSA的第一溶液可以有效避免在生成油包水微液滴过程中与微液滴生成装置内壁发生粘附，导致大量聚集，降低液滴生成效率。
可选地，所述液滴输出流道的宽度为100μm-200μm，所述液体注入口的直径为5μm-20μm。
本申请实施方式中，所述油相微流道、水相微流道交汇产出初始油包水微液滴的喷口宽度为70μm-90μm。不同种类的微纳米生物活性物质，其尺寸也会有差异，根据不同待测微纳米生物活性物质的尺寸大小，通过调节油相微流道、水相微流道和/或喷口的尺寸，可以有效控制液滴形成大小，有利于实现每个一所述微纳米生物活性物质粒子独立分布在一个所述油包水微液滴之中。
可选地，所述过膜处理之后，所述收集所述水凝胶微胶囊之前，还包括：
使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液对所述水凝胶微胶囊进行冲洗，然后用PBS缓冲液再次冲洗后，吸干水分；其中，所述十六烷基三甲基溴化铵溶液的质量浓度为0.5％-1.5％。本申请实施方式中，对所述水凝胶微胶囊进行冲洗及吸干水分，可以进一步纯化所述水凝胶微胶囊，去除其他杂质。
可选地，还包括：采用DNA酶溶液对所述收集的所述水凝胶微胶囊进行消化处理，以释放获得所述微纳米生物活性物质。本申请实施方式，采用DNA酶溶液对水凝胶微胶囊进行处理，以释放微纳米生物活性物质的过程，对微纳米生物活性物质的损伤可以忽略，几乎不影响其生物活性。
进一步地，可选地，所述DNA酶溶液的浓度为0.5-2U/μL，所述消化处理的时间为10-60min。例如，所述DNA酶溶液的浓度为0.5U/μL、1U/μL、1.5U/μL、1.8U/μL或2U/μL。所述消化处理的时间为10min、20min、30min、40min、50min或60min。本申请实施方式中，所述浓度范围的DNA酶溶液能更好地释放水凝胶微胶囊内的微纳米生物活性物质。
可选地，所述预处理过程包括向所述待测样品内添加所述含DNA探针的第一缓冲溶液，0-10℃内孵育15-60min，离心，清洗2-3次后，重悬。本申请实施方式中，使用磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液等常规缓冲液对离心后的沉淀进行反复清洗。可选地，所述离心的转速为800-2000rpm。例如，所述离心的转速为1000rpm。可选地，所述孵育温度为0-4℃，孵育时间20-60min。例如，所述孵育温度为4℃，孵育时间30min。本申请实施方式中，所述参数下的预处理过程，一方面可以使DNA探针高效靶标到微纳米生物活性物质，实现全覆盖；另一方面能够更好的保护微纳米生物活性物质，减少预处理过程中的损伤。
可选地，所述孵育过程中，所述DNA探针的浓度为300-1500μM。进一步地，可选地，所述孵育过程中，所述DNA探针的浓度为300-500μM。通过调节所述DNA探针的浓度，可以使待测样品中的微纳米生物活性物质更好地被DNA探针靶标到，实现全覆盖，有利于后期分离过程中尽可能高效分离捕获待测样品中的全部微纳米生物活性物质。
可选地，所述第一缓冲溶液、第二缓冲溶液、第三缓冲溶液可以相同也可以不同。所述第一缓冲溶液、第二缓冲溶液、第三缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液中的一种或多种。可选地，所述第一缓冲溶液、第二缓冲溶液、第三缓冲溶液还包括其他种类缓冲液，例如，磷酸钠缓冲液。可选地，所述第一缓冲溶液、第二缓冲溶液、第三缓冲溶液的浓度为10-1000mmol/L。进一步可选地，所述第一缓冲溶液、第二缓冲溶液、第三缓冲溶液的浓度为10-1000mmol/L。
本申请第一方面所述分离捕获微纳米生物活性物质的方法，可以实现对待测样品中的微纳米生物活性物质快速、高效分离和捕获。所述方法分离捕获的微纳米生物活性物质生物活性高，以便能够更好地被用于生物医学研究。
第二方面，本申请还提供了一种如本申请第一方面所述分离捕获微纳米生物活性物质的方法在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
所述应用可以为：快速、准确地测定待测样品内肿瘤细胞(如癌细胞或循环肿瘤细胞)的数量变化。通过统计肿瘤细胞的数量，有利于在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗恶性肿瘤的药物的成产或测试研究方面提供重要指导依据。
可选地，本申请所述分离捕获微纳米生物活性物质的方法还可以用于生物医学、干细胞研究等众多领域。由于所述微纳米生物活性物质可以为单细胞，在与细胞相关的研究和分析工作，通过利用所述分离捕获微纳米生物活性物质的方法，可以实现更加方便、快速、准确地从数量庞大的细胞体系中分离捕获单细胞，因此，所述方法在生物医学分析方面也有着巨大的优势和前景。
本申请的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本申请实施例的实施而获知。
附图说明
为更清楚地阐述本申请的内容，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。
图1为本申请一实施例提供的分离捕获微纳米生物活性物质的方法的工艺流程图；
图2为本申请一实施例提供的分离捕获微纳米生物活性物质的方法的流程示意图；
图3为本申请一实施例提供的微液滴生成装置的液体注入单元在正压、负压和电极诱导下进行注入的实际效果图；
图4为本申请一实施例提供的第一溶液优化前后的液滴生成效果图；
图5为本申请一实施例提供的不同孔径的微孔滤膜图；
图6为本申请一实施例提供的不含CTC的液滴和含有CTC的水凝胶微胶囊展示图；
图7为本申请一实施例提供的对收集的含有CTC的水凝胶微胶囊转移过程效果图。
具体实施方式
以下所述是本申请实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本申请实施例的保护范围。
本申请说明书、权利要求书和附图中出现的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。本申请中“第一”、“第二”等术语仅用于对象的区分，并不是指特定的顺序。
若无特别说明，本申请实施例所采用的原料及其它化学试剂皆为市售商品。
本申请一实施例提供了一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法，如图1所示，包括以下步骤：
S01、提供待测样品，所述待测样品内含有微纳米生物活性物质；
S02、用含DNA探针的第一缓冲溶液对所述待测样品进行预处理后，转移至含有第一茎环结构链的第二缓冲溶液中，得到第一溶液，所述DNA探针包括引发链和连接在所述引发链一端的靶向序列，所述靶向序列用于靶标所述微纳米生物活性物质；
S03、使用微液滴生成装置，将所述第一溶液形成油包水微液滴，每个所述油包水微液滴形成过程中，均注入有等量含第二茎环结构链的第三缓冲溶液，收集所述油包水微液滴，经恒温培养后，靶标在所述微纳米生物活性物质上的引发链触发所述第一茎环结构链和所述第二茎环结构链杂交，以使所述含有所述微纳米生物活性物质的油包水微液滴固化形成水凝胶微胶囊；
S04、将所述经恒温培养后的所述油包水微液滴进行过膜处理，收集所述水凝胶微胶囊，以实现对所述微纳米生物活性物质分离捕获。
实施例一一种分离捕获循环肿瘤细胞的方法，工艺示意图如图2所示，包括以下几部分内容：
1、液滴生成装置的制备方法，包括：
该液滴生成装置包括PDMS材质的微流控芯片和含电极的玻璃片组成。通过标准的软光刻工艺加工该微流控芯片和微孔滤膜。微流控芯片流道宽度100μm，液滴生成喷口宽度75μm，液滴注入喷口宽度25μm；微孔滤膜孔径包括10μm,70μm和90μm。将铂电极通过磁控溅射工艺固定在玻璃片表面。将制作好的PDMS芯片，与带有电极图案的玻璃片在显微镜下对准，使两块电极位于液体注入喷口流道两侧，在80℃烘箱中键合过夜，即可使用。
2、DNA探针的制备和DNA水凝胶体系制备。
所有DNA探针经设计后，采用人工合成方式合成或第三方基因合成公司合成。所述DNA探针包括引发链(I)和连接在引发链(I)一端的靶向序列(A)，配制特异性识别循环肿瘤细胞的DNA探针(I+A)，浓度200μM，体积50μL，在95℃加热5分钟，在室温中冷却1个小时后备用。
DNA水凝胶体系中的第一茎环结构链(H2)和第二茎环结构链(H1)可被引发链(I)触发杂交，以形成稳定DNA水凝胶。其中H1和H2溶液(3mM，50μL)分别在95℃加热5分钟，在冰上急速冷却1个小时以上备用。
各个序列具体为：
I：
5’-CTAGAGCACAATCACAGGAGCCAGTTTACGTATGCCGTAAGCTTTGC-3’
A：
5’-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTGTTTGCAAAGCTTACGGCATACGT-3’
H1：
5’-GATCGCGATCCTGGCTCCTGTGATTGTGCTCTAGACATCGCTAGAGCACAATCACAGG-3’
H2:
5’-CTAGAGCACAATCACAGGAGCCAGTTTTCCTGTGATTGTGCTCTAGCGATGT-3’
3、循环肿瘤细胞样品的前处理。
向含有循环肿瘤细胞的待测样品中加入DNA探针溶液(I+A混合液)50μL，4℃孵育半个小时。在1000rpm下离心3分钟，用移液器移去上层溶液，加入1mL 1xPBS，洗三次，最后一次离心过后，用含有50％细胞悬浮液的1xPBS进行稀释，将细胞数量控制在106个/mL的数量级。将上述溶液8μL与H2溶液1.5μL，1％BSA溶液1.5μL进行混合，制成第一溶液，4℃孵育1个小时。将H1溶液1.5μL与9.5μL 1xPBS进行混合，制成第二溶液，备用。
4、液滴生成与电极诱导注入，生成含有CTC的水凝胶微胶囊。
将第一溶液通入液滴生成装置，调节其中微流控芯片不同入口的气压，形成直径100μm的“油包水”微液滴。将第二溶液由电极诱导注入的液体注入口注入芯片，通过调节电极两端的电压，使得液滴经过液体注入口时，发生界面融合，从而使得第二溶液可以与第一溶液进行混合。调节第一溶液和第二溶液的比例，可以通过调节气压和电压实现1：1的混合。待全部溶液都生成液滴后，将生成的液滴转移至37℃恒温培养箱，孵育3个小时，含有CTC的油包水微液滴会固化的水凝胶微胶囊。
5、含有CTC的水凝胶微胶囊的回收与便捷操作
将固化的水凝胶微胶囊倒在微孔滤膜上，用1％CTAB溶液进行冲洗，将未固化液滴完全破裂，再用1xPBS洗去表面活性剂CTAB，从滤膜底部用吸水纸吸走多余溶液。滤膜上面留下的水凝胶微胶囊就是目标CTC的水凝胶微胶囊。取含有CTC的水凝胶微胶囊，用2.5μL移液器吸取少量1xPBS,滴在水凝胶微胶囊上，再在显微镜下挑取和转移。用DNA酶溶液1U/μL进行消化45分钟即可释放CTC。
效果实施例
1、不同探针混合方式的影响
如图3的(A)、(B)、(C)所示，分别对正压、负压和电极诱导方式注入第二溶液的实验效果进行测试。其中，DNA探针、H1和H2混合后在液滴生成装置上生成液滴时，采用正压操控方式，操作难度大。而负压可以很好地保证两种探针的等比例混合，然而，在形成液滴之前，H1和H2有短暂的接触，导致长时间生成液滴过程中，发生水凝胶固化，堵塞流道。采用电极诱导注入的方式能够很好地引发反应，防止反应前H1和H2接触。
2、细胞在微液滴生成过程与芯片的粘附
细胞样品在生成液滴过程中容易与PDMS芯片表面发生粘附，导致大量聚集，降低芯片的效率。通过优化，在第一溶液中加入0.1％BSA能够很好地解决这一问题，使得细胞有效分散成单细胞，形成单细胞的液滴包裹，参见图4。
实验过程中，使用的10μm,70μm和90μm不同孔径的微孔滤膜如图5所示。从图6可以看出，不含CTC的液滴与含有CTC的水凝胶微胶囊之间是存在明显差别的，通过微孔滤膜可以实现有效分离捕获。从对分离含有CTC的水凝胶微胶囊进行转移过程中不会存在丢失或失活，可以用移液器很容易的挑选出目标水凝胶微胶囊，并进行转移。如图7所示，图7中(A)为经过膜处理后收集的水凝胶微胶囊，图7(B)为挑选转移的单个水凝胶微胶囊。可以看出，所述方法收集的每个水凝胶微胶囊中均含有一个CTC；从收集的水凝胶微胶囊中可以很容易地挑选出目标水凝胶微胶囊，不会对CTC活性造成影响。然后采用DNA酶溶液可以释放挑选出目标水凝胶微胶囊内的单个CTC细胞。
本申请实施例提供的分离捕获微纳米生物活性物质的方法，该方法能够实现对微纳米生物活性物质(如CTC)高效、高灵敏度地分离和捕获，且保留高生物活性。该方法操作简单，成本低，可以适用于包括细胞、囊泡、核酸和蛋白质等小尺寸的生物活性物质的分离和捕获，尤其是对于单细胞。
需要说明的是，根据上述说明书的揭示和阐述，本申请所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本申请并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本申请的一些等同修改和变更也应当在本申请的权利要求的保护范围之内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本申请构成任何限制。
序列表
<110> 深圳先进技术研究院
<120> 一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctagagcaca atcacaggag ccagtttacg tatgccgtaa gctttgc 47
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatcgcgatc ctggctcctg tgattgtgct ctagacatcg ctagagcaca atcacagg 58
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctagagcaca atcacaggag ccagttttcc tgtgattgtg ctctagcgat gt 52
<210> 4
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cactacagag gttgcgtctg tcccacgttg tcatgggggg ttggcctgtt tgcaaagctt 60
acggcatacg t 71
<210> 5
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cactacagag gttgcgtctg tcccacgttg tcatgggggg ttggcctgtt tgcaaagctt 60
acggcatacg tctagagcac aatcacagga gccagtttac gtatgccgta agctttgc 118

Claims (10)

1.一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供待测样品，所述待测样品内含有微纳米生物活性物质；
用含DNA探针的第一缓冲溶液对所述待测样品进行预处理后，转移至含有第一茎环结构链的第二缓冲溶液中，得到第一溶液，所述DNA探针包括引发链和连接在所述引发链一端的靶向序列，所述靶向序列用于靶标所述微纳米生物活性物质；
使用微液滴生成装置，将所述第一溶液形成油包水微液滴，每个所述油包水微液滴形成过程中，均注入有等量含第二茎环结构链的第三缓冲溶液，收集所述油包水微液滴，经恒温培养后，靶标在所述微纳米生物活性物质上的引发链触发所述第一茎环结构链和所述第二茎环结构链杂交，以使所述含有所述微纳米生物活性物质的油包水微液滴固化形成水凝胶微胶囊；
将所述经恒温培养后的所述油包水微液滴进行过膜处理，收集所述水凝胶微胶囊，以实现对所述微纳米生物活性物质分离捕获。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引发链的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述第一茎环结构链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，第二茎环结构链的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，或者所述第一茎环结构链的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，第二茎环结构链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微纳米生物活性物质选自细胞、囊泡、核酸和蛋白质中的至少一种。
4.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述微纳米生物活性物质为循环肿瘤细胞，所述DNA探针的所述靶向序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微液滴生成装置包括微流控芯片，所述微流控芯片包括液滴生成单元和液体注入单元，所述液滴生成单元用于将所述第一溶液形成初始油包水微液滴，所述液滴生成单元至少包括油相微流道、水相微流道和液滴输出流道，所述油相微流道和所述水相微流道十字交汇，所述液体注入单元用于向所述初始油包水微液滴内注入所述等量含第二茎环结构链的第三缓冲溶液，得到所述油包水微液滴，所述液体注入单元设置在所述液滴输出流道上。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述液体注入单元包括至少一个设置在所述液滴输出流道上的液体注入口，所述液体注入口采用电极诱导方式控制所述含第二茎环结构链的第三缓冲溶液的注入量。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒温培养的温度为0-37℃，时间为3-24小时。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一溶液还含有BSA，所述BSA的质量浓度为0.1%-0.3%。
9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，还包括：采用DNA酶溶液对所述收集的所述水凝胶微胶囊进行消化处理，以释放获得所述微纳米生物活性物质。
10.一种如权利要求1-9任一项所述分离捕获微纳米生物活性物质的方法在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
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