JP6483240B2 - 希少ジンセノサイドを高含量で含有する、山参もしくは高麗人参を含む高麗人参類の抽出物または高麗人参類の形成層由来植物幹細胞もしくはその抽出物の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、希少ジンセノサイドの含有量が増大できるようにする山参または高麗人参を含む高麗人参類抽出物、高麗人参類の形成層由来幹細胞、またはこれの抽出物の製造方法、前記製造方法によって製造された高麗人参類抽出物、高麗人参類の形成層由来幹細胞、またはこれの抽出物を有効成分として含む糖尿病予防または治療と血行改善用組成物または肝臓機能改善用組成物に関する。

高麗人参は、オタネニンジン属（Ｐａｎａｘ）に属する植物で、根を薬用として利用している。
高麗人参の効能は、高麗人参に存在する活性成分であるジンセノサイドに起因したもので、ジンセノサイドは、ジンセノサイドアグリコンの構造によりプロトパナキサジオール系ジンセノサイド（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ−ｔｙｐｅ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ）、プロトパナキサトリオール系ジンセノサイド（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｔｒｉｏｌ−ｔｙｐｅ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ）、及びオレアナン系ジンセノサイド（ｏｌｅａｎｎｅ−ｔｙｐｅ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ）の３種類に分類されることができる。ジンセノサイド誘導体は、トリテルペン（ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ）の非糖部（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌまたはｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｔｒｉｏｌ）のＲ１、Ｒ２、Ｒ３のアルコール性ＯＨ基にグルコース、ラムノース、キシロース、アラビノースのような糖類がエステル結合された構造を有する化合物であって、現在知られている高麗人参の主なジンセノサイドは、約１３種の一般ジンセノサイドと、これから転換されると知られている希少ジンセノサイド約１１種が代表的なジンセノサイドとして知られている。

高麗人参は、水参（ｆｒｅｓｈ ｇｉｎｓｅｎｇ）をそのまま使用するか、乾燥させて白参（ｗｈｉｔｅ ｇｉｎｓｅｎｇ）の形態で製造して使用するか、または蒸して乾燥した紅参（ｒｅｄ ｇｉｎｓｅｎｇ）の形態で製造して使用することができる。

高麗人参のうち水参にはＲｇ１、Ｒｅ、Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄなどの配糖体ジンセノサイドが主な成分となり、加工高麗人参の場合、水参にはほとんど存在しない希少ジンセノサイドであるＲｇ３、Ｒｈ１、Ｒｈ２、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｋの含有量が増加できると知られている。

近年、これら加工された高麗人参にだけ存在する高麗人参サポニンの含有量を一層高めるための研究が盛んに行われている。

代表的な加工高麗人参である紅参は、水参を蒸して乾燥して製造することができ、この過程で化学構造的に不安定なジンセノサイドアグリコンのＣ−２０位置に結合されている配糖体の結合が加水分解される。このような過程を介して加工された紅参には、ジンセノサイドＲｈ１、Ｒｈ２、Ｒｇ２、Ｒｇ３等が水参や白参に比べて多く含まれている。但し、希少ジンセノサイドの一種であるジンセノサイドＲｈ２は、紅参でもその含有量が極微量で存在していると知られている。

このような加工された高麗人参で、癌予防、癌抑制、血圧降下、脳神経細胞保護、抗血栓、坑酸化などにおける薬理活性効果が、高麗人参の一般ジンセノサイドより優秀に現れると知られることから、加工された高麗人参に存在する希少ジンセノサイドを収得するための様々な方法が試みられている。最も良く知られた方法として、微生物を利用したり、酸及び酵素で高麗人参を加水分解して特定ジンセノサイドの含有量を増大させる方法がある。
このような背景下、本出願の発明者等は、高麗人参類の形成層由来幹細胞を培養して、培養された形成層由来幹細胞を熱処理する段階を含む製造方法を介して，高麗人参類の形成層由来幹細胞中目的する特定ジンセノサイドの含有量を増大させる増大できることを確認して、本発明を完成した。

本背景技術の部分に記載された前記情報は、ただ本発明の背景に対する理解を向上させるためのものであり、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者に既知の先行技術を形成する情報を含まないことがある。

本発明の目的は、特定ジンセノサイド、例えば別途処理しなかった高麗人参類抽出物、高麗人参類の形成層由来幹細胞、またはこれの抽出物にはほとんど存在しない希少ジンセノサイドの含有量が増大できるようにしたり、別途処理しなかった高麗人参類抽出物、高麗人参類の形成層由来幹細胞、またはこれの抽出物に存在する一般ジンセノサイドを希少ジンセノサイドに転換させることができる効果的な高麗人参類抽出物、高麗人参類の形成層由来幹細胞、またはこれの抽出物の製造方法を提供するところにある。

前記目的を達成するために、本発明は、培養された高麗人参類の形成層由来幹細胞（Ｃａｍｂｉａｌ Ｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ、以下ＣＭＣｓ）またはこれの抽出物を８５〜１６０℃の温度で熱処理する段階を含む、希少ジンセノサイドＲｈ２とＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ（以下、ＰＰＤ）で構成された群から選択された一つ以上の希少ジンセノサイド含有量が増加した高麗人参類の形成層由来幹細胞の製造方法を提供する。

本発明はまた、高麗人参抽出物を８５〜１６０℃の温度で熱処理する段階を含む、ジンセノサイドＲｈ２とＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤで構成された群から選択された一つ以上のジンセノサイド含有量が増加した高麗人参抽出物の製造方法を提供する。

本発明はまた、前記製造方法によって製造された、希少ジンセノサイドＲｈ２とＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤで構成された群から選択された一つ以上のジンセノサイド含有量が熱処理前と比較して増加した高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物を提供する。

本発明はまた、前記高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物、または高麗人参抽出物を有効成分として含む糖尿病予防または治療用組成物を提供する。本発明はまた、前記高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物、または高麗人参抽出物、またはこれを含む組成物を患者に投与する段階を含む糖尿病の予防または治療方法を提供する。

本発明はさらに、前記高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物、または高麗人参抽出物を有効成分として含む血行改善用組成物を提供する。本発明はまた、前記高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物、または高麗人参抽出物、またはこれを含む組成物を患者に投与する段階を含む血行改善方法を提供する。

本発明はさらに、前記高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物、または高麗人参抽出物を有効成分として含む肝臓機能改善用組成物を提供する。本発明はまた、前記高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物、または高麗人参抽出物、またはこれを含む組成物を患者に投与する段階を含む肝臓機能改善方法を提供する。

熱処理前静置過程進行時ＨＰＬＣを介して検出された希少ジンセノサイド分析結果を示したものである。（Ａ：８５℃／２４ｈｒ／抽出、Ｂ：８５℃／４８ｈｒ／抽出、Ｃ：８５℃／７２ｈｒ／抽出） 熱処理前静置過程未進行時ＨＰＬＣを介して検出された希少ジンセノサイド分析結果を示したものである。（Ａ：８５℃／２４ｈｒ／抽出、Ｂ：８５℃／４８ｈｒ／抽出、Ｃ：８５℃／７２ｈｒ／抽出） 熱処理前静置期間に応じてＨＰＬＣを介して検出された希少ジンセノサイド分析結果を示したものである。 撹はん進行の有無に応じてＨＰＬＣを介して検出された希少ジンセノサイド分析結果を示したものである。 山参ＣＭＣｓ、高麗人参、紅参、山養参または山参培養根を試料にして熱処理前一般ジンセノサイド分析結果を示したものである（Ａ：山参ＣＭＣｓ、Ｂ：高麗人参、Ｃ：紅参、Ｄ：山養参、Ｅ：参培養根）。 山参ＣＭＣｓ、高麗人参、紅参、山養参または山参培養根を試料にして熱風乾燥及び熱処理を介して検出された希少ジンセノサイド分析結果を示したものである（Ａ：山参ＣＭＣｓ、Ｂ：高麗人参、Ｃ：紅参、Ｄ：山養参、Ｅ：参培養根）。 本発明の一実施例により製造された山参ＣＭＣｓの抗糖尿効果をＯＧＴＴ（Ｏｒａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ）を介して確認した結果を示したものである。 本発明の一実施例により製造された山参ＣＭＣｓの血小板凝集抑制能を評価（Ａｎｔｉ−ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｓｓａｙ）した結果を示したものである。 本発明の一実施例により製造された山参ＣＭＣｓの肝炎関連肝機能改善効果を評価した結果を示したものである（ＡＬＴ，ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＳＴ，ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＧａｌＮ，Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）。

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

一観点において、本発明は、培養された高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物を８５〜１６０℃の温度で熱処理する段階を含む、希少ジンセノサイドＲｈ２とＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤで構成された群から選択された一つ以上の希少ジンセノサイド含有量が増加した高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物の製造方法に関する。

また、本発明は、高麗人参抽出物を８５〜１６０℃の温度で熱処理する段階を含む、ジンセノサイドＲｈ２とＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤで構成された群から選択された一つ以上のジンセノサイド含有量が増加した高麗人参抽出物の製造方法に関する。

本発明によると、従来蒸したり酸、酵素または微生物処理する方法ではなく、培養された高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物に熱処理する過程を介して希少ジンセノサイド、その中でも特にＲｈ２の含有量を顕著に増大させることができる。

本明細書で使用される高麗人参類の形成層由来幹細胞は、高麗人参類の形成層組織から分離した先天的に未分化された細胞として、同質的な細胞で、カルスへの脱分化過程を経ないで、分裂組織的連続性を有することを特徴とする。本出願の発明者等は、最初に植物の形成層から、脱分化されたカルスとは異なり、先天的に未分化された同質的細胞である高麗人参類の形成層由来幹細胞を分離した。韓国登録特許第１０６４５１８号に高麗人参類の形成層由来幹細胞の分離方法を具体的に開示して、これは本出願に参照として取り入れることができる。

先天的に未分化された細胞として、同質的な細胞で、カルスへの脱分化過程を経ないで、分裂組織的連続性を有する高麗人参類の形成層由来幹細胞であれば、その由来は特に制限されないが、例えば本発明に係る形成層由来幹細胞は、白参、山参、山養参または樟脳参の形成層由来幹細胞であってもよいであり得る。この時、使用可能な高麗人参類の原産地は特に制限されず、例えば国内産、米国産、日本、ヒマラヤ、ベトナム、中国産を使用することができる。使用可能な高麗人参類の形成層由来幹細胞は、例えば、幹細胞生体、粉末、濃縮液または抽出物などがあるが、これらに制限されない。本発明の一実施例では、粉末または抽出物（一般ジンセノサイド抽出物）を主に使用して希少ジンセノサイドに転換させることができるが、当業界で通常市販されるいかなる形態も本発明の実施に使用することができる。

幹細胞の抽出物または高麗人参抽出物は、通常使用される方法を制限なしに使用して製造することができ、例えば幹細胞または高麗人参乾燥物の１重量部当たり１０〜５００重量部の蒸留水を混合して５０〜１００℃の温度で抽出することができる。

これと関連して、本出願の発明者等は、公示の高麗人参、紅参、山養参または山参培養根を使用する場合には本発明の製造方法を適用しても、Ｒｈ２のような希少ジンセノサイドの含有量が目的する程度に増加することが期待できないが、培養された高麗人参類の形成層由来幹細胞に熱処理する単純工程を介して、高麗人参類の形成層由来幹細胞のうちＲｈ２のような希少ジンセノサイドの含有量を顕著に増大させる可能性があることを確認した。

前記Ｒｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｈ２、Ｒｋ２、Ｒｈ３またはＰＰＤのようなジンセノサイドは希少ジンセノサイドで、別途処理しなかった未加工の高麗人参に極微量で含まれるか、ほとんど存在しなかいか、または存在しないジンセノサイドである。しかし、本発明の製造方法によると、別途処理しなかった未加工の高麗人参抽出物、高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物に主に含まれたジンセノサイド、例えば、Ｒｇ１、Ｒｅ、Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ ＸＶＩＩまたはＦ２（以下、一般ジンセノサイド）が熱処理工程を介して希少ジンセノサイドに転換される。これにより、別途処理しなかった未加工（熱処理しなかった未加工）の高麗人参抽出物、高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物と比較するとＲｈ２とＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤからなる群で選択された一つ以上の希少ジンセノサイドの含有量が増大する。

場合によっては、本発明によると、高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物のうち希少ジンセノサイドと命名されたＲｈ２とＲｇ３、Ｒｇ５及びＰＰＤまたはＲｈ２とＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤの全ての含有量が増大され得る。

また、前記高麗人参抽出物のうちＲｈ２とＲｇ３、Ｒｇ５、ＰＰＤのジンセノサイド含有量が別途処理しなかった未加工（熱処理しなかった未加工）の高麗人参抽出物と比較して増大することができる。

希少ジンセノサイドの含有量増大は、本発明に係る製造方法によって一般ジンセノサイドから希少ジンセノサイドへの転換を意味することができ、本発明により製造された高麗人参抽出物、高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物でＲｈ２とＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤで構成された群から選択された一つ以上のジンセノサイドが全ジンセノサイドを基準に８０〜１００重量％、９０〜９８重量％で含まれることを意味することができる。この時、希少ジンセノサイドＲｈ２とＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤで構成された群から選択された一つ以上のジンセノサイドが、８０〜１００重量％で含まれる場合、例えばＲｇ１、Ｒｅ、Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ ＸＶＩＩまたはＦ２のような一般ジンセノサイド含有量は２０〜０重量％であってもよいであり得る。

前記希少ジンセノサイドが、ジンセノサイド全含有量を基準として１００重量％で含まれる場合、処理前高麗人参抽出物、高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物に含まれた一般ジンセノサイドが全て希少ジンセノサイドに転換されたものであり得る。この時、希少ジンセノサイドは、Ｒｈ２とＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤで構成された群から選択された一つ以上の希少ジンセノサイドである。

この時、Ｒｈ２は、希少ジンセノサイドＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｈ２、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤ全重量を基準として１０〜３５重量％、１１〜３３重量％で含まれることができる。本発明により製造された高麗人参抽出物、高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物とは異なり、高麗人参、山養参、山参培養根の場合、本発明に係る製造方法を適用しても、Ｒｈ２は高麗人参抽出物、高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物に含まれた希少ジンセノサイドの３〜８％に過ぎないことが確認された。

前記高麗人参類の形成層由来幹細胞は、本出願人の韓国登録特許第１０６４５１８号に従って分離することができて、分離した幹細胞を培養するのに、例えば、増殖のための培養（増殖培養）及び生産のための培養（生産培養）段階を経て培養することができる。

前記増殖培養に使用された培地は、スクロースが３％添加されたＭＳ培地で（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ’ｓ，１９６２）高麗人参類の形成層由来幹細胞を接種した後、培養に適したエアー流量条件で約１３日間培養することができる。

前記生産培養に使用された培地は、３％黒砂糖が添加されたｍｏｄｉｆｉｅｄ ＭＳ培地で、増殖培養が完了した高麗人参類の形成層由来幹細胞を接種した後、追加でエリシター（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）を処理して培養に適したエアー流量条件で約１１日間培養されることができる。

前記エリシターの例として、ジャスモン酸メチル（ｍｅｔｈｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅ）、真菌類抽出物、細菌類抽出物、酵母（ｙｅａｓｔ）抽出物、キトサン、グルコマンナン（ｇｌｕｃｏｍａｎｎａｎ）、グルカン（ｇｌｕｃａｎ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、安息香酸（ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、アラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＳＴＳ、モバロナロネイトＮ−ベンゾリグリシン（ｍｅｖａｌｏｎａｌｏｎａｔｅ Ｎ−ｂｅｎｚｏｌｙｇｌｙｃｉｎｅ）、ＡＢＡ、ＳＮＰ、ＩＰＰ、ＢＨＴ、ＣＣＣ、エセフォン（ｅｔｈｅｐｈｏｎ）、馬尿酸（ｈｉｐｐｕｒｉｃ ａｃｉｄ）、硝酸二アンモニウムセリウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｅｒｉｃ ｎｉｔｒａｔｅ）、ＡｇＮＯ３、硫酸バナジル（ｖａｎａｄｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）、ｐ−アミノ安息香酸（ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、ブラシノステロイド（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、アルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ）、及び酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）からなる群から選択される物質であり、好ましくはジャスモン酸メチルを使用することができる。この場合、エリシターとして添加されるジャスモン酸メチルは、５０〜２００μＭの濃度で添加されることができる。

前記増殖培養及び生産培養を介して培養された高麗人参類の形成層由来幹細胞では、一般ジンセノサイド、例えばＲｇ１、Ｒｅ、Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ ＸＶＩＩまたはＦ２が確保されることができ、希少ジンセノサイド、例えばＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｈ２、Ｒｋ２、Ｒｈ３またはＰＰＤは検出されないことがある。

以後、本発明は、培養された高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物を８５〜１６０℃の温度で熱処理する段階を含むことによって、一般ジンセノサイドから希少ジンセノサイドへの転換を介して希少ジンセノサイドの含有量が増大した高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物を製造することができる。

一実施例で、本発明に係る製造方法は、熱処理段階の前に、以前に培養された高麗人参類の形成層由来幹細胞を蒸留水に分散させる段階をさらに含んでもよい。

場合によって蒸留水に分散させる前に凍結乾燥を追加で行うことができる。凍結乾燥を介して、便利に管理及び保管ができ、細胞内水分及び水分中存在する微生物などを一部除去できるだけでなく、水分により生じ得る微生物の繁殖を抑制することができる。

高麗人参類の形成層由来幹細胞の分散に使用される蒸留水は、乾燥された高麗人参類の形成層由来幹細胞１重量部当たり１〜２００重量部、乾燥された高麗人参類の形成層由来幹細胞１重量部当たり３０〜２００重量部であってもよい。乾燥されなかった幹細胞を使用する場合、蒸留水は、乾燥されなかった幹細胞１重量部当たり２〜１５重量部、乾燥されなかった幹細胞１重量部当たり２．５〜１０重量部であってもよい。

前述した範囲内で高麗人参類の形成層由来幹細胞を基準として蒸留水の割合が増加するほど一般ジンセノサイド含有量が低くなると共に、希少ジンセノサイドの含有量が増加することができる。

以後、蒸留水に分散した高麗人参類の形成層由来幹細胞を静置させる段階をさらに含んでもよい。
前記静置は、蒸留水と混合された高麗人参類の形成層由来幹細胞を、例えば１〜３５℃の温度、１０〜２４℃の温度で１〜１５日間、２〜１０日間静置することによって行われることができる。
このような段階を含んで製造された高麗人参類の形成層由来幹細胞は、一般ジンセノサイド含有量がほとんど存在しないか、存在しなく、希少ジンセノサイド含有量が非常に高く増加することを確認した。特に、前述した範囲で静置時間が増加するにつれて、希少ジンセノサイド中Ｒｈ２の含有量が大きく増加することを確認した。

もう一つの実施例で、本発明に係る製造方法は、熱処理段階前に培養された高麗人参類の形成層由来幹細胞を熱風乾燥する段階をさらに含んでもよい。このような段階を含んで製造された高麗人参類の形成層由来幹細胞には、一般ジンセノサイドがほとんど存在しないか、存在しなくて、希少ジンセノサイド含有量が非常に高く増加することを確認した。特に、希少ジンセノサイド中Ｒｈ２の含有量が大きく増加することを確認した。

前記熱風乾燥は、例えば、４５〜７５℃の温度、５０〜７０℃の温度で調整された熱風乾燥器中行われることができ、この時熱風乾燥は、例えば２４〜７２時間、３０〜６０時間持続することができる。前述した範囲内で熱風乾燥して製造された高麗人参類の形成層由来幹細胞では、希少ジンセノサイド含有量が非常に高く増加することを確認した。特に、希少ジンセノサイド中Ｒｈ２の含有量が大きく増加することを確認した。

以後、本発明に係る製造方法は、前記静置されたり熱風乾燥された高麗人参類の形成層由来幹細胞を熱処理する段階を含む。前記熱処理は、８５〜１６０℃の温度で蒸留水を利用した熱水抽出を意味することができる。
静置された高麗人参類の形成層由来幹細胞は、静置以前に蒸留水中分散している状態であるため、８５〜１６０℃の熱を加えて直ちに熱処理することができ、熱風乾燥された高麗人参類の形成層由来幹細胞は、追加で蒸留水に分散して熱処理することができる。この時、蒸留水は、乾燥された高麗人参類の形成層由来幹細胞１重量部当たり１〜２００重量部、高麗人参類の形成層由来幹細胞１重量部当たり３０〜２００重量部で混合することができる。

前記熱処理は、形成層由来幹細胞に８５〜１６０℃の温度、８５〜１１５℃の温度、９５〜１１５℃の温度で熱を加えて行うことができる。一般ジンセノサイドが希少ジンセノサイドに転換されるのに適した温度範囲を確認して、前述した温度範囲内で希少ジンセノサイドの含有量増加が確認されて、範囲内で温度が高まるほど一般ジンセノサイドの含有量は低くなると共に、希少ジンセノサイド含有量が増大または一般ジンセノサイドが全て希少ジンセノサイドに転換されることができる。

前記熱処理は、例えば、１０分〜７２時間、２４時間〜７２時間、４８時間〜７２時間行われることができる。一般ジンセノサイドが、希少ジンセノサイドに転換されるのに適した熱処理時間範囲を確認して、前述した時間範囲内で熱処理した高麗人参類の形成層由来幹細胞で希少ジンセノサイドが検出されて、前述した時間範囲内で時間が増加するほど一般ジンセノサイドの含有量は低くなると共に、希少ジンセノサイド含有量が増大するか、または一般ジンセノサイドが全て希少ジンセノサイドに転換されることができる。

前記熱処理は、大気圧下で行われるが、温度が高まるにつれ圧力も上昇され、前述した温度範囲の熱が加えた場合、例えば常圧（０．５７〜６．１の気圧範囲）で行われることができる。

前記熱処理段階中撹はんする過程をさらに含んでもよい。この時、撹はん条件は、例えば１０〜２００ｒｐｍ、３０〜１８０ｒｐｍで撹はんすることができる。前述した条件の撹はん過程を含む場合、未撹はんする場合に比べて希少ジンセノサイドの含有量がより増大でき、撹はん条件で目的とする希少ジンセノサイドの含有量が増大するか、または希少ジンセノサイドに転換されるのに要する時間が短縮されることができる。

他の観点において、本発明は、前記製造方法によって製造された、希少ジンセノサイドＲｈ２とＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤで構成された群から選択された一つ以上のジンセノサイド含有量が増加したことを特徴とする高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物に関する。また、本発明は、前記製造方法によって製造された、ジンセノサイドＲｈ２とＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤで構成された群から選択された一つ以上のジンセノサイド含有量が増加した高麗人参類抽出物に関する。

先述した希少ジンセノサイドまたはこれの含有量に関連した構成は、高麗人参類の形成層由来幹細胞、これの抽出物及び高麗人参抽出物と関連した発明にも同様に適用することができる。

さらに他の観点において、本発明は、前記幹細胞またはこれの抽出物、または高麗人参抽出物を有効成分として含む糖尿病予防または治療用組成物に関する。本発明はまた、前記高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物、または高麗人参抽出物、またはこれを含む組成物を患者に投与する段階を含む糖尿病の予防または治療方法に関する。希少ジンセノサイド含有量が増大した本発明に係る高麗人参類の形成層由来幹細胞、これの抽出物、または高麗人参抽出物は、有意な耐糖能を示して、抗糖尿効果を示すことを確認した。

また、本発明は、前記幹細胞またはこれの抽出物、または高麗人参抽出物を有効成分として含む血行改善用組成物に関する。本発明はまた、前記高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物、または高麗人参抽出物、またはこれを含む組成物を患者に投与する段階を含む血行改善方法に関する。希少ジンセノサイド含有量が増大した本発明に係る高麗人参類の形成層由来幹細胞、これの抽出物、または高麗人参抽出物が優れた血小板凝集抑制能を示し、血行改善に有意な効果があることを確認した。

前記血行は、血球数（ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ）、粘性（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）、血液によるせん断応力（ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ）等のような物理的な要素だけでなく血中脂質組成の変化、血球細胞（血小板）等によって調節されることができるが、正常状態では恒常性を良好に維持するが、糖尿などといった疾病状態、薬物、喫煙などによって血行調節機能がかく乱されると、血しょう、血小板、赤血球などが凝集し過ぎて異常な止血（ａｂｎｏｒｍａｌ ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）が発生して血液の流れが阻害されることになる。また、活性化血小板凝集が促されると、血流の恒常性を破壊して血行障害が動脈硬化、脳卒中、心血管疾患、心筋梗塞、心虚血疾患及び脳血管疾患の発病を誘発させる原因になると知られている。

本発明に係る血行改善用組成物は、血栓生成を阻害して血行改善を助けるので、細胞と各器官の老化を防止して、細胞の成長と再生を促すことができるが、血行改善を介して、例えば動脈硬化症、脳出血、脳卒中及び／または脳梗塞などの血液循環障害及び／または末梢血管血行障害、手足冷え症、頭皮血液循環障害による脱毛症状などを予防または治療することができる。

また、本発明は、前記幹細胞またはこれの抽出物、または高麗人参抽出物を有効成分として含む肝臓機能改善用組成物に関する。本発明はまた、前記高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物、または高麗人参抽出物、またはこれを含む組成物を患者に投与する段階を含む肝臓機能改善方法に関する。

本発明で、肝臓機能改善は、例えば脂肪肝疾患の予防または治療を含むことができ、前記脂肪肝疾患は、アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、栄養性脂肪肝疾患、飢餓性脂肪肝疾患、肥満性脂肪肝疾患、糖尿病性脂肪肝疾患または脂肪肝炎であってもよい。また、肝臓機能改善は、肝疾患、例えば肝硬変症、アルコール性肝硬変、脂肪肝、中毒性肝疾患、急・慢性肝炎の予防または治療を含むことができる。

希少ジンセノサイド含有量が増大した本発明に係る高麗人参類の形成層由来幹細胞、これの抽出物、または高麗人参抽出物が有意な肝炎改善、非アルコール性脂肪肝誘導改善効果を示すことを確認した。

本発明に係る組成物は、高麗人参類の形成層由来幹細胞、これの抽出物または高麗人参抽出物を単独で含むか一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含んで薬学組成物として提供されることができ、疾患及びこれの重症程度、患者の年齢、体重、健康状態、性別、投与経路及び治療期間などにより適した薬学的に有効な量で投与されることができる。このような因子に基づいた投与量決定は、当業者の水準内にある。通常投与量は０．０００１ｍｇ／ｋｇ／日〜おおよそ２，０００ｇ／ｋｇ／日の範囲である。

前記において「薬学的に許容される組成物」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与される時、通常胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれと類似する反応を起こさない組成物のことをいう。前記担体、賦形剤及び希釈剤としては、例えば、ラキトース、テクストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、燐酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。

前記薬学組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含んでもよい。

また、本発明の薬学組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延された放出を提供することができるよう当業界に公示された方法を用いて剤形化される。剤形は、粉末、顆粒、精製、エマルジョン、シロップ、エアゾール、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形態であってもよい。

本発明に係る高麗人参類の形成層由来幹細胞は、例えば、機能性食品の形態で提供されてもよい。前記「機能性食品」とは、前記高麗人参類の形成層由来幹細胞を有効成分として含んで疾病の予防または治療効果を示す機能を奏する食品を意味する。

前記機能性食品は、例えば、粉末、顆粒、精製、カプセルまたは飲料の形態であってもよく、種々の栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤等の風味剤、着色剤及び充填鎮剤（チーズ、チョコレート等）、ペクト酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコールまたは炭酸化剤等を必要に応じて含有してもよい。

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。

［実施例１］希少ジンセノサイドに転換された高麗人参抽出物
１．希少ジンセノサイドに転換された高麗人参抽出物の製造
蒸留水にＰａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ（Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）根抽出物粉末（Ｘｉａｎ ＬＶＳＥＮ社）を３０：１（０．０３３％）の濃度に入れて溶かして、１２０℃、常圧条件で４８時間熱処理した。抽出物を冷やした後、沈殿物だけ回収した。回収された沈殿物を凍結乾燥した。

２．ＨＰＬＣ分析
希少ジンセノサイド分析にＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １２６０ ＤＡＤ ｓｙｓｔｅｍを使用してＡｇｉｌｅｎｔ社のＺｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ｐｌｕｓ Ｃ１８（４．６ｘ１００ｍｍ、３．５μｍ）ｃｏｌｕｍｎを使用した。ＤＡＤ検出器の検出波長はＵＶ ２０３ｎｍ、ｃｏｌｕｍｎ温度は３０℃で分析して移動相（ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）は０．０５％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）が含まれた水とアセトニトリルを使用してｆｌｏｗ ｒａｔｅ １ｍＬ／ｍｉｎで分析した。一般ジンセノサイドと希少ジンセノサイド分析は、移動相（ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）の比を調節して分析を進行した。分析に使用したジンセノサイド標準品は、Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ（ＵＳＡ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）及びＡｍｂｏ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｋｏｒｅａ）から購入して使用した。希少ジンセノサイドＲｋ２、Ｒｈ３は、標準品がなく定量分析を進行することができなく、分離同定とＬＣ／ＭＳで定性的確認だけ進行した。分析に使用した溶媒は、Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍｅｔｈａｎｏｌ（Ｊ．Ｔ Ｂａｋｅｒ，ＵＳＡ）、及びＴｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（Ｄａｅｊｕｎｇ，Ｋｏｒｅａ）であった。それぞれの試料は、対象に応じてメタノールと水の比を調節してジンセノサイド抽出を進行し、０．２μｍフィルター（ｆｉｌｔｅｒ）でろ過した後、分析を進行した。希少ジンセノサイドに転換の有無を確認して、その結果を表１に示した。

［実施例２］希少ジンセノサイドに転換された山参ＣＭＣｓ（Ｃａｍｂｉａｌ ｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）粉末の製造
１．山参ＣＭＣｓの培養
Ｐａｎａｘ Ｇｉｎｓｅｎｇ（ｗｉｌｄ ｇｉｎｓｅｎｇ、江原道（カンウォンド）、韓国）の形成層から山参ＣＭＣｓを収得した。山参ＣＭＣｓ（Ｗｉｌｄ ｇｉｎｓｅｎｇ ＣＭＣｓ）は２５０ｍＬフラスコ、３Ｌバイオリアクター、２０Ｌバイオリアクター、２５０Ｌバイオリアクター段階に徐々にスケールアップが進行された。

一般に植物細胞培養で細胞分裂を誘導するための植物生長調節剤である２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）やナフタレン酢酸（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）が使用されるが、山参ＣＭＣｓは生長調節剤が添加されず山参ＣＭＣｓが増殖する条件を確立して維持されている。山参ＣＭＣｓの生体重を確保するための増殖培養条件は、ＭＳ培地に３％スクロースが添加された培地を使用して（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ’ｓ，１９６２）、ＭＳ培地のｐＨは５．８に調整されて、１３日間培養された。

増殖培養が完了した後、生産培養はｍｏｄｉｆｉｅｄ ＭＳ培地に３％黒砂糖が添加された生産培地に１００μＭメチルジャスモネートを処理して、１１日間進行された。増殖培養及び生産培養は同じ培養室で進行され、培養室の温度は２１±１℃、暗培養条件で培養された。

２．希少ジンセノサイドに転換されたＣＭＣｓの製造
増殖培養及び生産培養を介してバイオマスと一般ジンセノサイド（Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ）を確保した後、５日間エアーオフ（ａｉｒ−ｏｆｆ）させた後、培養室で静置した。Ｒｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｈ２、ＰＰＤなどの希少ジンセノサイドを取得するために、抽出装置で熱処理した。熱処理工程を介して一般ジンセノサイドから希少ジンセノサイドであるＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｈ２、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤに転換させた後、バイオマスを回収後、乾燥（凍結乾燥または、熱風乾燥）した。

３．ＨＰＬＣ分析
山参ＣＭＣｓの希少ジンセノサイド分析は、実施例１と同様に行った。

試験例１：水抽出比に応じた希少ジンセノサイド転換率比較
実施例２で項目２を進行するに当たり項目１進行後乾燥された山参ＣＭＣｓ １重量部当たり３０〜２００重量部の蒸留水混合物を抽出装置を介して８５℃で２４時間熱処理して、一般ジンセノサイドを希少ジンセノサイドに転換させるのに適した比を確認した。

表２を参照すると、熱処理温度８５℃及び熱処理時間２４ｈ条件での山参ＣＭＣｓは、蒸留水の比が増加するほど大部分の一般ジンセノサイド含有量が低くなることを確認することができる。

試験例２：熱処理温度条件に応じた希少ジンセノサイド転換率比較
実施例２で項目２を進行するに当たり項目１進行後、乾燥された山参ＣＭＣｓ １重量部当たり１００重量部の蒸留水混合物を抽出装置を利用して８５℃〜１１５℃で２４時間熱処理して一般ジンセノサイドを希少ジンセノサイドに転換させるのに適した温度を確認した。

表３を参照すると、水抽出比１：１００及び熱処理時間２４ｈｒ条件での山参ＣＭＣｓは、熱処理温度が増加するほど大部分の一般ジンセノサイド含有量が低くなることを確認することができる。

試験例３：熱処理時間条件に応じた希少ジンセノサイド転換率比較
実施例２で項目２を進行するに当たり項目１進行後、乾燥された山参ＣＭＣｓ １重量部当たり１００重量部の蒸留水混合物を抽出装置８５℃で２４時間〜７２時間熱処理して一般ジンセノサイドを希少ジンセノサイドに転換させるのに適した時間を確認した。

表４を参照すると、水抽出比１：１００及び熱処理温度８５℃条件での山参ＣＭＣｓは、熱処理時間が増加するほど体部分の一般ジンセノサイド含有量がほとんど存在しないことを確認することができる。

試験例４：静置進行の有無に応じた希少ジンセノサイド生産性比較
実施例２の項目２と同様に山参ＣＭＣｓを製造するが、熱処理前静置過程を進行しなかった山参ＣＭＣｓを追加で製造した。熱処理前静置過程（５日）を進行した結果を未進行した場合と比較して、図１及び図２に示した。図１及び図２を参照すると、静置過程を進行しなかった図２とは異なり、静置過程を芯子下場合、図１に図示されたように、希少ジンセノサイド中Ｒｈ２及びＰＰＤの含有量増加が現れることを確認することができる。

試験例５：静置過程進行期間に応じた希少ジンセノサイド生産性比較
実施例１の項目２と同様に山参ＣＭＣｓを製造して（９５℃／４８ｈｒ）、熱処理前静置過程進行期間に応じた希少ジンセノサイド含有量を図３及び表５に示した。図３及び表５を参照すると、静置過程期間が増えるにつれ、希少ジンセノサイド中Ｒｈ２の含有量増加が現れることを確認することができる。

試験例６：撹はん進行の有無に応じた希少ジンセノサイド生産性比較
実施例２で山参ＣＭＣｓ生体重１重量部当たり２．５〜１０重量部の蒸留水（乾体重１重量部当たり５０〜２００重量部の蒸留水）の混合物を９５℃／４８ｈｒ熱処理中３０〜１８０ｒｐｍの条件で撹はんを進行したか否かに応じた希少ジンセノサイドに含有量変化があるか否かを確認した。図４及び表６を参照すると、撹はんを進行した場合、未撹はんの場合に比べて希少ジンセノサイドＲｇ３、Ｒｈ２、Ｒｇ５及びＰＰＤ含有量が高いことを確認することができる。

［実施例３］熱風乾燥及び熱処理進行
実施例２の項目１と同様に山参ＣＭＣｓを製造して、６０℃／４８ｈｒで熱風乾燥（ＨＫ−０６Ｈ、（株）韓国技術イエヌジー）した後、粉末化（１２０ｍｅｓｈ）した後、粉末１重量部当たり１００重量部の蒸留水を添加して９５℃、４８ｈｒで熱水抽出した。また、高麗人参、紅参、山養参、山参培養根も同じ条件で熱処理した。その結果を図５、図６、表７及び８に示した。

図５及び表７を参照すると、熱風乾燥された山参ＣＭＣｓは、他の高麗人参類に比べて一般ジンセノサイドＧｙｐｅｎｏｓｉｄｅ ＸＶＩＩとＦ２含有量が高いことが確認できて、熱処理進行時に他の高麗人参類に比べて希少ジンセノサイドＲｈ２含有量が独歩的に高いことを確認することができる。紅参を除いた高麗人参、山養参、山参培養根の場合、乾燥しなかった生体（ｆｒｅｓｈ）状態で購入して同じ条件で熱風乾燥を進行したが、希少ジンセノサイドＲｈ２生産性に影響を及ぼす一般ジンセノサイドＧｙｐｅｎｏｓｉｄｅ ＸＶＩＩとＦ２含有量が高まることを確認できず、熱処理進行時希少ジンセノサイドＲｈ２含有量が非常に低いことを確認することができた。

このような現状の原因は、Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ ＸＶＩＩ及びＦ２のようにＣ−３炭素位置にグルコース分子１個がついている構造がＲｈ２を収得するのに有利であるためと判断される。Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ ＸＶＩＩ及びＦ２の場合、Ｃ−２０炭素位置にそれぞれ糖分子が２個、１個ついていて、Ｃ−３炭素位置に１個の糖がついているが、熱によってＣ−２０炭素位置についている糖の場合、脱離し易く、Ｃ−３炭素位置に糖が１個だけついている場合にＲｈ２が獲得されるので、このような結果が得られると判断される。

また、本発明に係る熱処理方法は、図６及び表８に示したように一般ジンセノサイドの大部分を希少ジンセノサイドに転換させることができるが、乾燥しなかった生菜状態の山参ＣＭＣｓは細胞水準で、凍結乾燥及び熱風乾燥された山参ＣＭＣｓは粉末化された状態で熱の伝達を受けるので、熱伝達効率が高くて希少ジンセノサイド転換率に優位性を有する。例えば、紅参製造時高麗人参の固有形態を維持した状態で蒸し過程を進行するが、大部分希少ジンセノサイド含有量が低く一般ジンセノサイド含有量が高いことが確認できるが、高麗人参を粉末化して本発明に係る熱処理方法を処理する場合、大部分希少ジンセノサイドに転換されることが確認できて、希少ジンセノサイドＲｇ３含有量も高いことを確認することができる。

このように、公示の紅参、高麗人参、山養参、山参培養根とは異なり本発明に係る製造方法を適用した山参ＣＭＣｓでＲｈ２を含む希少ジンセノサイドの顕著な含有量増加を示すことは、山参ＣＭＣｓが細胞単位で熱処理されるか、最終乾燥後粉砕及び分体産物が熱処理された時の粒子の大きさが数百ｎｍ〜数十μｍであるため熱伝達効率が高いので、ＰＰＤといったアグリコン（ａｇｌｙｃｏｎｅ）でＣ−２０番炭素（ｃａｒｂｏｎ）位置についた糖が脱離し易くなったためと判断される。

希少ジンセノサイドの含有量を増加させるための様々な試みがあったが、紅参、高麗人参、山養参、山参培養根を利用する場合、様々な処理（熱、酵素、酸、塩基処理など）をしても組織（ｔｉｓｓｕｅ）水準で進行されたものであるため、Ｃ−２０位置で糖除去効率が低く希少ジンセノサイド含有量増加程度が非常に低いと判断される。

［実施例４］希少ジンセノサイドに転換された山参ＣＭＣ抽出物
１．希少ジンセノサイドに転換された山参ＣＭＣ抽出物の製造
乾燥された山参ＣＭＣｓ乾体重１重量部当たり５０〜２００重量部の蒸留水を混合して７５度で１８時間抽出した。山参ＣＭＣｓと抽出物を分離して、０．２μｍフィルターを介してろ過して山参ＣＭＣｓ抽出物を製造した。製造された山参ＣＭＣｓ抽出物を高温高圧機（フォスエンテック、ＭＳＲ−３Ｌ−１５０／２５０−ＭＤ−Ｓ６−ＳＹＳ）に入れて１４０℃、１５０℃、１６０℃、常圧条件で６０分間熱処理した。山参ＣＭＣｓ抽出物を冷やした後、沈殿物だけ回収して、回収された沈殿物を凍結乾燥した。

２．ＨＰＬＣ分析
山参ＣＭＣｓ抽出物の希少ジンセノサイド分析は、実施例１と同様に進行した。希少ジンセノサイドに転換の有無を確認して、その結果を表９に示した。

試験例７：山参ＣＭＣｓの抗糖尿効果
ＯＧＴＴ（Ｏｒａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ）を介して実施例２で製造された山参ＣＭＣｓの抗糖尿効果を確認した。熱処理は９５℃で４８ｈｒ進行して７０％エタノールで抽出した抽出物を経口投与した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｍｉｃｅ（８週齢、雄）を一夜の間絶食させた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｍｉｃｅの体重と血糖を測定した後、２ｇ／ｋｇのＤ−ｇｌｕｃｏｓｅを経口投与させた。この時、飲水は提供するが飼料は提供しなかった。３０分間隔をおいて２時間血糖の変化を測定した。

その結果を図７及び表１０に示した。Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅを経口投与した時、正常群（Ｎｏｒｍａｌ）に比べて糖尿群（ＤＭ）では糖耐性が殆どなく、対照群として抗糖尿分野の健康補助食品と認定された難消化性マルトデキストリン（ＲＭＤ）及び紅参抽出物（ＲＧ−２００）と山参ＣＭＣｓ抽出物を比較した。その結果、山参ＣＭＣｓ（山参ＣＭＣｓ−２００）は、康補助食品と認定された試料に現れる耐糖能を示す抗糖尿効果を示した。

試験例８：山参ＣＭＣｓの血行改善効果
実施例２で製造された山参ＣＭＣｓの血小板凝集抑制能を評価（Ａｎｔｉ−ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｓｓａｙ）した。９５℃で４８ｈｒ熱処理した山参ＣＭＣｓを７０％エタノールで抽出した山参ＣＭＣｓ抽出物を経口投与した。

３．２％ Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅを準備して血液と１：９（ｖ／ｖ）になるようにＲａｔの腹部動脈から採血した。１０分間ｒｏｌｌ ｍｉｘｅｒで良好に混ざるように放置した後、１０００ｒｐｍ、常温で１０分間遠心分離して上澄み液を分離した（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ；ＰＲＰ）。ＰＰＰを利用してＰＲＰの血小板の個数を計数（ｃｏｕｎｔｉｎｇ）して、２５０〜４００Ｘ１０^３個／ｍＬになるべく希釈した後ｒｏｌｌ ｍｉｘｅｒで５分間放置した。Ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ（Ｃｈｒｏｎｏ−ｌｏｇ，ＵＳＡ）でＰＲＰまたは試料を添加したＰＲＰを３７℃に予熱した後、ＰＲＰに血小板凝集を誘導するａｇｏｎｉｓｔ（ＡＤＰ，ｃｏｌｌａｇｅｎなど）を点滴した後、ＰＰＰを対照にして濁度の変化を測定して凝集率（％）（数値が１００に近いほど凝集が多く起きて、０に近いほど凝集が少ない）で示した。抑制率は下式により表すことができる：
抑制率（％）＝（ＰＲＰだけある時の凝集率（％）−試料と混合したＰＲＰの凝集率（％））／ＰＲＰだけある時の凝集率（％）Ｘ１００

その結果を図８及び表１１に示した。血行改善分野の健康補助食品と認定されたイチョウの葉エキス（ＧＢ−４０）と紅参抽出物（ＲＧ−５０）を対照群で比較した結果、山参ＣＭＣｓ抽出物（山参ＣＭＣｓ−２０、山参ＣＭＣｓ−５０）は、健康補助食品と認定された試料に比べて血行改善効果がさらに優れることが分かった。

試験例９：山参ＣＭＣｓの肝臓機能改善効果
１．ＧａｌＮ誘導肝炎の肝臓機能改善効果
凍結乾燥された山参ＣＭＣｓは、調製溶媒である滅菌生理食塩水に溶解させて使用して、経口投与針（ｓｏｎｄｅ）を利用して経口投与した。１８時間絶食させた７週齢Ｍａｌｅ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔｓにＧａｌＮ（７００ｍｇ／ｋｇ ＰＢＳ）を腹腔内投与して２４時間経過後、血液及び肝組織を採取した後、血清内ＡＬＴ及びＡＳＴ活性を測定した。実験物質はＧａｌＮ投与１４日前から１日１回同じ時刻に経口投与して、ＧａｌＮ投与当日にはＧａｌＮ投与前２時間及び投与後６時間に経口投与した。
図９を参照すると、７５、１５０及び３００ｍｇ／ｋｇで２週処置時の全てにおいてＧａｌＮ誘導モデルでＡＬＴ、ＡＳＴを陽性対照群シリマリンに比べて顕著に抑制することを確認した。

２．非アルコール性脂肪肝誘導改善効果
山参ＣＭＣｓを蒸留水に懸濁させた後、経口投与針（ｓｏｎｄｅ）を利用して経口で１０週間投与した。２２ｇから２４ｇの間の５７ＢＬ／６系マウスに１０週間高脂肪食餌を投与して脂肪肝を誘導した。各グループ別に正常実験動物用固形飼料、高脂肪食餌飼料（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ）及び水は自由に摂取させた。
表１２を参照すると、山参ＣＭＣｓの投与は、体重、血清及び肝組織の脂質含有量、血清ＡＬＴ活性を大きく軽減させたことを確認することができる。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

本発明の製造方法によると、薬理活性が高いＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｈ２、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤで構成された群から選択された一つ以上の希少ジンセノサイドの含有量が増加した高麗人参類の形成層由来幹細胞、これの抽出物または高麗人参抽出物を単純化された工程を介して効率的に製造することができる。

Claims (12)

1. 高麗人参類の形成層由来幹細胞を、高麗人参類の形成層由来幹細胞１重量部当たり３０〜２００重量部の蒸留水に分散させる段階、
   蒸留水に分散した高麗人参類の形成層由来幹細胞を静置させる段階、及び
   高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物を８５〜１６０℃の温度で熱処理する段階を含む、ジンセノサイドＲｈ２並びにＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤで構成された群から選択された一つ以上のジンセノサイドの含有量が増加した高麗人参類の形成層由来幹細胞またはこれの抽出物の製造方法。
2. 前記高麗人参類の形成層由来幹細胞のＲｈ２、Ｒｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤのジンセノサイドの含有量が熱処理前と比較し増加したことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
3. 前記Ｒｈ２並びにＲｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤで構成された群から選択された一つ以上のジンセノサイドは、全ジンセノサイド含有量を基準に８０〜１００重量％の含有量で含まれることを特徴とする請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 前記Ｒｈ２は、Ｒｇ３、Ｒｋ１、Ｒｇ５、Ｒｈ２、Ｒｋ２、Ｒｈ３及びＰＰＤ全重量を基準として１０〜３５重量％の含有量で含まれることを特徴とする請求項１又は２に記載の製造方法。
5. 前記幹細胞抽出物のＲｈ２、Ｒｇ３及びＲｇ５のジンセノサイド含有量が熱処理前と比較し増加したことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
6. 前記静置は、１〜３５℃の温度で１〜１５日間行われることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
7. 前記静置段階前に、凍結乾燥を追加で行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
8. 前記熱処理段階前に、培養された高麗人参類の形成層由来幹細胞を熱風乾燥する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
9. 前記熱風乾燥は、４５〜７５℃の温度で２４〜７２時間行われることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
10. 前記熱処理は、１０分〜７２時間行われることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
11. 前記熱処理段階中１０〜２００ｒｐｍで撹はんする過程をさらに含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製造方法。
12. 前記高麗人参類は、白参、山参、山養参または樟脳参であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の製造方法。