CN102316883A - 含有包括野山参或人参的人参类的形成层来源的植物干细胞系作为有效成分的肝疾病的预防或治疗用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有包括野山参或人参的人参类(Panax ginseng)的形成层来源的同源的细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物中任一种以上作为有效成分的肝疾病的预防或治疗用组合物。根据本发明的人参类的形成层来源的同源的细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物将以往肝疾病治疗剂的副作用最小化而对于人体安全，且有使对于肝炎病毒的s抗体(HBsAb)及e抗体(HBeAb)增加的效果，且由于可抑制肝炎病毒的增殖，所以对于肝疾病的预防及治疗有用。合起来，肝损伤数值减小使的效果有，所以作为肝功能改善用功能性食品有用。

Description

含有包括野山参或人参的人参类的形成层来源的植物干细胞系作为有效成分的肝疾病的预防或治疗用组合物
【技术领域】
本发明涉及含有包括野山参或人参的人参类的形成层来源的细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物中任一种以上作为有效成分的肝疾病的预防或治疗用组合物。
【背景技术】
现代人由于由过度的应激与饮酒，吸烟及各种公害所致的环境污染，病毒等原因而暴露于多样的肝疾病的危险。作为代表性的肝疾病，有肝硬化症，酒精性肝硬变，脂肪肝，中毒性肝疾病，急性、慢性肝炎等。其中肝炎是蔓延在世界上的严重的疾病，程度虽然弱，但也有传染性。医疗界推定肝硬变与肝癌患者中70％～80％由慢性肝炎的恶化所致。
尤其是，乙型肝炎病毒(HBV)作为特异性地感染人体的嗜肝dna病毒科(Hepadnavirdae)系统的病毒，潜伏期是60～110天左右，且经多样的程度的临床期，从而90～95％完全地恢复。但是，在不从感染中恢复的患者的情况上，HBV DNA同化到人肝细胞的基因组DNA而发展成慢性活动性肝炎，肝硬病症，肝癌等。HBV所致的慢性肝炎与其他疾病一样，引起慢性病毒感染症，淋巴瘤疾病及慢性肾脏障碍。因此，可将慢性肝炎称作发展成更强力的形式的疾病而终究甚至使患者达到死亡的致死率非常高的疾病。
由于这样的理由，为了治疗肝炎病毒，干扰素，核酸衍生物或免疫调节物质等多种方法被尝试，但报告说有治疗效果的干扰素-α未能呈现持续性的抑制效果，且在母子间的垂直感染所致的患者等的情况中，示对干扰素-α的抗性而效果低。另外，至今未被开发可使肝炎治愈的药，仅是持续服用抗病毒剂而封堵向严重的肝疾病发展的实情。但是，报告说抗病毒剂引起病毒的突变，诱导对于药的抗性而使药的功效失效。
对此，至今的肝炎治疗是抑制病毒的增殖而抑制向严重的肝疾病进行的方法而止于消极的治疗，无如抗体形成的直接的治疗方法，所以要求开发新的肝炎的预防及治疗方法。
对此，本发明人为了开发包括肝炎的肝疾病的预防及治疗效果优秀的天然物质来源组合物，例的努力的结果，确认包括野山参及人参的人参类的形成层来源的同源的细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物对于肝疾病的预防及治疗具有优秀的效果，并本发明完成。
【发明内容】
本发明的目的在于提供将以往肝疾病治疗剂的副作用最小化的示肝疾病的预防及治疗活性的天然物质来源的组合物。
如上所述的目的达成为了，本发明提供含有从人参类(Panaxginseng)的形成层衍生出，且具有以下的特性的细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物中任一种以上的肝疾病的预防或治疗用组合物：
(a)先天性未分化状态(innately undifferentiated)；
(b)同源的细胞系(homogeneous cell line)；及
(c)示具有多个液泡的形态学特征。
本发明另外提供含有所述细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物中任一种以上的肝功能改善用功能性食品。
本发明另外提供含有所述细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物中任一种以上的肝炎病毒的增殖抑制用组合物。
本发明另外提供含有所述细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物中任一种以上的使对于肝炎病毒的抗体水平增加的免疫增强剂。
本发明另外提供所述细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物中任一种以上的肝疾病的预防或治疗用用途。
本发明另外提包括适用供所述细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物中任一种以上的步骤的肝疾病的预防或治疗方法。
本发明的其他特征及实施方式可从以下的详细的说明及随附的专利权利要求书变更明晰。
【附图说明】
图1中(a)是示根据本发明的同源的细胞系的诱导过程的照片((a)的A～D)，(b)是将野山参的形成层来源的同源的细胞系(A)及人参的子叶来源的愈伤细胞系(B)在光学显微镜下以单细胞水平观察的照片。
图2是将根据本发明的同源的细胞系及野山参培养根的肝炎病毒抑制效果比较观察的电泳照片(M：1kb阶梯标记物；C：对照组；G4：根据本发明的同源的细胞系的PBS提取物；G5：野山参培养根PBS提取物)。
图3是将根据本发明的同源的细胞系的肝炎病毒抑制效果以不同时间观察的结果的电泳照片(M：1kb阶梯标记物；C：对照组；G4：根据本发明的同源的细胞系的PBS提取物)。
【实施方式】
只要不以其他方式被定义，本说明书中使用的全部技术及科学术语与由本发明所属的技术领域中熟练的专家而通常理解具有相同的意味。一般地，本说明书中使用的命名法在本技术领域中好地被知，通常被使用。
本发明详述等中使用的主要术语的定义如下。
本申请中“形成层(cambium)”也称为“BUREUMKYO”，是使植物的茎与根变粗而可使植物体积生长的组织。形成层是细胞分裂最活泼地发生的分裂组织，从而报告称当用作植物组织培养的外植体时，使细胞的高速及大量生产可能(韩国注册专利第0533120号)。
本申请中“裂解产物”是指将细胞使用利用去污剂等的化学方法或物理方法等破碎而得到的细胞裂解物，且细胞系的“提取物”是指将细胞溶于溶剂而分离的物质，可利用蒸馏或蒸发而浓缩。此外，本申请中“培养物”是指包括培养的细胞系和/或培养液的物质，此时培养的细胞系是均包括由培养条件分化或有用物质的生产能力和/或分泌能力提高的细胞系的概念。
本申请中“先天性的未分化状态(innately undifferentiated)”是指不是经历脱分化过程而以未分化状态存在的，原本就维持分化前状态。
本发明的一方面涉及含有人参类(Panax ginseng)的形成层来源的同源的细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物中任一种以上作为有效成分的肝疾病的预防或治疗用组合物。在本发明中，人参类(Panax ginseng)包括野山参或人参(Lian M.L.et al.，J.PlantBiology，45：201，2002；Han J.Y.et al.，J.Plant Biology，49：26，2006；Teng W.L.et al.，Tissue and Organ Culture，68：233，2002)，此时，本发明中所述野山参或人参包括野外参或组织培养参类(不定根及不定根来源的细胞系)。
根据本发明的人参类的形成层来源的细胞系是(a)先天性未分化状态(innately undifferentiated)；(b)同源的细胞系(homogeneouscell line)；及(c)示具有多个液泡的形态学特征特征。另外，额外可以(a)悬浮培养时，以单细胞水平存在；(b)与人参类的形成层之外的组织来源的细胞系相比而对于生物反应器中的剪切应力(shearstress)具有低的敏感性；及(c)与人参类的形成层之外组织来源的细胞系相比而生长速度更快，且被稳定地培养作为特征。
本发明中所述同源的细胞系以由包括以下的步骤的分离方法收获为特征：
(a)收获含有人参类的形成层的组织；
(b)将所述收获的含有形成层的组织在包含IAA(吲哚-3-乙酸)或IBA(吲哚-3-丁酸)的培养基中培养而诱导形成层来源的细胞系，
此时，以在所述培养的施行中、培养前步骤或后步骤中向所述含有形成层的贮藏根组织施加渗透应激为特征；及
(c)回收所述诱导的形成层来源的细胞系。
本发明中所述细胞系可以通过额外施行在包含2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)，氨氯吡啶酸(picloram)及IBA(吲哚-3-丁酸)中任一种以上的培养基中增殖的步骤而收获为特征。
本发明中所述培养物可以在作为所述细胞系诱发剂包括3～5重量％的原糖或蔗糖；或茉莉酮酸甲酯(methyl jasmonate)，脱乙酰壳多糖，苯丙氨酸(phenylalanin)，苯甲酸，ABA，唾液酸(salicylicacid)及乙酸钠(sodium acetate)中任一种以上的培养基中施行额外培养的步骤而收获为特征。此时，优选所述培养基可为包括选自下列的物质的培养基：3～5重量％的原糖或蔗糖；及茉莉酮酸甲酯(methyljasmonate)，真菌类提取物，细菌类提取物，酵母(yeast)提取物，脱乙酰壳多糖，葡甘露聚糖(glucomanan)，葡聚糖(glucan)，苯丙氨酸(phenylalanine)，苯甲酸(benzoic acid)，唾液酸(salicylicacid)，花生四烯酸(arachonic acid)，STS，甲羟戊酸N-马尿酸，ABA，SNP，IPP，BHT，CCC，乙烯利(ethephon)，马尿酸(hippuicacid)，四铈硝酸铵(amminoium ceric nitrate)，AgNO3，硫酸氧钒(vanadyl sulfate)，p-氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)，brassinosteroids，藻酸钠(sodium alginate)，乙酸钠(sodium acteate)。
本发明中另外可利用向所述细胞系作为诱发剂处理光，光周期，剪切力，紫外线，热，乙烯，抗真菌剂，抗生素，重金属盐及高盐浓度等而添加物理化学应激而收获的培养物。在本发明的一个实施例中，则作为诱发剂可在细胞系培养物中利用空气应激。
本发明中使用的培养基是用于常规的植物组织培养的培养基，作为一例有N6培养基，SH培养基，MS培养基，AA培养基，LS培养基，B5培养基，WPM培养基，LP培养基，White培养基，GD培养基，DKW培养基，DCR培养基等，但不限于此。
本发明中所述提取物可以利用选自蒸馏水，低级醇等醇，丙酮，DMSO(二甲基亚砜)及它们的混合溶剂的溶剂而提取为特征。此时，低级醇意味着甲醇，乙醇等碳原子数1～5的醇。
本发明中所述肝疾病可以肝炎，肝癌，肝硬变，肝硬化症，脂肪肝及中毒性肝疾病中任一种为特征。
本发明在其他方面涉及含有所述同源的细胞系，其裂解产物，其提取物，其培养物中任一种以上的肝炎病毒的增殖抑制用组合物或使对于肝炎病毒的抗体水平增加的免疫增强剂。
本发明的一个实施例中，则将根据本发明的同源的细胞系提取物体外施用给HepG2.2.15细胞系，并通过PCR扩增确认HBV病毒粒子生成与否，结果与野山参培养根提取物无HBV病毒生成抑制效果相反，根据本发明的细胞系提取物呈现为抑制HBV病毒生成。
另一方面，本发明的再其他实施例中，则将所述同源的细胞系给患者施用后，实施了HBsAg，HBeAg的抗原和HBsAb，HBeAb，HBcAb的抗体及乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量检查，且其结果，形成解释为临床上治愈乙型肝炎的的s抗体，及确认了乙型肝炎病毒的抗原减少。
乙型肝炎病毒复制时，制成3个(c，s，e抗原)的主要抗原，c(core)抗原(HBcAg)是结构抗原决定簇，且s(surface)抗原(HBsAg)是由病毒表面蛋白呈递的抗原决定簇。其中e抗原(HBeAg)是知道乙型肝炎病毒感染与否的指示物。
表1
＊对乙型肝炎的免疫形成(健康增进中心，韩国健康管理学会)
※HBs Ag(EIA)：0～2.53(阴性)，及2.54或更多(阳性)
※HBs Ab(EIA)：0～14.9(阴性)，及15.0或更多(阳性)。
即，通过所述实施例确认了根据本发明的人参类的形成层来源的同源的细胞系有肝炎预防，并治疗的效果。另外确认，根据本发明的人参类的形成层来源的同源的细胞系使不仅s抗体，还使e抗体也增加，从而确认了有使对于肝炎病毒的抗体水平增加的免疫增强效果。
因此，本发明中，则即便无提示含有所述同源的细胞系裂解产物的组合物示肝疾病的预防及治疗效果的具体实施例，也如所述确认，其同源的细胞系，其提取物及其培养物对于肝疾病的预防及治疗具有活性，所以本领域技术人员明晰含有根据本发明的同源的细胞系裂解产物的组合物的情况也显示肝疾病的预防及治疗效果。
含有根据本发明的同源的细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物中任一种以上的肝疾病的预防或治疗用组合物，乙型肝炎病毒的增殖抑制用组合物及免疫增强剂各自单独包括所述同源的细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物中任一种以上，或者可包括一种以上的药学容许的载质，赋形剂或稀释剂而提供为药学组合物，且所述同源的细胞系，其裂解产物，其提取物或其培养物根据疾病及及其患病程度，患者的年龄，体重，健康状态，性别，施用途径及治疗时间等，可以适宜的药学有效的量包括在药学组合物中。
所述中“药学容许的”是指生理学容许，且人给施用时，通常不引起如胃肠障碍，头晕症的过敏反应或与此类似的反应的组合物。作为所述载质，赋形剂及稀释剂的例，可举：乳糖，右旋糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露糖醇，木糖醇，赤藓醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯胶，藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，甲基羟基苯甲酸盐，丙基羟基苯甲酸盐，滑石，硬脂酸镁及矿物油。
所述药学组合物可额外包括填充剂，抗凝剂，润滑剂，润湿剂，香料，乳化剂及防腐剂等。另外，本发明的药学组合物在施用给哺乳动物后为使可提供活性成分的迅速，持续或延迟的释放，可使用本领域公知的方法而剂型化。剂型可为粉末，颗粒，片剂，乳液，糖浆，起雾剂，软质或硬质明胶胶囊，灭菌注射溶液，灭菌粉末的形式。
另一方面，本发明的一个实施例中另外，根据本发明的同源的细胞系呈现使示肝损伤的数值的AST及ALT数值减小，被确认有肝功能改善效果。因此，本发明在再其他方面涉及含有所述人参类的形成层来源的同源的细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物中任一种以上的肝功能改善用功能性食品。此时，肝功能改善效果作为包括所述肝疾病预防及改善效果的概念而意味着使整体肝功能本身改善。
本申请中‘功能性食品’是指，向一般食品中添加根据本发明的同源的细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物中任一种以上，从而使食品的功能性提高。
【实施例】
以下，将通过实施例更详细说明本发明。本领域中技术人员明晰，这些实施例仅为了例示本发明，不可解释为本发明的范围由这些实施例限制。
尤其是，在下记实施例中确认了野山参的形成层来源的同源的细胞系，其提取物及其培养物的肝疾病的预防及抑制效果，本领域技术人员明晰，使用其裂解产物也可得到相同的结果。
【实施例1：人参类的形成层来源的同源的细胞系的制备】
1-1：植物材料的准备
(1)图1的(a)的A呈现用于本发明的野山参的典型外观。准备野山参后，为了使用野山参的主根部，用流水除去粘在表面的土或之外的污染物质，并利用液体洗剂洗涤主根的表面后，放置在流水中。将洗干净的组织加入在净化台内准备的灭菌的瓶，并用70％乙醇杀菌30秒～1分钟左右。之后，用灭菌水漂，利用1％～1.5％次氯酸钠(sodium hypochlorite，Junsei，Japan)而以5分钟～15分钟左右处理消毒液。此时，为了使消毒液有效渗透到组织内，低下几滴左右TWEEN 20(聚氧乙烯山里坦单月桂醇酯，Junsei，Japan)进行处理。此过程结束，则用灭菌水漂洗3次～5次左右。之后为了防止杀菌处理的组织的褐变，将包括抗氧化剂的BIM(褐变抑制介质)加入杀菌的主根，并振荡培养30分钟～1小时左右，并放在灭菌的滤纸上除去了水汽。
使用的BIM的组成及使用浓度如表2。
表2：BIM的组成及使用浓度
Figure BDA0000049735050000091
其中，盐浓度只添加对应于整体的1/4的量。
其后，为了防止所述材料褐变，放在放有包括抗氧化剂的CS溶液(切割溶液，表3)灭菌盘，表皮薄地剥下，分半，使各部分中包含分裂能力旺盛的形成层部分，而以长×宽×高＝0.5～0.7cm×0.5～0.7cm×0.2～0.5mm的大小切断。图1的(a)的B是为了使野山参的主根部中包含形成层而以所述大小切断而制备的外植体外观。
表3：CS(切割溶液)
  成分   浓度
  PVP(聚乙烯吡咯烷酮)   0.5％(w/v)
  抗坏血酸   100mg/l
  柠檬酸   150mg/l
(2)准备在生物反应器(bioreactor)中维持中的有100年的野山参不定根，并亦是放在装有表3的CS溶液的灭菌盘，且亦是与所述同一方法收获了包括形成层的外植体。
1-2：对包括野山参主根部形成层的外植体的渗透剂的处理
在实施例1-1中制备的外植体中，为了使分化的组织，即，韧皮部，木质部，髓部等坏死，仅使并分裂组织的形成层生存而处理了渗透应激。将包括所述形成层的外植体杂交(blotting)到铺有滤纸的预接种培养基(培养基1，表4)，而放入装有1M蔗糖(Duchefa，Netherland)溶液的瓶，在冷藏状态中渗透应激处理16～24小时后，在0.05M蔗糖溶液(蔗糖溶液)中处理5分钟，在0.1M蔗糖溶液中处理5分钟，而解除了高浓度的蔗糖所致的应激。之后将包括所述渗透应激被解除的形成层的外植体放在铺有滤纸的预接种培养基(培养基1)而除去了水汽。
表4：预接种培养基(培养基1)的组成
Figure BDA0000049735050000101
1-3：包括野山参的形成层的外植体中形成层来源的同源的细胞系的诱导
为了诱导形成层来源的具有分裂能力的同源的细胞系，将在所述实施例1-2中渗透应激处理的外植体细胞系接种到诱导培养基(培养基2，表5)。用于接种的培养基列于下记<表5>。将接种的外植体在22±1℃癌条件下培养。
表5：用于诱导形成层-来源的同源细胞系的培养基(培养基2)组成
  成分及条件   浓度及条件
  盐   全强度WPM
  蔗糖   3％(w/v)
  IAA(吲哚-3-乙酸)   2mg/l
  pH   5.8
  Gelrite   0.3％(w/v)
  抗坏血酸   100mg/l
  柠檬酸   150mg/l
此时，在不渗透处理而直接接种到同源的细胞系的诱导培养基的外植体中，则如<表6>所示，在接种初期(2～3天内)，快速以形成层为中心，呈现黄地反应，而经时呈现了外植体整体变黄的状态。将形成层中心的呈现黄的反应的外植体形成层来源的具有分裂能力的同源的细胞系进行分离及增殖，在最适培养基(培养基3)继代而继续同源的细胞系诱导及增殖尝试，但褐变状况变得严重，经过时间也除了褐变反应外也未呈现何种反应。
相反，渗透处理并解除后，接种于同源的细胞系诱导培养基的外植体如<表6>中记载，其他组织中，则不诱导细胞，且仅在形成层观察到特异性地同源的细胞诱导。即，渗透处理后，解除而接种的外植体中，则培养3～7天之间，外植体的形成层部分开始变成浅黄色。从这儿起，约7～14天后，变成浅黄色的部分中观察到了圆的细胞系诱导。此时，包括野地野山参的形成层的外植体及包括野山参不定根的形成层的外植体均观察到同一的结果。图1的(a)的C示包括野山参的形成层的外植体中具有形成层特异性分裂能力的同源的细胞系诱导的外观。
另一方面，对于渗透处理的外植体在使用不是具有形成层特异性分裂能力的同源的细胞系诱导培养基的常规的人参，野山参等人参类培养中使用的包括2，4-D的培养基时，培养7～10天之间外植体的整体部分开始变成黄色，由此约7～14天后在整体断面中观察到细胞诱导。
表6：用渗透应激处理的外植体与未用渗透应激处理的外植体之间的反应的比较
Figure BDA0000049735050000121
1-4：分离的野山参形成层来源的同源的细胞系的增殖
利用从所述实施例1-3衍生出的形成层来源的具有分裂能力的同源的细胞系而用于增殖。培养基以下记<表7>中提示的基本盐(salt)组成作为基础，如<表8>中所示，使用了形成层来源的具有分裂能力的同源的细胞系的增殖最适培养基。此时，在<表8>中，将2，4-D用于从野地野山参的形成层衍生的同源的细胞系的增殖，将IBA用于从野山参不定根衍生的同源的细胞系的增殖。
表7：用于具有分裂能力的形成层-来源的同源细胞系的分离及增殖的最佳培养基的基础盐组成
表8：用于具有分裂能力的形成层-来源的同源细胞系的分离及增殖的最佳培养基(培养基3)的组成
Figure BDA0000049735050000132
如图1的(a)的C所示渗透应激处理，及使用培养基2而衍生仅在形成层特异性地同源的细胞后，用<表8>中提示的培养基3继代的结果，形成层来源的具有分裂能力的同源的细胞持续分裂·增殖而在培养约10～20天后，可分离形成层来源的具有分裂能力的同源的细胞系。将这样分离的野山参形成层来源的同源的细胞系在同一培养基中培养而使具有分裂能力的同源的细胞系再次增殖。图1的(a)的D是使分离的形成层特异性同源的细胞系在<表8>中提示的培养基3中增殖的外观。
1-5：分离的细胞系的特性观察
将所述野山参形成层来源的同源的细胞系放入含有下记<表9>的液态培养基的瓶，在避光条件下于25±1℃中以100rpm的在旋转搅拌机(shaker)中培养了。继代培养周期固定为2周，从而使培养细胞始终在对数生长期状态维持高活力。此时，<表9>中2，4-D被用于从野地野山参的形成层衍生的同源的细胞系的培养，IBA被用于从野山参不定根衍生的同源的细胞系的培养。
另一方面，也将人参的子叶来源的愈伤(callus)在<表9>的培养基4中培养而与根据本发明的野山参形成层来源的同源的细胞系进行了比较。
表9：用于人参(Panax Ginseng)的悬浮培养基(培养基4)
首先观察细胞凝集程度(biological microscope CX31，Olympus，Japan)时，如<表10>根据本发明的2，4-D处理的野地野山参的形成层来源的细胞系在悬浮培养时，可观察到95％以上的以单细胞水平存在，根据本发明的IBA处理的不定根的形成层来源的细胞系亦是观察到60％以上以单细胞水平存在，而可确认根据本发明的细胞系在悬浮培养时，有以单细胞水平存在的特征。另外，如图1(b)的A中所示，2，4-D处理的野地野山参的形成层来源的细胞系及IBA处理的不定根的形成层来源的细胞系均可观察到具有多个液泡的形态学特征，且可确认未分化状态。但是，如图1(b)的B中所示，人参的子叶来源的愈伤细胞系中，则不可观察到这样的形态学特征。
表10：人参(Panax Ginseng)长期培养物的细胞聚集物的类型
Figure BDA0000049735050000151
另一方面，为了观察大量培养可能性，从而具有3L的内容积的气升式生物反应器(airlift bioreactor，Sung-Won Cytec，Korea)中培养了人参的子叶(cotyledon)来源的愈伤组织与根据本发明的野山参的形成层来源的同源的细胞。培养基使用了<表8>的液态培养基，且在避光条件下维持在25±1℃。
其结果，如<表11>中所示，人参的子叶(cotyledon)来源的培养物的倍增时间(doubling time)在瓶中是21天，与此相比在反应器(reactor)中，则变长为28天。即，在瓶中培养时，根据本发明的形成层来源的同源的细胞系与形成层之外组织来源的细胞系相比而确认在生长速度方面3～5倍左右高的增殖率，且大量反应器中，则在根据本发明的形成层来源的同源的细胞系与形成层之外组织来源的细胞系相比而确认了呈现5～9倍的高增殖率。这被判断由于反应器内的生长环生成、培养中的植物培养体凝集性与细胞壁变坚固而对于切断的敏感性而细胞生存率(cell viability)急剧地减小。
另一方面，根据本发明的2，4-D处理的野地野山参的形成层来源的同源的细胞培养物的倍增时间是3～4天，IBA处理的野山参不定根的形成层来源的同源的细胞培养物的倍增时间是5～6天，均在瓶与反应器之间无差异或反倒被缩短。形成层来源的同源的细胞培养物非常小地形成在生物反应器内的生长环面积，并给予培养基简单的刺激，从而动培养基，则内壁的环(ring)被简单地解消。另外，凝集小，具有多个液泡，对于切断的敏感性弱而不导致细胞生存率(cellviability)的减小。
即，根据本发明的形成层来源的同源的细胞系由于对于在为大量培养的生物反应器中由搅拌作用的剪切应力而具有低的敏感性，所以确认了生物反应器内急速大量生长可能。因此，根据本发明的形成层来源的同源的细胞系与形成层之外组织来源的细胞系相比而对于切断应激而可具有5～9倍的低的敏感性。
表11：液体悬浮液培养及生物反应器中野山参形成层-来源的细胞系及子叶-来源的细胞系的倍增时间
Figure BDA0000049735050000161
【实施例2：野山参的形成层来源的同源的细胞系的干燥及提取物制备】
从实施例1的野山参不定根的形成层来源的同源的细胞系如以下所示进行干燥及提取。
(1)干燥细胞系的制备
(i)使除去培养液的细胞系冷冻干燥或热风干燥。
(ii)所述干燥的细胞系是利用粉碎机而粉碎而得到的。
(2)蒸馏水提取物的制备
(i)向使除去培养液的细胞系及热风干燥，冷冻干燥细胞系500g添加5000ml的蒸馏水而使在50℃中搅拌且提取6小时而得到。
(ii)所述溶解后，使以3,000g离心10分钟而取上清液，从而得到蒸馏水可溶性物质。
(iii)将所述中得到的蒸馏水可溶性物质利用旋转真空浓缩机而减压浓缩了。
(3)乙醇提取物的制备
(i)向使除去培养液的细胞系及热风干燥，冷冻干燥细胞系500g添加5000ml的乙醇而50℃中使搅拌且提取6小时而得到。
(ii)所述溶解后，使在3,000g离心10分钟而取上清液，从而得到乙醇可溶性物质。
(iii)将所述中得到的乙醇可溶性物质利用旋转真空浓缩机而减压浓缩了。
(4)PBS(磷酸缓冲盐水)提取物的制备
(i)向实施例2-(1)的冷冻干燥细胞系500g添加5000ml的PBS溶液而用热水浴法于80℃加热2～3小时而进行了提取。
(ii)使所述中得到的提取物冷冻干燥而使至500μg/μl地溶于PBS(pH7.4)而进行了准备。
【实验例1：人参类的形成层来源的同源的细胞系的对于B型肝炎病毒的抗病毒效果的确认】
为了确认根据本发明的人参类的形成层来源的同源的细胞系的对于B型肝炎病毒的抗病毒效果，依赖水源大学生命科学与微生物学实验室而施行了乙型肝炎病毒抑制实验。
首先，对于作为从HepG2来源的重组细胞系的具有制备HBV病毒粒子而释放的特征的细胞系的HepG2.2.15细胞系，使用DMEM10培养基(Hyclone-high葡萄糖，10％FBS，10μg/μl庆大霉素)，从而在37℃，5％CO2温育器中进行了培养。HepG2细胞作为已公知，且广泛分部，且容易得到的人肝癌细胞，HepG2细胞系的建立及特性如美国专利4,393,133所述。此细胞系的样品另外可从美国典型培养物保藏中心，由Rockville，Maryland以保藏编号ATCC HB 8065，以及从欧洲动物细胞保藏中心，Porton Down，UK得到。它们细胞是多样的蛋白，例如是在Broze及Miletich，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 84，1886-1890(1987)与美国专利4,996,852，5,106,833及5,212,091中被用作也以脂蛋白联合凝集抑制因子(LACI)被知的组织因子抑制因子(TFI)的来源。HepG 2.2.15细胞是这样的HepG2细胞的衍生物，且以Sells et al.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 84，1005-1009(1987)中记载的方式制备。
之后HepG2.2.15细胞系在24-孔中生长到70％左右后，将所述实施例2的(4)的PBS提取物以对于24孔大小的细胞培养液而5mg的浓度添加。另外，为了比较与常规的野山参组织的效果而将冷冻干燥的野山参培养根与所述实施例2的(4)同一方法用PBS提取物制备后，亦是以同一浓度添加于HepG2.2.15细胞系培养液。各自添加所述实施例2的(4)的PBS提取物及所述野山参培养根PBS提取物后，换成上培养培养基DMEM2(Hyclone-high葡萄糖2％FBS，10μg/μl庆大霉素)而使用，并在37℃，5％CO2温育器中进行了培养。
72小时培养后，为了测定HBV病毒粒子的生成与否，用培养液5μl使热灭活(heat inactivation)后用作模板(template)，从而施行了PCR。此时作为对照组，使用了什么也不处理而在DMEM2中培养的培养液。
用于施行PCR的引物碱基序列是选择HBV病毒HBsAg基因的共同的部分而制备，正向引物使用了157～179；5’-GGGGGAATTCATGGAGAACATCACATCAGGATTC-3’(SEQID NO：1)，且反向引物使用了814～837；5’-GGGCTGCAGTTAAATGTATACCCAAAGACAAAA-3’(SEQ IDNO：2)。使左侧引物与右侧引物之间的DNA大小为750bp。施行PCR后，将各自的样品在1.0％琼脂糖中电泳。
其结果，如图2中所示，对照组(C)与用冷冻干燥野山参培养根提取物处理的组(G5)中HBsAg DNA扩增，根据本发明的细胞系的野山参形成层来源的同源的细胞系的提取物处理的组(G4)中，则HBsAg DNA未被扩增。根据本发明的同源的细胞系处理时不生成PCR生成物被判断为根据本发明的细胞系由于抑制剂作用而病毒生成过程被抑制。
另一方面，对于所述中确认效果的根据本发明的同源的细胞系提取物而为了观察以不同时间的抑制效果，用与所述同一方法处理同源的细胞系提取物5mg，并各自培养24hr，48hr，72hr后，选择培养液5μl而使热灭活(heat inactivation)后用作模板(template)，从而亦是用与所述同一方法施行了PCR。
其结果，如图3中所示，处理后24小时培养后施行PCR而观察时，确认HBsAg DNA扩增产物，在经过48小时后起，开始观察到扩增产物生成抑制效果，且经过72小时后，观察不到扩增产物。即，处理后经过48小时时，确认示乙型肝炎病毒抑制效果。
合起来，额外将向实施例1的14天悬浮培养的野山参形成层来源的同源的细胞系作为诱发剂处理空气应激3～5天的细胞系培养物用所述实施例2的(4)的方法制成PBS提取物后，用与所述同一方法施行了PCR。其结果，野山参形成层来源的同源的细胞系的培养物另外确认，以与图3类似的水平示乙型肝炎病毒抑制效果。
【实验例2：人参类的形成层来源的同源的细胞系的肝疾病预防及治疗效果的确认(1)】
为了确认根据本发明的人参类的形成层来源的同源的细胞系的肝炎预防及治疗效果，对于乙型肝炎病毒携带者及急性肝炎，肝癌患者而将所述实施例2的(1)中制备的干燥细胞系粉碎物以粉末形式施用。服用以一天两次(早晨及晚上)各1g溶于水的形式经口施用。
施用时间随患者而不同，且施用后HBsAg，HBeAg的抗原和，HBsAb，HBeAb，HBcAb的抗体用免疫血清检查(EIA，Enzygnost，Behringwerke，Germany)法，乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量检查用Hybrid Capture II test(HC-II，Digene Corp.，Beltsville，MD，USA)根据各制造商提示的说明书的测定方法实施。另一方面，AST数值及ALT数值利用Hitachi 7600系列(Hitachi，Tokyo，Japan)自动化学分析机而根据制备者的检查指南进行了测定。
测定的结果及各不同患者施用时间如下。
表12：临床病例1(N/A：未测定；-：阴性；+：阳性)
Figure BDA0000049735050000201
根据本发明的细胞系的施用前HBsAg(乙型肝炎表面抗原)是阳性，但施用7个月后被测定为阴性。另外，HBsAb(乙型肝炎表面抗体)由阴性施用7个月后被测定为阳性，由根据本发明的同源的细胞系的施用可确认s抗体(HBsAb)形成。
s抗体的形成解释为乙型肝炎的治愈，所以由根据本发明的细胞系的施用可确认乙型肝炎被治疗。
表13：临床病例2
  林XX(男，38)疾病：肝癌   HBsAg   HBsAb   其他
  施用之前   N/A   N/A
  施用后3个月   -(0.46)   +(17)   对乙型肝炎的免疫形成
施用3个月后测定的结果，HBsAg(乙型肝炎表面抗原)被测定为阴性，HBsAb(乙型肝炎表面抗体)被测定为阳性。s抗体的阳性意味对于乙型肝炎的治愈，所以这反证，由根据本发明的同源的细胞系的施用而s抗体形成。
对此，由根据本发明的同源的细胞系的施用可确认乙型肝炎被治疗。另外，也可合起来确认使肝癌改善的效果。
表14：临床病例3
Figure BDA0000049735050000211
施用15天后测定的结果，施用前HBeAg(乙型肝炎被膜抗原)从23.25数值减少至3.22，从而呈现为病毒的增殖减小。另一方面，HBeAb与HBsAb均被测定为阳性。
因此可确认，根据本发明的同源的细胞系具有乙型肝炎的治疗效果。
另一方面，对于所述患者的以后的施用期间的测定结果如下。
表15：对临床病例3的追加测量
Figure BDA0000049735050000212
如所述，如果观察施用45天以后的结果，与所述表14的施用前及施用15天后的数据比较时，HBsAg及HBeAg呈现为减小，且HBsAb及HBeAb也呈现增加水平，然后逐渐呈现为减小。但是，抗体的减小在正常范围(参照基准值)的阳性区间，这样的减小看作是由根据本发明的同源的细胞系施用而抗原显著减小所致。
另一方面，肝的破坏程度示的间数值测定项目的AST及ALT项目测定的结果，呈现为变动或逐渐减小趋势而可确认有肝功能改善及肝疾病的治疗效果。
表16：临床病例4
在施用后15天及44天后各自测定的结果，第15天测定结果中，HBeAg，HBV-DNA均呈现为阳性，HBeAb呈现为阴性，但在第44天测定结果中，HBeAg，HBV-DNA均呈现为阴性，HBeAb呈现为阳性。由根据本发明的同源的细胞系的施用对于肝炎病毒的抗原减小，可确认根据本发明的同源的细胞系抑制肝炎病毒的增殖。另一方面，对于肝炎病毒的抗体增加，所以可确认有对于肝炎病毒的免疫增强效果。
因此可确认，根据本发明的同源的细胞系具有乙型肝炎的治疗效果。
另一方面，对于所述患者的以后的施用期间的测定结果如下。
表17：对临床病例4的追加测量
  测量指示物   标准值   施用之前  施用后2个半月  施用后3个半月  施用后4个半月
  AST   0～37   146   34   29   26
  ALT   0～40   47   27   26   21
  HBeAg   -   +   -   -(0.01)   -(0.01)
  HBeAb   +   -   +   +(0.22)   +(0.24)
  HBV-DNA   -(0.5)   +   -   -(＜0.5)   -(＜0.5)
所述如，如果额外观察施用后经过2个半月后的结果，HBeAg，HBV-DNA均呈现为阴性，HBeAb可确认维持阳性测定结果。另一方面，在观察示肝的破坏程度的肝数值测定项目的AST及ALT项目测定的结果时，可确认与施用前的数值比较而施用2个半月后进入正常范围，且对此可确认，根据本发明的同源的细胞系有肝功能改善及肝疾病的治疗效果。
表18：临床病例5
Figure BDA0000049735050000231
施用后15天后测定的结果，HBeAg(乙型肝炎被膜抗原)从施用前306.30数值到施用15天后23.60而抗原减少，且HBV-DNA亦是从施用前1.0×108到211数值而示显著的减小。
对此可确认，根据本发明的同源的细胞系有抑制乙型肝炎病毒的增殖的效果。
表19：临床病例6
Figure BDA0000049735050000232
施用后15天后测定的结果，HBeAg(乙型肝炎被膜抗原)从施用前460.1数值到施用15天后301.0而呈现为抗原减少。
对此可确认，根据本发明的同源的细胞系有抑制乙型肝炎病毒的增殖的效果。
表20：临床病例7
Figure BDA0000049735050000233
施用后15天后测定的结果，HBsAg(乙型肝炎表面抗原)从施用前5292数值到施用15天后100而呈现为抗原减少。
对此可确认，根据本发明的同源的细胞系有使乙型肝炎缓和的效果。
表21：临床病例8
Figure BDA0000049735050000241
施用15天后测定的结果，HBV-DNA的数值从施用前23,889到2000以下而示显著的减小。
对此可确认，根据本发明的同源的细胞系有抑制乙型肝炎病毒的增殖的效果。
综合所述测定结果，则将根据本发明的人参类的形成层来源的同源的细胞系长期施用40天以上时，测定到临床上解释为乙型肝炎的治愈的s抗体形成而呈现为有肝炎治疗的效果及使免疫增强的效果。15天施用中，被测定为乙型肝炎病毒的抗原减少，所以呈现为抑制乙型肝炎病毒的增殖，并有使肝炎缓和的效果。另外确认，示有降低肝损伤程度的AST及ALT数值的效果。
对此可确认，根据本发明的人参类的形成层来源的同源的细胞系不仅有肝炎预防，并治疗的效果，还有肝功能改善，并肝疾病预防及治疗的效果。
【对照例1：对照组的野山参不定根的肝炎预防及治疗效果的检查】
为了与根据本发明的人参类的形成层来源的同源的细胞系的肝炎预防及治疗效果相对照，对于乙型肝炎病毒携带者而将野山参不定根干燥粉以与所述实验例1相同的方法施用后，对于施用15天的肝炎携带者及施用1个月的肝炎携带者而亦是用与实验例1相同的方法，HBsAg，HBeAg的抗原和HBsAb，HBeAb，HBcAb的抗体用免疫血清检查(EIA)法，乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量检查用HybridCapture II test进行了测定。其结果如以下的表22～24。
表22：对照例1
Figure BDA0000049735050000251
表23：对照例2
Figure BDA0000049735050000252
表24：对照例3
Figure BDA0000049735050000253
施用对照组的野山参不定根后测定的结果，如表22～24中所示，施用15天时呈现为几乎不使对于肝炎病毒的抗原减小。另外，1个月间施用时也对于肝炎病毒的抗原减小效果或抗体水平增加效果亦是甚微。
对此可确认，与常规的人参类来源的细胞系相比，根据本发明的人参类的形成层来源的同源的细胞系的肝疾病的预防及治疗效果显著。
【实验例3：人参类的形成层来源的同源的细胞系的肝疾病预防及治疗效果的确认(2)】
为了确认根据本发明的人参类的形成层来源的同源的细胞系的肝炎预防及治疗效果，额外对于乙型肝炎患者而将所述实施例2的(1)中制备的干燥细胞系粉碎物以粉末形式施用。服用是以一天两次(早晨及晚上)1g各溶于水的形式经口施用。
施用时间随患者而不同，且施用后HBeAg，HBsAg的抗原和，HBeAb的抗体用免疫血清检查(EIA，Enzygnost，Behringwerke，Germany)法，乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量检查用Hybrid CaptureII test(HC-II，Digene Corp.，Beltsville，MD，USA)，根据各制造商提示的说明书的测定方法实施。另一方面，AST数值及ALT数值利用Hitachi 7600系列(Hitachi，Tokyo，Japan)自动化学分析机而根据制备者的检查指南测定。
测定的结果及各不同患者施用时间如下。
表25：临床病例9
Figure BDA0000049735050000261
施用后20天及约2个半月后各自测定的结果，施用约2个半月后呈现为HBeAg显著减小，可确认根据本发明的细胞系抑制肝炎病毒的增殖。另一方面，出现对于肝炎病毒的抗体，所以可确认有对于肝炎病毒的免疫增强效果。
因此可确认，根据本发明的同源的细胞系具有乙型肝炎的治疗效果。
表26：临床病例10(N/A：未测定；-：阴性；+：阳性)
Figure BDA0000049735050000262
Figure BDA0000049735050000271
施用开始后4个月间是不规则的施用，但此后规则的施用开始之后，施用第6个月开始，对于肝炎病毒的抗原正常化为阴性，且抗体亦是正常化为阳性，可确认根据本发明的细胞系具有乙型肝炎的治疗效果。
另外，在肝数值测定结果中也确认施用第6个月开始肝数值正常化，可确认有肝功能改善及肝疾病治疗的效果。
表27：临床病例11
Figure BDA0000049735050000272
在施用后经过约6个月左右的时间点，确认对于肝炎病毒的抗体，所以可见有对于肝炎病毒的免疫增强效果，且另外，HBeAg亦是逐渐减小而在经过约6个月的时间点可观察到显著的减少值，所以可确认根据本发明的细胞系抑制肝炎病毒的增殖。
因此可确认，根据本发明的同源的细胞系具有乙型肝炎的治疗效果。
表28：临床病例12
Figure BDA0000049735050000273
Figure BDA0000049735050000281
在施用后经过5个月又18日左右的时间点，确认对于肝炎病毒的抗体，可见有对于肝炎病毒的免疫增强效果，且另外，HBeAg亦是逐渐减小而在经过5个月又18日的时间点可观察到显著的减少值，所以可确认根据本发明的同源的细胞系抑制肝炎病毒的增殖。
因此可确认，根据本发明的同源的细胞系具有乙型肝炎的治疗效果。
表29：临床病例13
Figure BDA0000049735050000282
随着根据本发明的同源的细胞系施用，HBV-DNA的数值减小，从而在经过约2个月左右的时间点起呈现正常范围内的稳定的数值，从而可确认根据本发明的同源的细胞系有抑制乙型肝炎病毒的增殖的效果。
表30：临床病例1
Figure BDA0000049735050000291
测定HBV-DNA的数值的结果，呈现增减的变化后在经过约7个月时间点起呈现正常范围内的稳定的数值，从而可确认根据本发明的同源的细胞系有抑制乙型肝炎病毒的增殖的效果。另一方面，HBsAg抗原的情况也呈现为阳性水平或逐渐减小而呈现为对抑制有效果。
表31：临床病例15
Figure BDA0000049735050000292
随着根据本发明的同源的细胞系施用，HBV-DNA的数值减小，从而在经过约7个月左右的时间点起呈现正常范围内的稳定的数值，从而可确认根据本发明的同源的细胞系有抑制乙型肝炎病毒的增殖的效果。
表32：临床病例16
  金XX(女，42)  ALT  AST   其他
  标准值  0～38  0～43
  施用之前  429  333
  施用后15天  34  25   肝脏水平的降低
作为示施用15天后的肝的破坏程度的肝数值测定项目的AST及ALT项目测定的结果，可确认与施用前的数值比较而进入正常范围，且对此可确认，根据本发明的同源的细胞系有肝功能改善及肝疾病治疗效果。
表33：临床病例17
Figure BDA0000049735050000301
在施用后经过1个月又9日的时间点，确认对于肝炎病毒的抗体，且HBV-DNA数值正常化，且在经过4个月又10日的时间点可确认抗原值也正常化。因此可确认，根据本发明的同源的细胞系具有乙型肝炎的治疗效果。
综合所述追加的对于肝炎患者的测定结果，则根据本发明的人参类的形成层来源的同源的细胞系抑制肝炎病毒的增殖，同时呈现为有带来对此的免疫增强效果的效果。另外，亦是确认有示肝损伤程度的AST及ALT数值降低效果，可确认根据本发明的人参类的形成层来源的同源的细胞系不仅有肝炎预防，并治疗的效果，还有肝功能改善，并肝疾病预防及治疗的效果。
【制备例1：药学制剂制备例】
【制剂例1：片剂的制备】
将实施例2中制备的细胞系提取物100mg玉米淀粉100mg，乳糖100mg及硬脂酸镁2mg混合而根据常规的片剂制备方法进行了制备。
【制剂例2：胶囊剂的制备】
将实施例2中制备的细胞系提取物500mg填充到软质明胶胶囊而制备胶囊剂。
【制剂例3：糖浆剂的制备】
以实施例1中制备的细胞系1g，异构化糖10g，甘露糖醇5g，适量的纯化水的含量，根据常规的液剂的制备方法，制备了100ml的糖浆剂。
【制剂例4：注射剂的制备】
将实施例2中制备的细胞系提取物200mg向以聚氧基乙烯氢化蓖麻油含有油的生理盐水200mg中加热溶解而制备了以0.1％的浓度含有混合提取物的注射剂。
【制备例2：功能性食品的制备-功能性饮料的制备】
【制备例1】
使实施例1中制备的细胞系200mg溶于96ml的水后，作为佐剂添加维生素C 500mg，作为香料添加柠檬酸，寡糖各自1g，并作为防腐剂添加苯甲酸钠0.05g后添加纯化水而制成全量100ml而制备了功能性饮料。
【制备例2】
使实施例2中制备的细胞系提取物200mg溶于96ml的水后，作为添加佐剂维生素C 500mg，作为香料添加柠檬酸，寡糖各自1g，并作为防腐剂添加苯甲酸钠0.05g后，添加纯化水而制成全量100ml而制备了功能性饮料。
【工业实用性】
如以上说明，根据本发明的同源的细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物作为天然物质来源的组合物，由于可使以往肝疾病治疗剂的副作用最小化而对于人体安全，且使对于肝炎病毒的s抗体(HBsAb)及e抗体(HBeAb)增加，抑制肝炎病毒的增殖，所以对于肝疾病的预防及治疗有用。总之，有使肝损伤数值减小的效果，所以作为肝功能改善用功能性食品有用。
以上详细说明了本发明的内容的特定的部分，对于本领域普通技术人员而言，明晰这样的具体技术仅为优选的实施实施方式，本发明的范围不受此限制。因此，本发明的实际范围应由随附的权利要求与其等价物定义。
【序列表自由正文】
附加了电子文件。
Figure IDA0000049735100000011

Claims (15)

1.肝疾病的预防或治疗用组合物，其含有从人参类(Panaxginseng)的形成层衍生出，且具有以下的特性的细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物中任一种以上：
(a)先天性未分化状态(innately undifferentiated)；
(b)同源的细胞系(homogeneous cell line)；及
(c)示具有多个液泡的形态学特征。
2.权利要求1的肝疾病的预防或治疗用组合物，其特征在于，其中所述细胞系还具有以下的特性，：
(a)悬浮培养时，以单细胞水平存在；
(b)与人参类的形成层之外的组织来源的细胞系相比而对于生物反应器中的剪切应力(shear stress)具有低的敏感性；及
(c)与人参类的形成层之外组织来源的细胞系相比而生长速度更快，且被稳定地培养。
3.权利要求1的肝疾病的预防或治疗用组合物，其特征在于，其中所述细胞系由包括以下步骤的分离方法收获：
(a)收获含有人参类的形成层的组织；
(b)将所述收获的含有形成层的组织在包含IAA(吲哚-3-乙酸)或IBA(吲哚-3-丁酸)的培养基中培养而诱导形成层来源的细胞系，此时，以在所述培养的施行中、培养前步骤或后步骤中向所述含有形成层的贮藏根组织施加渗透应激为特征；及
(c)回收所述诱导的形成层来源的细胞系。
4.权利要求1～3中任一项的肝疾病的预防或治疗用组合物，其特征在于，其中所述人参类是野山参或人参。
5.权利要求1～3中任一项的肝疾病的预防或治疗用组合物，其特征在于，其中所述肝疾病是肝炎，肝癌，肝硬变，肝硬化症，脂肪肝及中毒性肝疾病中的任一种。
6.权利要求1的肝疾病的预防或治疗用组合物，其特征在于，其中所述提取物利用选自蒸馏水，醇，丙酮，DMSO(二甲基亚砜)，PBS(磷酸缓冲盐水)及它们的混合溶剂的溶剂提取。
7.肝功能改善用功能性食品，其含有从人参类的形成层衍生出，且具有以下的特性的细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物中任一种以上：
(a)先天性未分化状态(innately undifferentiated)；
(b)同源的细胞系(homogeneous cell line)；及
(c)示具有多个液泡的形态学特征。
8.权利要求7的肝功能改善用功能性食品，其特征在于，其中所述细胞系还具有以下的特性：
(a)悬浮培养时，以单细胞水平存在；
(b)与人参类的形成层之外的组织来源的细胞系相比而对于生物反应器中的剪切应力(shear stress)具有低的敏感性；及
(c)与人参类的形成层之外组织来源的细胞系相比而生长速度更快，且被稳定地培养。
9.权利要求7的肝功能改善用功能性食品，其特征在于，其中所述细胞系由包括以下的步骤的分离方法收获：
(a)收获含有人参类的形成层的组织；
(b)将所述收获的含有形成层的组织在包含IAA(吲哚-3-乙酸)或IBA(吲哚-3-丁酸)的培养基中培养而诱导形成层来源的细胞系，此时，以在所述培养的施行中、培养前步骤或后步骤中向所述含有形成层的贮藏根组织施加渗透应激为特征；及
(c)回收所述诱导的形成层来源的细胞系。
10.肝炎病毒的增殖抑制用组合物，含有从人参类的形成层衍生出，且具有以下的特性的细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物中任一种以上：
(a)先天性未分化状态(innately undifferentiated)；
(b)同源的细胞系(homogeneous cell line)；及
(c)示具有多个液泡的形态学特征。
11.权利要求10的肝炎病毒的增殖抑制用组合物，其特征在于，其中所述细胞系还具有以下的特性：
(a)悬浮培养时，以单细胞水平存在；
(b)与人参类的形成层之外的组织来源的细胞系相比而对于生物反应器中的剪切应力(shear stress)具有低的敏感性；及
(c)与人参类的形成层之外组织来源的细胞系相比而生长速度更快，且被稳定地培养。
12.权利要求10的肝炎病毒的增殖抑制用组合物，其特征在于，其中所述细胞系由包括以下的步骤的分离方法收获：
(a)收获含有人参类的形成层的组织；
(b)将所述收获的含有形成层的组织在包含IAA(吲哚-3-乙酸)或IBA(吲哚-3-丁酸)的培养基中培养而诱导形成层来源的细胞系，此时，以在所述培养的施行中、培养前步骤或后步骤中向所述含有形成层的贮藏根组织施加渗透应激为特征；及
(c)回收所述诱导的形成层来源的细胞系。
13.使对于肝炎病毒的抗体水平增加的免疫增强剂，其含有从人参类的形成层衍生出，且具有以下的特性的细胞系，其裂解产物，其提取物及其培养物中任一种以上：
(a)先天性未分化状态(innately undifferentiated)；
(b)同源的细胞系(homogeneous cell line)；及
(c)示具有多个液泡的形态学特征。
14.权利要求13的使对于肝炎病毒的抗体水平增加的免疫增强剂，其特征在于，其中所述细胞系还具有以下的特性：
(a)悬浮培养时，以单细胞水平存在；
(b)与人参类的形成层之外的组织来源的细胞系相比而对于生物反应器中的剪切应力(shear stress)具有低的敏感性；及
(c)与人参类的形成层之外组织来源的细胞系相比而生长速度更快，且被稳定地培养。
15.权利要求13的使对于肝炎病毒的抗体水平增加的免疫增强剂，其特征在于，其中所述细胞系由包括以下的步骤的分离方法收获：
(a)收获含有人参类的形成层的组织；
(b)将所述收获的含有形成层的组织在包含IAA(吲哚-3-乙酸)或IBA(吲哚-3-丁酸)的培养基中培养而诱导形成层来源的细胞系，此时，以在所述培养的施行中、培养前步骤或后步骤中向所述含有形成层的贮藏根组织施加渗透应激为特征；及
(c)回收所述诱导的形成层来源的细胞系。
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