CN104931327B - 微米级生物材料石蜡切片方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种微米级生物材料石蜡切片的方法。该方法首先是将微米级生物材料固定，固定方法是将微米级生物材料悬浮于血清中，得微米级生物材料与血清混合物，再将所得的微米级生物材料与血清混合物缓慢注入Bouin固定液中，得到包裹微米级生物材料的沉淀物，然后将所得的沉淀物经过脱水处理得预处理物，所得的预处理物进行常规石蜡包埋和切片。本发明的微米级生物材料的石蜡切片方法，能简单有效的固定微米级生物材料，克服了以往的微米级生物材料切片时材料易变形，切片不连续，或存在空洞，导致无法切片或切片不完整的缺陷，切片厚度可达5um。本发明的方法操作简单，不需要专门设备，试剂易得，便于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种微米级生物材料石蜡切片的方法。
背景技术
石蜡切片是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法，其具有操作简单、价格低廉的特点，石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。
活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。因此，石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。
石蜡切片的固定步骤，一般是采用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定也能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液等。但在生物领域研究中，切片通常会遇到肉眼无法看见的、微米级的生物材料，例如细胞团、植入前的动物胚胎等，采用常用的固定剂对材料的固定效果不理想，切片时材料易变形，切片不连续，或存在空洞，导致无法切片或切片不完整，目前，一直没有较理想的微米级生物材料石蜡切片方法，研究者们只能采用费用、设备都要求较高的电镜观察方法，限制了对微米级生物材料的研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的首先在于提供一种微米级生物材料的固定方法，该方法能简单有效的固定微米级生物材料；本发明的目的之二在于提供一种微米级生物材料石蜡切片方法，微米级生物材料采用上述的固定方法固定之后，利于后续的切片操作；本发明的目的之二在于提供一种小鼠植入前胚胎的石蜡切片方法，由该方法得到的切片质量好，克服了现有技术存在的缺陷。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
微米级生物材料的固定方法，将微米级生物材料悬浮于血清中，得微米级生物材料与血清混合物，再将所得的微米级生物材料与血清混合物缓慢注入Bouin固定液中，得到包裹微米级生物材料的沉淀物。
所述的微米级生物材料的固定方法，所述Bouin固定液为苦味酸饱和液、甲醛和冰醋酸的混合液，所述苦味酸饱和液、甲醛和冰醋酸的体积比为75：25：5；所述苦味酸饱和液浓度为0.015g/ml，具体是将1.5g苦味酸固体溶解在100ml蒸馏水中，65℃水浴使其充分溶解，使用时40℃温浴Bouin固定液。
因此，本发明还进一步提供了Bouin固定液与血清组合在石蜡切片材料固定中的应用。
微米级生物材料石蜡切片方法，包括如下进行的步骤：
(1)将微米级生物材料悬浮于血清中，得微米级生物材料与血清混合物，再将所得的微米级生物材料与血清混合物缓慢注入Bouin固定液中，得到包裹微米级生物材料的沉淀物；
(2)将步骤(1)所得的沉淀物依次经过50％乙醇水溶液处理、70％乙醇水溶液处理、90％的乙醇水溶液处理、无水乙醇处理、二甲苯与乙醇的混合液处理、二甲苯处理及二甲苯与石蜡的混合液处理，得预处理物；所述二甲苯与乙醇的混合液中二甲苯与乙醇的体积比为1:1；所述二甲苯与石蜡的混合液中二甲苯与石蜡的体积为1:1；
(3)将步骤(2)所得的预处理物进行常规石蜡包埋和切片。
进一步，所述的微米级生物材料石蜡切片方法，所述步骤(1)中，所述包裹微米级生物材料的沉淀物为凝结成直径为1-2mm的块状沉淀物。
进一步，所述的微米级生物材料石蜡切片方法，所述步骤(2)中，50％乙醇水溶液处理8-15min，70％乙醇水溶液处理8-15min，90％的乙醇水溶液处理8-15min，无水乙醇处理25-35min，二甲苯与乙醇的混合液处理25-35min，二甲苯处理8-15min，二甲苯与石蜡的混合液处理2.5-3.5h。
优选的，所述的微米级生物材料石蜡切片方法，所述步骤(2)中，50％乙醇水溶液处理10min，70％乙醇水溶液处理10min，90％的乙醇水溶液处理10min，无水乙醇处理30min，二甲苯与乙醇的混合液处理30min，二甲苯处理10min，二甲苯与石蜡的混合液处理3h。
本发明还具体的提供了一种小鼠植入前胚胎的石蜡切片方法，包括如下进行的步骤：
(1)取小鼠植入前胚胎，用PBS缓冲液洗涤，除去组织碎片及红细胞杂质，得待切片组织；
(2)将步骤(1)所得的待切片组织分散并悬浮于血清中，得小鼠胚胎与血清混合物，吸取含有一个或多个小鼠胚胎的所述混合物缓慢注入Bouin固定液中，得到包裹小鼠胚胎的沉淀物；
(3)将步骤(2)所得的沉淀物依次经过50％乙醇水溶液处理8-15min、70％乙醇水溶液处理8-15min、90％的乙醇水溶液处理8-15min、无水乙醇处理25-35min、二甲苯与乙醇的混合液处理25-35min、二甲苯处理8-15min及二甲苯与石蜡的混合液处理2.5-3.5h，得预处理物；所述二甲苯与乙醇的混合液中二甲苯与乙醇的体积比为1:1；所述二甲苯与石蜡的混合液中二甲苯与石蜡的体积为1:1；
(4)将步骤(3)所得的预处理物进行常规石蜡包埋和切片。
进一步，所述的小鼠植入前胚胎的石蜡切片方法，所述步骤(2)中，所述血清优选为胎牛血清。
本发明的有益效果：
(1)本发明的微米级生物材料的固定方法，该方法能简单有效的固定微米级生物材料，不需特殊的试剂及仪器，解决了现有技术中对微米级生物材料的固定效果不理想的问题。
(2)本发明的微米级生物材料的石蜡切片方法，采用本发明的微米级生物材料的固定方法固定材料，克服了以往的微米级生物材料切片时材料易变形，切片不连续，或存在空洞，导致无法切片或切片不完整的缺陷，切片厚度可达5um。
(3)本发明的方法操作简单，不需要专门设备，试剂易得，便于推广应用。
附图说明
图1实施例1中所采用的口径为100-150um的玻璃毛细血管的制备；其中A为口径1mm的原装毛细管；B为在酒精灯上拉细；C为制备好的备用的口径为100-150um的毛细管。
图2采用微旋移液器移取小鼠胚胎及小鼠胚胎的固定；其中A为微旋移液器装配拉细的毛细管；B为在显微镜下向Bouin液中注入小鼠胚胎与血清混合物；C为胚胎被包裹在黄色沉淀物中。
图3固定包埋前的2-细胞、4-细胞期小鼠胚胎。
图4未进行脱蜡处理的胚胎石蜡切片(5μm)；其中A为2-细胞胚胎；B为4-细胞胚胎。
图5HE染色后的小鼠植入前胚胎切片；A为1个4-细胞胚胎，显示2个卵裂球的细胞核；B为3个囊胚，显示明显的囊胚腔、内细胞团和滋养层细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
以下实施例中，以小鼠植入前胚胎为例，具体阐述本发明的微米级生物材料石蜡切片方法，其中所需的仪器与试剂如下：
试剂：Bouin固定液，胎牛血清，石蜡，无水乙醇，二甲苯。
Bouin固定液配置：苦味酸饱和液75ml：甲醛溶液25ml：冰醋酸5ml。苦味酸饱和液配方为将1.5g苦味酸固体溶解在100ml蒸馏水中，65℃水浴使其充分溶解。使用前40℃温浴Bouin固定液。
仪器：酒精灯，载玻片，口径1mm玻璃毛细管(江苏海门市耀华玻璃仪器厂，20ul定量采血管)，微旋移液器(HAMILTON，SYRINGE 1ML 0010PC，VCAT#：84001)。实验前先用酒精灯将口径1mm玻璃毛细管适当拉细，使其口径为100-150μm，长度约为5cm，如图1所示，并连接微旋移液器(如图2-A所示)，便于微米级生物材料的移取。
实施例1小鼠植入前胚胎的石蜡切片
从小鼠的输卵管或者子宫腔内冲洗出还未脱去透明带的胚胎，其直径为30-50um，用1×PBS洗涤，尽量除去组织碎片、红细胞等杂质，得待切片组织，备用，固定包埋前的2-细胞、4-细胞期小鼠胚胎如图3所示。
然后按照如下步骤制备石蜡切片：
(1)取两张载玻片分别滴加两滴胎牛血清与一滴Bouin固定液，用连接有口径为100-150um玻璃毛细管的微旋移液器吸取待切片组织，移入其中一滴胎牛血清中，轻轻吹打搅拌后，再吸出，移入至第二滴血清中，使待切片组织悬浮于胎牛血清中，得小鼠胚胎与血清混合物，便于下续操作；
(2)微旋移液器吸取含有一个或多个小鼠胚胎的所述小鼠胚胎与血清混合物(注意在胚胎位置上、下端各保留0.5-1.0mm胎牛血清，即保持小鼠胚胎在胎牛血清中呈悬浮状态)，将微旋移液器中的胚胎缓慢注射入Bouin液滴中，血清与Bouin固定液接触后产生黄色絮状沉淀物，缓慢均匀推出移液器内的血清与胚胎，直至推完，此时肉眼能观察到胚胎包裹在絮状沉淀物中，即得到包裹小鼠胚胎的沉淀物，如图2所示。在解剖显微镜下观察各个胚胎的包裹位置，用宽头镊子剔除多余的沉淀物，将包裹小鼠胚胎的部分轻轻平推聚拢，使其凝结成直径为1-2mm的块状沉淀物，这样沉淀物更加紧密，利于后续的脱水、浸蜡及包埋等的操作；将该块状沉淀物自然晾干10min，注意保持块状沉淀物湿润，避免完全干燥；
(3)将步骤(2)所得的块状沉淀物依次经过50％乙醇水溶液处理10min、70％乙醇水溶液处理10min、90％的乙醇水溶液处理10min、无水乙醇处理30min、二甲苯与乙醇的混合液处理30min、二甲苯处理10min及二甲苯与石蜡的混合液处理3h，得预处理物；所述二甲苯与乙醇的混合液中二甲苯与乙醇的体积比为1:1；所述二甲苯与石蜡的混合液中二甲苯与石蜡的体积为1:1；
(4)将步骤(3)所得的预处理物进行常规石蜡包埋和切片，切片厚度5μm。
检测石蜡切片结果，未进行脱蜡处理的胚胎石蜡切片(5μm)如图4所示，图4-A为2-细胞胚胎期，4-B为4-细胞胚胎期。将上述所得的小鼠植入前胚胎切片经HE染色，其结果如图5所示，图5-A为1个4-细胞胚胎，显示2个卵裂球的细胞核；图5-B为3个囊胚，并且显示明显的囊胚腔、内细胞团和滋养层细胞。胚胎石蜡切片经过苏木精-伊红(HE)染色后，可以清楚地观察到每个卵裂球或细胞的细胞核和细胞质，可以用于细胞结构的直接观察或者借助于免疫组织化学方法观察特定蛋白分子在亚细胞结构中的表达。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.微米级生物材料的固定方法，其特征在于，将微米级生物材料悬浮于血清中，得微米级生物材料与血清混合物，再将所得的微米级生物材料与血清混合物缓慢注入Bouin固定液中，得到包裹微米级生物材料的沉淀物；所述微米级生物材料是指直径为30-50μm的小鼠植入前胚胎。
2.根据权利要求1所述的微米级生物材料的固定方法，其特征在于，所述Bouin固定液为苦味酸饱和液、甲醛和冰醋酸的混合液，所述苦味酸饱和液、甲醛和冰醋酸的体积比为75：25：5；所述苦味酸饱和液浓度为0.015g/ml。
3.微米级生物材料石蜡切片方法，其特征在于，包括如下进行的步骤：
(1)将微米级生物材料悬浮于血清中，得微米级生物材料与血清混合物，再将所得的微米级生物材料与血清混合物缓慢注入Bouin固定液中，得到包裹微米级生物材料的沉淀物，所述微米级生物材料是指直径为30-50μm的小鼠植入前胚胎；
(2)将步骤(1)所得的沉淀物依次经过50％乙醇水溶液处理、70％乙醇水溶液处理、90％的乙醇水溶液处理、无水乙醇处理、二甲苯与乙醇的混合液处理、二甲苯处理及二甲苯与石蜡的混合液处理，得预处理物；所述二甲苯与乙醇的混合液中二甲苯与乙醇的体积比为1:1；所述二甲苯与石蜡的混合液中二甲苯与石蜡的体积为1:1；
(3)将步骤(2)所得的预处理物进行常规石蜡包埋和切片。
4.根据权利要求3所述的微米级生物材料石蜡切片方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述包裹微米级生物材料的沉淀物为凝结成直径为1-2mm的块状沉淀物。
5.根据权利要求3所述的微米级生物材料石蜡切片方法，其特征在于，所述步骤(2)中，50％乙醇水溶液处理8-15min，70％乙醇水溶液处理8-15min，90％的乙醇水溶液处理8-15min，无水乙醇处理25-35min，二甲苯与乙醇的混合液处理25-35min，二甲苯处理8-15min，二甲苯与石蜡的混合液处理2.5-3.5h。
6.根据权利要求5所述的微米级生物材料石蜡切片方法，其特征在于，所述步骤(2)中，50％乙醇水溶液处理10min，70％乙醇水溶液处理10min，90％的乙醇水溶液处理10min，无水乙醇处理30min，二甲苯与乙醇的混合液处理30min，二甲苯处理10min，二甲苯与石蜡的混合液处理3h。
7.小鼠植入前胚胎的石蜡切片方法，其特征在于，包括如下进行的步骤：
(1)取小鼠植入前胚胎，用PBS缓冲液洗涤，除去组织碎片及红细胞杂质，得待切片组织；
(2)将步骤(1)所得的待切片组织分散并悬浮于血清中，得小鼠胚胎与血清混合物，吸取含有一个或多个小鼠胚胎的所述混合物缓慢注入Bouin固定液中，得到包裹小鼠胚胎的沉淀物；
(3)将步骤(2)所得的沉淀物依次经过50％乙醇水溶液处理8-15min、70％乙醇水溶液处理8-15min、90％的乙醇水溶液处理8-15min、无水乙醇处理25-35min、二甲苯与乙醇的混合液处理25-35min、二甲苯处理8-15min及二甲苯与石蜡的混合液处理2.5-3.5h，得预处理物；所述二甲苯与乙醇的混合液中二甲苯与乙醇的体积比为1:1；所述二甲苯与石蜡的混合液中二甲苯与石蜡的体积为1:1；
(4)将步骤(3)所得的预处理物进行常规石蜡包埋和切片。
8.根据权利要求7所述的小鼠植入前胚胎的石蜡切片方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述血清为胎牛血清。
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