CN117658485B - 自清洁疏油涂层修饰的玻璃化冷冻载杆的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于人类胚胎冻存技术领域，具体涉及自清洁疏油涂层修饰的玻璃化冷冻载杆的制备及其应用。本发明从表界面分子设计和制备出发，将亲水性多巴胺与疏油性氟硅烷先后生长接枝于玻璃化冷冻载杆，提供一种适配玻璃化冷冻载杆的自清洁疏油涂层的制备方法。用该发明制得的玻璃化冷冻载杆具有极佳的疏组织油效果，同时展现出对玻璃化冷冻液和组织油显著的粘附性差异，其固有的力学性质及光学性质均未发生明显变化，完全符合人类胚胎在保存和转移过程中的安全性需求。综上所述，本发明制备出了生物安全性较高的玻璃化冷冻载杆，这为人类辅助生殖技术提供了有效、新颖的技术方案。
Description
技术领域
本发明属于人类胚胎冻存技术领域，具体涉及自清洁疏油涂层修饰的玻璃化冷冻载杆的制备方法及其在人类胚胎冷冻保存过程中的应用。
背景技术
胚胎冷冻保存技术是胚胎移植过程中的重要步骤。该技术可以使胚胎在-196 ℃的液氮环境中长期稳定保存，同时确保复苏后的胚胎保持正常的代谢能力。胚胎冷冻技术通常包括慢速冷冻技术，快速冷冻技术和玻璃化冷冻技术。目前，玻璃化冷冻技术广泛应用于生产实践。该技术通过使用高浓度的冷冻剂，使胚胎内的水分被快速置换。在降温保存过程中，冷冻保护液会形成无定形的玻璃态，有效避免了冰晶的形成，减少了冰晶对于胚胎细胞的伤害。
整个玻璃化冷冻和复苏的过程包括：高浓度冷却保护剂平衡、冷冻载杆承载、液氮瞬时玻璃化冷冻、解冻液处理。其中，冷冻载杆对胚胎的承载和冻存起到关键的主导作用。增强冷冻载杆对玻璃化冷冻液的承载能力将对胚胎的成功保存产生有利的效果。在实际的玻璃化冷冻复苏过程中，承载了胚胎的玻璃化冷冻载杆需要先经过组织油再浸入解冻液。然而，现有的商用玻璃化冷冻载杆均较易黏附组织油，组织油在玻璃化冷冻载杆及胚胎表面的附着通常会导致胚胎漂浮至液面表层，进而致使由于操作失误而导致的样本丢失发生的几率大幅增加。因此，设计并开发出一种具有强冷冻液承载能力，同时疏油滑油的玻璃化冷冻载杆具有重要的意义。
本发明在玻璃化冷冻载杆上先后接枝金属离子多巴胺及三乙氧基-1H,2H,3H,4H-十三氟代正辛基硅烷，利用金属离子多巴胺的亲水性和三乙氧基-1H,2H,3H,4H-十三氟代正辛基硅烷的疏油性，结合二者在纳米尺度上产生的构效关系，使玻璃化冷冻载杆上生长一层纳米级的自清洁疏油涂层，有力实现了玻璃化冷冻载杆极佳的保水疏油效果。本发明修饰得到的玻璃化冷冻载杆表现出持久的承载能力，可有效防止冷冻载杆表面组织油的附着。综上所述，通过自清洁疏油涂层修饰的玻璃化冷冻载杆的保水疏油特性能满足生物工程和医疗领域的诸多需求，为人类胚胎冷冻保存技术发展提供巨大助力。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明目的是旨在提供一种自清洁疏油涂层修饰的玻璃化冷冻载杆的制备方法及其应用。用该发明制得的玻璃化冷冻载杆具有极佳的疏组织油效果，同时展现出对玻璃化冷冻液和组织油显著的粘附性差异，其固有的力学性质及光学性质均未发生明显变化，完全符合人类胚胎在保存和转移过程中的安全性需求。本发明采用的技术方案包括以下步骤：
自清洁疏油涂层修饰的玻璃化冷冻载杆的制备方法：
步骤1：常温下将三羟甲基氨基甲烷加入超纯水（Milli-Q）中磁力搅拌，配置缓冲溶液；
将二水合柠檬酸钠加入缓冲溶液中，磁力搅拌至二水合柠檬酸钠充分溶解，随后加入多巴胺和二水氯化铜，磁力搅拌后得到深绿色的混合溶液；
将等离子体清洗的玻璃化冷冻载杆一侧没入至混合溶液中，在室温条件下浸泡修饰，采用超纯水（Milli-Q）冲洗浸泡修饰后的载杆，用N2吹干，得到多巴胺簇分子刷修饰过的玻璃冷冻化载杆，干燥备用。
步骤2：取出干燥后的载杆，采用等离子体对其基底200~300 W轰击30~200 s，滴加三乙氧基-1H,2H,3H,4H-十三氟代正辛基硅烷于培养皿中，将其和轰击后的玻璃冷冻化载杆放入真空干燥器中抽取真空并静置18~30 h，最终得到自清洁疏油涂层即金属离子多巴胺-氟硅烷修饰的玻璃化冷冻载杆。
所述的步骤1中，按摩尔比，二水合柠檬酸钠:三羟甲基氨基甲烷=1:10~1:20，二水氯化铜:多巴胺=1:2~1:5；
所述的步骤1中，超纯水（Milli-Q）的体积为80~120 mL；
所述的步骤1中，磁力搅拌时间为5~20 min；
所述的步骤1中，浸泡修饰时间为5~30 h；
所述的步骤2中，三乙氧基-1H,2H,3H,4H-十三氟代正辛基硅烷的滴加量为40~60μL；
所述的步骤2中，油泵真空抽取时间为5~15 min；
自清洁疏油涂层修饰的玻璃化冷冻载杆应用：
本发明的自清洁疏油涂层修饰的玻璃化冷冻载杆用于人类胚胎冷冻保存技术，能提高玻璃化冷冻液的承载力，同时抑制组织油在表面的粘附。
本发明的有益效果：
1. 在修饰前，玻璃冷冻化载杆保水能力差，具有亲油性，容易被生物组织油污染，但利用金属离子多巴胺的亲水性和三乙氧基-1H,2H,3H,4H-十三氟代正辛基硅烷的疏油性，结合二者在纳米尺度上产生的构效关系，对玻璃化冷冻载杆进行修饰，有力实现了玻璃化冷冻载杆极佳的保水疏油效果。
2. 对玻璃化冷冻载杆进行修饰，使其外壁生长一层自清洁疏油涂层后，将其插入至覆盖组织油的解冻液中，可有效防止冷冻载杆表面组织油的附着，表现出对玻璃化冷冻液和组织油显著的粘附性差异。
3. 在人类辅助生殖实验室选取20个临床废弃囊胚样品，使用修饰后的玻璃化冷冻载杆解冻后，实现了100%的复苏率，说明自清洁疏油涂层即金属离子多巴胺/氟硅烷表面修饰的玻璃化冷冻载杆具有优异的囊胚承载效果，与原始载杆相比，可持久亲和冷冻液，有效降低样品在冻存过程中的丢失率。
4. 修饰后的玻璃化冷冻载杆经历共浸泡，化学气相沉积等修饰生长过程，依旧保持本身光学性能。
附图说明
图1为实施例1中玻璃化冷冻液1 min内的承载情况。
图2为对照组1中玻璃化冷冻液1 min内的承载情况。
图3为实施例1与对照组1的紫外-可见吸收光谱。
图4为实施例1在模拟冷冻复苏过程中表面粘附组织油的光学图片。
图5为对照组1在模拟冷冻复苏过程中表面粘附组织油的光学图片。
图6为实施例1解冻复苏后囊胚的状态图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。以下实施例中，采用的金属阳离子均为Cu2+，除非特殊说明，其采用的原料和设备均为市场购买。
下述实施例仅为说明本发明的技术方案，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明日的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围围之内。
一种自清洁疏油涂层修饰的玻璃化冷冻载杆的制备实施例如下：
实施例1
使用等离子体清洗机首先清洗玻璃化冷冻载杆，将清洗后的载杆一侧没入至金属离子多巴胺溶液中5 h，溶液包含0.1 mol的三羟甲基氨基甲烷，10 mmol的二水合柠檬酸铵，3 mmol的多巴胺，1 mmol的二水氯化铜，100 mL的超纯水（在每个时间条件下均采用3组平行样）；
将金属离子多巴胺修饰后的载杆进行二次等离子体处理，轰击其基底，功率为300W，时间为200 s，在培养皿中滴入50 μL的三乙氧基-1H,2H,3H,4H-十三氟代正辛基硅烷，与轰击后的玻璃化冷冻载杆同放入真空干燥器，采用油泵抽真空10 min，真空干燥器在室温条件下静置24h，从而得到兼具保水疏油特性的玻璃化冷冻载杆，将修饰后的玻璃化冷冻载杆作为实验组，未修饰的商用玻璃化冷冻载杆作为对照组，对实验组和对照组1对玻璃冷冻液承载情况和光透过能力进行检测。
实施例2
使用等离子体清洗机首先清洗玻璃化冷冻载杆，将清洗后的载杆一侧没入至金属离子多巴胺溶液中10h，溶液包含0.1 mol的三羟甲基氨基甲烷，10 mmol的二水合柠檬酸铵，3 mmol的多巴胺，1 mmol的二水氯化铜，100 mL的超纯水（在每个时间条件下均采用3组平行样）；
将金属离子多巴胺修饰后的载杆进行二次等离子体处理，轰击其基底，功率为300W，时间为200 s，在培养皿中滴入50 μL的三乙氧基-1H,2H,3H,4H-十三氟代正辛基硅烷，与轰击后的玻璃化冷冻载杆同放入真空干燥器，采用油泵抽真空10 min，真空干燥器在室温条件下静置24h，从而得到兼具保水疏油特性的玻璃化冷冻载杆，将修饰后的玻璃化冷冻载杆作为实验组，未修饰的商用玻璃化冷冻载杆作为对照组，对实验组和对照组对玻璃冷冻液承载情况和光透过能力进行检测。
实施例3
使用等离子体清洗机首先清洗玻璃化冷冻载杆，将清洗后的载杆一侧没入至金属离子多巴胺溶液中15 h，溶液包含0.1 mol的三羟甲基氨基甲烷，10 mmol的二水合柠檬酸铵，3 mmol的多巴胺，1 mmol的二水氯化铜，100 mL的超纯水（在每个时间条件下均采用3组平行样）；
将金属离子多巴胺修饰后的载杆进行二次等离子体处理，轰击其基底，功率为300W，时间为200 s，在培养皿中滴入50 μL的三乙氧基-1H,2H,3H,4H-十三氟代正辛基硅烷，与轰击后的玻璃化冷冻载杆同放入真空干燥器，采用油泵抽真空10 min，真空干燥器在室温条件下静置24h，从而得到兼具保水疏油特性的玻璃化冷冻载杆，将修饰后的玻璃化冷冻载杆作为实验组，未修饰的商用玻璃化冷冻载杆作为对照组，对实验组和对照组对玻璃冷冻液承载情况和光透过能力进行检测。
实施例4
使用等离子体清洗机首先清洗玻璃化冷冻载杆，将清洗后的载杆一侧没入至金属离子多巴胺溶液中20 h，溶液包含0.1 mol的三羟甲基氨基甲烷，10 mmol的二水合柠檬酸铵，3 mmol的多巴胺，1 mmol的二水氯化铜，100 mL的超纯水（在每个时间条件下均采用3组平行样）；
将金属离子多巴胺修饰后的载杆进行二次等离子体处理，轰击其基底，功率为300W，时间为200 s，在培养皿中滴入50 μL的三乙氧基-1H,2H,3H,4H-十三氟代正辛基硅烷，与轰击后的玻璃化冷冻载杆同放入真空干燥器，采用油泵抽真空10 min，真空干燥器在室温条件下静置24h，从而得到兼具保水疏油特性的玻璃化冷冻载杆，将修饰后的玻璃化冷冻载杆作为实验组，未修饰的商用玻璃化冷冻载杆作为对照组，对实验组和对照组对玻璃冷冻液承载情况和光透过能力进行检测。
实施例5
使用等离子体清洗机首先清洗玻璃化冷冻载杆，将清洗后的载杆一侧没入至金属离子多巴胺溶液中25 h，溶液包含0.1 mol的三羟甲基氨基甲烷，10 mmol的二水合柠檬酸铵，3 mmol的多巴胺，1 mmol的二水氯化铜，100 mL的超纯水（在每个时间条件下均采用3组平行样）；
将金属离子多巴胺修饰后的载杆进行二次等离子体处理，轰击其基底，功率为300W，时间为200 s，在培养皿中滴入50 μL的三乙氧基-1H,2H,3H,4H-十三氟代正辛基硅烷，与轰击后的玻璃化冷冻载杆同放入真空干燥器，采用油泵抽真空10 min，真空干燥器在室温条件下静置24h，从而得到兼具保水疏油特性的玻璃化冷冻载杆，将修饰后的玻璃化冷冻载杆作为实验组，未修饰的商用玻璃化冷冻载杆作为对照组，对实验组和对照组对玻璃冷冻液承载情况和光透过能力进行检测。
实施例6
使用等离子体清洗机首先清洗玻璃化冷冻载杆，将清洗后的载杆一侧没入至金属离子多巴胺溶液中30 h，溶液包含0.1 mol的三羟甲基氨基甲烷，10 mmol的二水合柠檬酸铵，3 mmol的多巴胺，1 mmol的二水氯化铜，100 mL的超纯水（在每个时间条件下均采用3组平行样）；
将金属离子多巴胺修饰后的载杆进行二次等离子体处理，轰击其基底，功率为300W，时间为200 s，在培养皿中滴入50 μL的三乙氧基-1H,2H,3H,4H-十三氟代正辛基硅烷，与轰击后的玻璃化冷冻载杆同放入真空干燥器，采用油泵抽真空10 min，真空干燥器在室温条件下静置24h，从而得到兼具保水疏油特性的玻璃化冷冻载杆，将修饰后的玻璃化冷冻载杆作为实验组，未修饰的商用玻璃化冷冻载杆作为对照组，对实验组和对照组对玻璃冷冻液承载情况和光透过能力进行检测。
实施例7
使用等离子体清洗机首先清洗玻璃化冷冻载杆，将清洗后的载杆一侧没入至金属离子多巴胺溶液中5 h，溶液包含0.1 mol的三羟甲基氨基甲烷，10 mmol的二水合柠檬酸铵，3 mmol的多巴胺，1 mmol的二水氯化铜，100 mL的超纯水（在每个时间条件下均采用3组平行样）；
将金属离子多巴胺修饰后的载杆进行二次等离子体处理，轰击其基底，功率为300W，时间为200 s，在培养皿中滴入50 μL的三乙氧基-1H,2H,3H,4H-十三氟代正辛基硅烷，与轰击后的玻璃化冷冻载杆同放入真空干燥器，采用油泵抽真空10 min，真空干燥器在室温条件下静置24h，从而得到兼具保水疏油特性的玻璃化冷冻载杆，将修饰后的玻璃化冷冻载杆作为实验组，未修饰的商用玻璃化冷冻载杆作为对照组，对实验组和对照组对玻璃冷冻液承载情况和光透过能力进行检测。
实施例8
使用等离子体清洗机首先清洗玻璃化冷冻载杆，将清洗后的载杆一侧没入至金属离子多巴胺溶液中5 h，溶液包含0.1 mol的三羟甲基氨基甲烷，10 mmol的二水合柠檬酸铵，3 mmol的多巴胺，1 mmol的二水氯化铜，100 mL的超纯水（在每个时间条件下均采用3组平行样）；
将金属离子多巴胺修饰后的载杆进行二次等离子体处理，轰击其基底，功率为300W，时间为200 s，在培养皿中滴入50 μL的三乙氧基-1H,2H,3H,4H-十三氟代正辛基硅烷，与轰击后的玻璃化冷冻载杆同放入真空干燥器，采用油泵抽真空10 min，真空干燥器在室温条件下静置24h，从而得到兼具保水疏油特性的玻璃化冷冻载杆，将修饰后的玻璃化冷冻载杆作为实验组，未修饰的商用玻璃化冷冻载杆作为对照组，对实验组和对照组对玻璃冷冻液承载情况和光透过能力进行检测。
实验结果：由图1可见，实施例1对玻璃化冷冻液展现出持久的承载，良好的保水性有力确保了生物组织样本在冻存过程中的安全性及保存率。图2表明对照组对玻璃化冷冻液不具备良好的承载功能，这充分体现出自清洁疏油涂层修饰后的玻璃冷冻化载杆具有更加优异的生物组织样本承载效果。使用紫外-可见分光光度计测定修饰前后的冷冻载杆的光透过能力。图3表明，相较于原始载杆，自清洁疏油涂层修饰后的玻璃冷冻化载杆在可见光波段（390~780 nm）的吸光度仅小幅度增加，这表明该工艺对玻璃化冷冻载杆的光学透过率未造成显著影响。
验证例
对上述实施例1制备的自清洁疏油涂层修饰的玻璃化冷冻载杆和未修饰的玻璃化冷冻载杆的防油污效果进行验证，具体方法如下：
1.解冻复苏模拟实验
模拟人类胚胎解冻复苏过程，在培养皿中心滴加解冻液，在解冻液周围滴加组织油覆盖解冻液，将未修饰和修饰后的冷冻载杆浸入解冻液中，静置10 min，通过光学显微镜观察表面组织油的附着情况。图4表明实施例1中自清洁疏油涂层修饰后的玻璃冷冻化载杆表面不存在任何油珠。反观对照组中原始冷冻载杆表面粘附有大量的组织油油珠（图5）。由此表明，自清洁疏油涂层修饰后的玻璃冷冻化载杆具备良好的保水疏油特性，这确保了胚胎在转移过程中不被油类污染，进而大幅提高了胚胎在经历冷冻解冻过程后的复苏率。
2.自清洁疏油涂层修饰的玻璃冷冻化载杆生物安全性测试
利用人类辅助生殖实验室临床废弃囊胚进行自清洁疏油涂层修饰的玻璃冷冻化载杆的生物安全性测试，例数为20个；
利用自清洁疏油涂层修饰后的玻璃冷冻化载杆进行囊胚冷冻。制备含有平衡液的操作皿，并覆盖组织油。囊胚经人工皱缩后，置于平衡液中12-15min（室温），囊胚转移至冷冻液中45-60s后（室温），以点样的方式将胚胎置于载杆前端，迅速将载杆浸入液氮中，置于冷冻罐内储存；
利用自清洁疏油涂层修饰的玻璃冷冻化载杆进行囊胚解冻。制备含有解冻液、稀释液、基础液1和基础液2的操作皿，并覆盖组织油。将载体从液氮罐中取出，迅速插入解冻液中浸润约60s（37℃），囊胚从载体上脱落。依次将囊胚转移至稀释液中静置3min（室温），转移至基础液1中静置5min（室温），转移至基础液2中静置5min（室温），随后将囊胚转移至囊胚培养液中。
20例囊胚样品在经历冷冻解冻过程后，均成功复苏，复苏率为100%。复苏囊胚的形貌见图6所示。
自清洁疏油涂层修饰的玻璃化冷冻载杆制备方法成本低廉，操作简便，可通过改变浸泡金属离子多巴胺的时间实现对载杆表面浸润性的有效调控，保证其在玻璃化冷冻解冻过程中保持高效的保水性及疏油性，进而优化人类卵母细胞和胚胎的冷冻复苏率。综上所述，该制备方法为人类卵母细胞和胚胎冷冻保存的精深发展提供了有力的技术保障。
Claims (7)
1.一种自清洁疏油涂层修饰的玻璃化冷冻载杆的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：常温下将三羟甲基氨基甲烷加入超纯水中磁力搅拌，配置缓冲溶液，将二水合柠檬酸钠加入缓冲溶液中，磁力搅拌至二水合柠檬酸钠充分溶解，随后加入多巴胺和二水氯化铜，磁力搅拌后得到深绿色的混合溶液，将等离子体清洗的载杆一侧没入至混合溶液中，在室温条件下浸泡修饰，采用超纯水冲洗浸泡修饰后的载杆，用N2吹干，得到多巴胺簇分子刷修饰过的载杆，干燥备用；
步骤2：取出干燥后的载杆，采用等离子体对其基底轰击，滴加三乙氧基-1H,2H,3H,4H-十三氟代正辛基硅烷于培养皿中，将其和轰击后的载杆放入真空干燥器中静置，最终得到自清洁疏油涂层即金属离子多巴胺-氟硅烷修饰的玻璃化冷冻载杆。
2.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻载杆的制备方法，其特征在于，按摩尔比，二水合柠檬酸钠:三羟甲基氨基甲烷 =1:10~1:20，二水氯化铜:多巴胺 =1:2~1:5。
3.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻载杆的制备方法，其特征在于，浸泡修饰时间为5~30h。
4. 根据权利要求1所述的玻璃化冷冻载杆的制备方法，其特征在于，等离子体对所述的玻璃化冷冻载杆基底在200~300 W的功率下轰击30~200s。
5.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻载杆的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中，油泵抽取真空。
6.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻载杆的制备方法，其特征在于，真空干燥器中静置18~30h。
7.权利要求1-6任意一项所述的自清洁疏油涂层修饰的玻璃化冷冻载杆的制备方法的应用，其特征在于，自清洁疏油涂层修饰的玻璃化冷冻载杆用于人类胚胎冷冻保存技术，能提高玻璃化冷冻液的承载力，同时抑制组织油在表面的粘附。
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