KR20040008131A

KR20040008131A - 포유류 동물의 장기 보존방법

Info

Publication number: KR20040008131A
Application number: KR10-2003-7011572A
Authority: KR
Inventors: 세키구니히로
Original assignee: 가부시키가이샤 바이오뱅크
Priority date: 2001-03-06
Filing date: 2002-03-06
Publication date: 2004-01-28
Also published as: EP1380207A4; EP1380207A1; CN1505474A; RU2003129508A; US20030022148A1; JPWO2002069702A1; US6475716B1; WO2002069702A1

Abstract

본 발명은, 생리학상 상식적인 수분량을 함유하는 장기로부터 그 장기 내의 수분을 맥관계로부터 도출함으로써 탈수 전의 장기 총 중량에 대한 중량비로 약 10% 이상, 바람직하게는 25% 이상의 수분을 제거하는 탈수공정과, 그 장기를 불활성 매체에 담궈 냉장온도로 유지하는 공정을 포함하는 포유류 동물의 장기의 보존방법에 관한 것이다.

Description

포유류 동물의 장기 보존방법{METHOD OF PRESERVING MAMMALIAN ORGAN}

인간의 폐장, 심장, 간장, 신장, 췌장 등의 장기의 임상 이식치료는, 이미 실용화되고, 일상화되어 있으나, 해마다 증가하는 이식 대기환자에 대한 도너 부족의 문제가 심각화되어, 수술까지의 대기시간이 연장되고 있다. 또, 장기 이식의 도너가 출현하여도, 혈액과 같이 장기간의 보존이나 공급체제의 정비가 충분히 이루어져 있지 않은 것이 현재의 상태이다.

특히 이식 장기에 있어서는, 저온보존이 주류이며, 장기 이식에 유효한 보존시간은, 약 4 내지 24시간이 보존한계이다(Cooper JD, Patterson GA, Tru1ock EP et all; J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 107, 460-471, 1994).

실제로, UWS액(University of Winsconsin Solution액)을 사용한 래트, 토끼, 비비의 적출심장의 저온보존 및 소생에 있어서도, 6 내지 18시간이 한도이다 (Makowka I, Zerbe TR, Champman F, et all; Transplant Proc. 21, 1350, 1989 and Yen T, Hanan SA, Johson DE, et all; Ann. Thorac. Surg. 49, 932, 1990).

또, 이 UWS액과 퍼플루오로카본매체를 조합하여 사용하여, 래트의 심장을 보존 하고, 이식에 성공한 것은, 24시간(5마리 전부) 내지 48시간(5마리 중 4마리)이다 (Kuroda Y, Kawamura T, Tanioka T, et all; Transplantation, 59, 699-701, 1995).

그 이유는, 적출심장이 4℃의 저온이나 허혈상해에 노출되면 세포막이 손상되기 때문에 조직세포가 소생할 수 없는 것에 의한다(Pegg DE; Organ presevation. Surg. Clin. Notth Am.66, 617, 1986: 0zMC, Pinsky DJ, Koga S, et all; Circulation 88, 291-297, 1993: and Heffner JE, Pepine JE; Rev. Pespir. Dis. 140, 531-554, 1989).

포유동물의 생체조직의 장기간에 걸친 보존·소생의 기술은, 혈액, 정자, 난자와 같은 단세포에서만 개발이 진행되고 있다. 이것은 세포의 모임인 조직 또는 몇 개의 조직으로 이루어지는 장기의 저온보존에 관해서도 실용화가 진행되고 있으나, 어떻든간에 최대 24시간 이내에 이식을 행하지 않으면 안되는 것이 현재의 상태이다(kalayoglu M, Sollinger HW, Strarra RJ, et all; Lancet, 2, 617, 1988).

이와 관련하여, 트레할로스(C₁₂H₂₂O₁₁)는 자연계에 널리 분포하는 비환원성의 2당류로서, 여러가지 스트레스하에서 세포막 구조의 안정화 내지 보호작용을 가지는 것이 보고되어 있다(Crowe JH, Crowe LM, Chapman D; Science 233, 701-703, 1984 and Wiemken A; Antinei Van Leeunwenhoek. 58, 209-217, 1990). 트레할로스는 심장이 섭씨 4도의 저온이나 허혈장해에 노출되면 세포막에 대하여 보호작용을 나타내는 것이 보고되어 있다(Stringham JC, Southhard JH, Hegge J, et all;Transplantation, 58, 287-294, 1992 and Hirata T, Fukuse T, Liu CJ, et all; Surgery, 115, 102-107, 1994). 또, 곰벌레의 고정수압실험에 있어서, 무수상태가 되면 트레할로스가 1O배나 증대되는 것이 보고되어 있다(Crowe JH, Crowe LM, Chapman D; Science 233, 701-703, 1984 and Crowe JH, Crowe LM, Chapman D, Aurell Wistorm C; Biochemical Journal, 242, 1-10, 1987). 이 곰벌레는 약 40,000개의 세포로 구성되고, 신경세포도 가지고 있는 다세포 생물이다.

본 발명자는, 건조상태의 곰벌레 등이 퍼플루오로카본액 속에서는 극한의 600Mpa의 고수압환경이라는 부하에도 견디어서, 생명력을 유지하고 있는 것을 발견하였다(Kunihiro Seki et al; Nature Vol. 395, No. 6705, pp.853-854, 29 0ct. 1998, 및 일본국 특개평11-289917호; 이 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 도입되었다). 곰벌레의 건조상태는 탄상태(가사상태) 또는 통상태(樽狀態)에 의하여 형성된다. 그 생리적 메카니즘은 충분히 해명되지 있지는 않으나, 곰벌레는 체내의 수분량이 극단적으로 감소되어, 탈수상태로 되어 있다.

상기한 종래에 있어서의 장기의 냉장보존은, 장기의 온도를 내림으로써 그 대사기능을 저하시켜 그 생존상태를 유지하는 것이다. 온도저하에 의하여 대사기능은 저하되나, 극성매체인 수분 속에 풍부한 이온이 존재하고, 이들이 세포의 자기붕괴, 세포사, 괴사(Necrosis)를 경시적으로 야기하는 원인이 된다.

따라서, 냉장보존은 보존시간을 오래 끌수록 심각한 혈전이나 기능장해가 급증한다고 하는 가능성을 불가피하게 가지며, 그 보존기간에는 질적인 한계가 있다.

한편, 일반적으로 동물의 조직세포는 수분이 없으면 생존할 수 없다. 이종조직으로 구성되는 고등 장기이면, 건조상태로부터의 소생은 불가능하다고 용이하게 예상된다.

종래에 있어서 식물이나 각종 세균류를 건조 보존하는 기술은 이미 개발되어 있으나, 고등동물의 기관 그 자체를 건조보존 후에 소생시킨 실험은 예를 볼 수 없다.

본 발명자는, 놀랍게도 일정한 조건하에서 포유류 동물의 적출장기로부터 다량의 수분을 제거하고 그 장기를 불활성 용매 중에 침지시켜 저온에서 보존하였을 때, 곰벌레가 통상태에서 장기간 생명을 유지하고 있을 때와 동일한 가사상태 (apparent death)에 이르는 것을 발견하였다(일본국 특개2000-72601 : 이 출원은 그 참조에 의하여 본 명세서에 도입되었다).

특히 놀랄만한 것은, 포유류 동물의 다세포 또한 다조직의 장기가 극도의 탈수상태로부터 소생하고, 또 소생한 심장의 박동이 확인된 것이다. 그 장기의 각 세포는 산소 소비량이 정상시의 1/1000 이하까지 극단으로 저하되거나, 산소 소비가 실질적으로 정지한 가사상태에 있다고 생각된다.

일본국 특개2000-72601에 개시된 방법에 의하여 보존된 장기는, 소생 후에 살아난 신경이나 줄기세포를 채취할 수 있어, 장기 자체 또는 채취된 조직을 이식의료에 이용할 수 있다. 또, 병리조직학적 연구에 있어서, 괴사한 표본이 아닌 소생 가능한 생체재료를 장기 보존할 수 있는 것은 큰 의미가 있다.

상기 보존방법은, 생체 외에 보존되는 장기의 세포나 조직의 경시적인 자기붕괴를 방지하여 보존일수를 대폭 증가시킬 수 있으나, 그 탈수방법은, 장기에 접촉하는 탈수제에 의거하고 있다. 그 보존방법의 더 한층의 개량을 위하여 보다 뛰어난 탈수방법을 탐구할 필요가 있다.

본 발명은, 포유류 동물의 장기를 생체 외에서 장기간 보존하는 기술에 관한것이다.

도 1은 실시예 3의 실험 8에서 기록된 심전도,

도 2는 실시예 3의 실험 9에서 기록된 심전도,

도 3은 실시예 4의 실험 1에서 기록된 심전도,

도 4는 실시예 4의 실험 2에서 기록된 심전도,

도 5는 실시예 5의 실험에서 기록된 심전도이다.

본 발명은, 장기로부터 수분을 제거하거나 소생 가능한 수분량을 남기는 탈수공정과, 장기를 불활성 매체에 침지시켜 냉장온도로 유지하는 공정을 포함하는 포유류 동물의 심장과 같은 장기의 보존방법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 포유류 동물의 장기의 보존방법은, 생리학상 상식적인 수분량을 함유하는 장기로부터, 그 맥관계를 통하여 상기 장기 내의 수분을 끌어 냄으로써 탈수 전의 장기 총 중량에 대한 중량비로 약 10% 이상 또는 25% 이상의 수분을 제거하거나, 탈수 전의 총 수분량에 대한 중량비로 약 10% 내지 약 20% 이상의 수분을 남기는 탈수공정과, 상기 장기를 불활성 매체에 침지시켜 냉장온도로 유지하는 공정을 포함한다. 상기 장기는, 심장, 간장, 신장, 췌장 및 폐장으로 이루어지는 군으로부터 선택할 수 있다.

본 발명에 의한 포유류 동물의 심장의 보존방법은, 심장에 생리적 염류 용액을 관류시켜 심장내의 혈액을 생리적 염류 용액으로 치환하는 탈혈공정과, 탈혈한 심장으로부터 그 혈관계를 통하여 상기 장기 내의 수분을 끌어 냄으로써 탈수 전의 심장 총 중량에 대한 중량비로 약 10% 내지 약 50%의 수분을 제거하는 탈수공정과, 상기 심장을 불활성 매체에 침지시켜 약 1℃ 내지 약 8℃의 냉장온도로 유지하는 공정을 포함한다. 또 본 발명은 이론적으로는 탈수 전의 심장 총 중량에 대한 중량비로 약 25% 내지 약 60%의 수분을 제거하는 탈수공정도 포함할 수 있다.

상기 맥관계를 이용한 탈수는, 장기 또는 심장의 맥관계에 기체를 보내 주는 것을 포함한다. 예를 들면, 심장의 대동맥에 기체를 관류시키면, 그 기체의 흐름에 의하여 상기 심장의 혈관계로부터 수분이 끌어 내진다. 즉 그 기체의 유압에 의하여 수분이 장기의 밖으로 밀어 내진다. 유압은 일정압이 바람직하다. 또한 상기 탈수공정이 장기에 불활성 매체에 침지시키고 있는 상기 장기에 탈수제를 접촉시키는 것을 더욱 포함할 수도 있다. 특히 기체를 사용한 탈수에서는, 혈액이 관류기체에 닿아 응고하는 문제를 회피하기 위하여, 탈수공정에 앞서, 생리적 염류 용액을 사용하여 장기를 탈혈처리하는 것이 바람직하다. 가장 바람직한 것은, 유압이 일정압인 탈혈관류이다.

맥관계에 보내 주는 기체는, 바람직하게는 공기, O₂-CO₂혼합기체가 사용되나, N₂, He, Ar, Ne, Kr 또는 Xe와 같은 불활성 기체를 사용하여도 좋다. 예를 들면 생리적 염류 용액을 관류시키기 위한 관류장치를 사용하여, 그 생리적 염류 용액 대신에 기체를 보내 줌으로써 가능하다. 맥관계에의 기체 관류에 의하여 장기 내의 체액은 밀어 내지고, 그리고 세포의 하나 하나로부터 모세관을 거쳐 수분이 끌어 내진다.

맥관계에 보내 주는 액체로서는, 장기의 체액보다도 농도가 높은 고장액과 같이 침투압차를 이용하여 세포로부터 수분을 이동시키는 용매가 있다. 또 뒤에서 설명하는 불활성 매체, 또는 알콜류이어도 가능할 것이다.

상기 맥관계의 모세관에 들어가 유압을 발생시켜, 장기조직 전체에 대략 동등하게 도달하고, 그리고, 모세관을 순환(예를 들면 동맥혈관으로부터 정맥혈관으로)하여 맥관계의 다른쪽 끝에 도달할 수 있다. 이 탈수는 장기에 고유의 수분공급경로를 이용하기 때문에, 개개의 조직이나 세포를 표적으로 하여 천천히 균일한 탈수상태를 만들어 낼 수 있다. 포유류 동물의 다세포 또한 다조직의 장기이어도 생체조직에 필요없는 스트레스를 주지 않고 원활하게 고도의 탈수상태로 이행할 수 있다. 따라서 통상은 생체조직에 스트레스가 되는 1Owt% 이상 또는 25wt% 이상의 탈수이어도, 장기는 허혈장해나 생체조직의 손상을 수반하지 않고 매우 안정된 가사상태에 이를 수 있다. 그리고 수분을 되찾았을 때에 기능을 복귀하여, 그 세포나 조직뿐만 아니라 장기 자체의 기능을 소생할 수 있다.

일반적으로 가사상태란 생물학적 가사를 의미하나, 본 발명에서 의도하는 가사란, 고도의 탈수상태에 의하여 외관상의 생명현상은 인정받지 않게 되나, 수분을 되찾았을 때에 다시 생명현상을 인정받을 수 있는 상태를 의미한다. 본 발명에서 말하는 「소생」이란, 그 탈수상태로부터 수분을 되찾았을 때에 조직의 전기생리학인 반응, 또는 기관으로서의 생물학적인 생명활동이 인정되는 현상을 의미한다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 생리학상 상식적인 수분량을 함유하는 장기의 표면에 오일막을 형성하는 공정과, 상기 심장을 기체에 노출시켜 그 심장 내의 수분을 상기 기체 중으로 증발시킴으로써 탈수 전의 심장 총 중량에 대한 중량비로 약 10% 이상의 수분을 제거하는 공정과, 상기 장기를 약 1℃ 내지 약 8℃, 바람직하게는 약 2℃ 내지 약 4℃의 냉장온도로 유지하는 공정을 포함하는 포유류 동물의 심장의 보존방법에 관한 것이다.

또, 본 발명은, 심장에 생리적 염류 용액을 관류시켜 심장 내의 혈액을 생리적 염류 용액으로 치환하는 탈혈공정과, 탈혈한 심장의 표면에 오일막을 형성하는 공정과, 상기 심장을 기체에 노출시켜 상기 심장 중의 수분을 상기 기체 중으로 증발시킴으로써, 탈수 전의 심장 총 중량에 대한 중량비로 약 10% 내지 약 50%의 수분을 제거하는 공정과, 상기 장기를 약 1℃ 내지 약 8℃의 냉장온도로 유지하는 공정을 포함하는 포유류 동물의 심장의 보존방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 의하여 장기의 조직 및 세포로부터 자유수가 제거되면, 생체막 등의 생체구조는 수상 중에서 활성화할 수 있는 물질, 특히 금속이온에 의한 공격을 받기 어렵게 된다. 또 그 생체구조는, 그 주위를 결합수라 불리우는 결정상태의 물로 둘러 싸여 보호되고 있다고 생각된다. 생체조직을 열화시키는 극성 매체가 제거되는 결과, 조직이나 세포는 불가역적인 경시적 붕괴를 피할 수 있어, 장기의 보존상태의 질적인 개선이 도모된다. 또 이 때, 보존액 중의 트레할로스는 생체구조의 안정화에 기여할 수 있다.

본 발명의 방법에 의하여 보존된 심장, 간장, 신장, 췌장 또는 폐장은, 그 맥관계에 체온정도로 따뜻해진 체액 또는 대용 체액, 예를 들면 상기 생리적 염류 용액, 인공혈액 및/또는 혈액을 관류시킴으로써 소생할 수 있다. 소생한 장기는, 그 장기 또는 그 장기로부터 채취한 조직을 인체에 이식할 수 있을 것이다. 또 소생한 장기로부터, 신경조직, 그 밖의 살아난 조직이나 세포를 채취하여 약리시험 등에 사용할 수 있다.

또, 본 발명은 인체에 대한 이종 이식을 목적으로 한 인간을 제외한 포유류동물의 장기에 적용할 수 있고, 그에 의하여 도너부족에 의하여 임상상의 수요증대가 예상되고 있는 동물 장기의 보존기술이 제공된다. 특히 본 발명은, 양식 돼지의 심장, 간장, 췌장 등의 양산할 수 있는 장기의 보존에도 유용하며, 장시간의 수송, 특히 수십시간을 넘는 항공수송에 견딜 수 있는 보존기술을 제공할 것이다.

또, 본 발명과 같이 장기보존을 가능하게 하는 기술은, 장기은행의 설립에 도움이 될 것이다. 예를 들면, 배성 줄기세포와 같이 전능성(全能性)을 가지는 줄기세포를 배양하여 원하는 조직이나 기관을 재생하고, 그것들을 보존하는데 본 발명을 적용하는 것이 가능하다. 질병이 발견되기 전에 예비의 장기를 보존하여 둠으로써 발병 후, 즉시 이식을 받을 수 있을 것이다. 또한 본 발명은 뇌나 그 밖의 신경조직 등의 보존에도 유용할 것이다.

(용어의 정의)

본 발명에서 말하는 「약 1O% 이상의 수분의 제거」 또는 「약 25% 이상의 수분의 제거」란, 맥관계내의 체액 및 개개의 세포 및 세포 사이의 자유수의 제거를 의도하고 있다. 또, 본 발명에서 말하는 「약 10% 내지 약 20% 이상의 수분을 남긴다」란, 생체조직 내에 결합수를 포함하여, 소생에 충분한 양의 수분을 가지는 것을 의도하고 있다. 본 발명에 있어서, 보존 장기의 선도를 좌우하는 것은 주로 자유수의 양이라고 생각되며, 이론상, 보존시간의 장기화를 위해서는 자유수를 가능한 한 제거하는 것이 바람직하다. 또 소생능력을 유지하기 위해서는, 결합수가 유지되는 범위의 수분량을 남기는 것이 바람직하다. 결합수란, 수화상태 또는 결정상태를 관측할 수 있는 물이며, 자유수란 결합수 이외의 물이라 정의할 수 있다.

맥관계는, 해부학상, 혈관계와 림프계로 분류된다. 본 발명에서 말하는 「맥관계」는, 바람직하게는 장기의 개개의 세포에 수분 및 양분을 보급하기 위한 영양 혈관계를 포함한다. 또 심장이면 심방 및 심실에 연결되는 고유의 맥관에 관류장치를 접속하여, 심장의 영양 혈관계에 연결되는 관상동맥 및 관상정맥에 간접적으로 유압을 걸 수 있다. 또한 간장과 같이 영양 혈관계와는 별도로 문맥순환에 관한 기능 혈관계를 가지는 장기에서는, 그와 같은 기능 혈관계를 이용하여도 좋다.

본 발명에 말하는 「생리학상 상식적인 수분량을 함유하는 장기」란, 전형적으로는 생체로부터 적출된 상태의 장기이며, 또 예를 들면 탈혈공정을 포함하는 발명에서는, 탈혈을 위한 관류에 의하여 그 혈액이 생리적 염류 용액으로 치환된 상태의 장기라고 이해할 수 있다.

그와 같은 생리학상 정상적인 수분량을 가지는 장기의 중량을 기준으로 하여, 상기 탈수량을 특정할 수 있다.

본 발명에서 말하는 「생리적 염류 용액」은, 혈액과 동일한 생물학적 활성을 구비한 대용 체액으로서, 대표적으로는 공지의 링거액, 예를 들면 KH(Kreps-Henseleit)액이다. 이 종류의 생리적 염류 용액에는, 탈수상태의 생체구조의 안정을 돕는 다당류를 용해시켜 사용하여도 좋다. 그와 같은 종류의 다당류는 트레할로스가 바람직하다. 또, 다른 생체 구조물질로서는, 말산, 맨이토르, 글리세롤, 글리신베타인, 프롤린, 엑토인 등의 아미노산도, 생리적 염류 용액에 용해시켜 사용할 수 있다.

본 발명에서 말하는 「불활성 매체」는, 물 및 기름에 불용성의 매체로서, 보존온도에서 액상인 플루오로카본액, 특히 퍼플루오로카본액이 바람직하다. 또 그것과 유사한 조건을 만족하면, 액체에 한정되지 않고, 기체, 졸 또는 겔을 사용하여도 좋다. 또 그 밖의 불활성 매체로서, 수은이나 실리콘오일을 사용할 수 있다.

맥관계를 이용한 탈수를 포함하는 발명의 형태

일반적으로 혈액은 기체에 닿거나 저온에 노출되면 굳어져 혈전을 일으키고, 이것은 뒤에서 설명하는 탈수나 소생의 방해가 된다. 따라서 보존대상인 장기, 예를 들면 수술에 의하여 적출된 장기는 세정되어, 탈혈된다. 탈혈을 위한 관류장치로서는 공지의 랑겐도르프의 장치를 사용할 수 있고, 그 탈혈관류의 기술은, 랑겐도르프법(Doring H.J, Dehnert H; Biomesstechnik-Vertag Match Gmb, Germany, 1988)으로서 당업자에게 알려져 있다. 랑겐도르프법에 따라, 장기는 그 혈관계의 대동맥에 관류용 카테테르(또는 카뉴레)가 설치되고, 혈관계 헤트로할로스 -KH(Kreps-Henseleit)혼합액을 보내 주어 장기의 혈액을 생리적 염류 용액으로 치환한다. 이 생리적 염류 용액에는, 미리 산소가 폭기(에어레이션)되어 장기 내는 항상 신선한 대용 체액이 보내진다. 이 관류에 의한 탈혈시에 장기의 온도를 1℃ 내지 8℃까지 내려, 장기의 활동을 정지시킨다. 탈혈에 계속해서 탈수공정에 들어 간다.

탈수공정은, 상기 탈혈에 사용한 랑겐도르프의 장치를 이용함으로써 달성된다. 예를 들면 탈혈이 완료된 장기의 대정맥에, 그 관류장치로부터 생리적 염류 용액 대신에 소정의 유압으로 기체를 보내 준다. 또, 인공의 관류수단은 기체를 대동맥으로부터 일방적으로 보내 주는 수단에 한정되지 않고, 대동맥과 대정맥 사이에 접속된 폐순환계를 포함하는 것은 당업자에게 용이하게 이해된다. 즉, 상기 기체관류는 기체를 보내 주는 방법에 한정되지 않고, 맥관계 내를 흡인하는 방법이어도 좋다.

상기 관류장치에 의하여 맥관계에 유압이 걸리면, 장기 내의 대정맥측으로부터 생리적 염류 용액이 유출하도록 하여 탈수가 진행된다. 바람직하게는 혈관내로 들어간 기체는 개개의 모세혈관을 통하여 대정맥측으로 흐르고, 그리고 혈관 내를 흐르는 기체 중으로 개개의 세포 및 세포 사이의 수분이 그 증기압에 의하여 나간다. 최종적으로는 각 조직 및 세포내의 자유수의 대부분이 혈관계를 통하여 장기의 밖으로 배출된다.

상기 혈관계를 이용한 탈수는, 탈수제를 접촉시키는 처리와 달리, 장기 내에 균일하게 분포하는 모세혈관의 매우 광대한 표면적을 이용한 것으로, 느리지만 비교적 단시간에 조직 및 개개의 세포를 표적으로 탈수할 수 있다. 이 이점은, 상기탈수제와 비교하여 탈수 불균일이 적고, 탈수된 장기의 변색정도도 심각하지 않기 때문에 명확하다. 뒤에서 설명하는 실시예에서 나타내는 바와 같이, 기체관류에 의한 탈수에서는, 실제로 소생율이 매우 높아, 소생상태의 개선을 볼 수 있었다. 또 기체에 의한 탈수는, 외부로부터 제어의 효과가 있는 능동적인 처리로서, 신속하고 신중한 처리가 요구되는 장기에 있어서 스트레스가 적고 또한 효율적인 수단이다.

맥관계로 보내 주는 기체는, 시판하는 병에 채워진 저렴한 압축기체이면 된다. O₂-CO₂혼합기체이면, 5% 미만의 CO₂를 함유하는 것이 바람직하다. 또 뒤에서 설명하는 실시예에서는 건조기체를 사용하나 습기를 함유하는 기체를 사용하여도 좋다. 또한 탈수용 기체로서, 보다 바람직하게는 N₂, He, Ar, Ne, Kr 또는 Xe와 같은 불활성 기체를 사용할 수 있을 것이다. 불활성 기체 중에서도 Xe는 고가이나, 생체조직에 대한 마취작용이 보고되어 있기 때문에, Xe를 본 발명의 탈수에 사용하는 이점은 클 것으로 예상된다. 또, 불활성 기체를 사용하는 것은, 활성산소에 의한 생체조직의 손상을 회피하는 의미도 있다.

상기 기체관류에 의한 탈수에 더하여, 보존시에 탈수제를 장기에 직접 또는 간접적으로 접촉시키는 탈수방법을 보조적으로 병용할 수도 있다.

탈수공정에서 탈수제를 사용하는 경우는, 원하는 용량으로 조정된 탈수제를 장기와 함께 뒤에서 설명하는 불활성 매체 중에 침지시키는 방법이 간단하다. 구체적으로는 예를 들면 실리카겔, 몰레큘러시브, 제올라이트 등으로 둘러 싼 장기를, 보존용 불활성 매체에 대하여 불활성 재질인 철망, 합성섬유망 등의 속에 수용하여, 이들을 불활성 매체 중에 침지시킨다.

사용하는 탈수제의 양은, 그 장기에 필요로 하는 뒤에서 설명하는 제수율로부터 계산할 수 있고, 또 침지시킨 후에, 탈수제를 적당한 타이밍에서 제거, 추가 또는 교환하여도 좋다.

또, 본 발명자에 의한 곰벌레의 실험에서는 고습도, 바람직하게는 습도 80%의 환경하에서 탈수처리를 행하였을 때에 소생율 100%가 달성되었다. 이것을 고려하면, 장기도 고습도하에서 탈수처리하는 것이 바람직하다고 생각된다.

상기 기체관류의 조건의 일례는, 래트의 심장의 대동맥에 0.05 내지 0.2 kgf/㎠, 바람직하게는 0.1 kgf/㎠의 유압으로, 1시간 내지 1시간 30분 이상, 공기를 관류한다. 가장 바람직하게는 일정압으로의 관류이다. 이와 같은 공기의 관류에 의하여 그 탈수 직전의 장기에 대하여 25 wt% 이상의 제수율을 달성할 수 있다.

탈수 직전의 장기는, 대용 체액을 가지고 생리학상 상식적인 수분량을 함유하는 것으로, 장기보존을 위해서는 그 수분량으로부터 가능한 한 다량의 자유수를 제거한다. 본 발명에서는 제거해야 할 수분량을 하기 식으로 표시되는 장기 총 중량을 기준으로 한 수분제거율(중량비)로 규정한다.

수분제거율(중량비) = 100 - (탈수 후의 장기 총 중량 ÷탈수 전의 장기 총 중량 ×100)

상기 탈수상태를 특정함에 있어서, 중량비로서의 수분 제거율 외에, NMR을사용하여 장기 내의 물분자의 절대량이나 그 상태를 규정하여도 좋다. NMR은 생체조직 중의 물의 상태의 연구에 가장 널리 사용되어 온 방법이다.

NMR을 사용한 생체조직 중의 물에 대한 최초의 연구는, 논문{Belton, P.S., Jackson, R.R., Packer, K.J.: Pulsed NMR studies of water in strained muscle, I.Transverse nuclear spin relaxation times and freezing effects; Biochem. Biophys. Acta. 286:16-25(1972)}에 의해 보고되었다. 또한 NMR에 의한 물의 구조해석은, 예를 들면, 논문{Hazlewood, C.F., Chang, D.C., Woessner, D.E., Nichols, B.C. : Nuclear magnetic resonance transverse relaxation times of water protons in skeletal muscle. Biophys.J. 14:583-605(1974)}에 의하여 보고되어 있다.

벨튼 등은, 물은 3가지의 상태로 이루어지는 것을 결론짓고, 약 8%의 물분자가 세포막의 내막이나 단백질이나 핵산이라는 생체내 분자에 결합한 결합수이고, 약 82%의 물분자는 결합수 이외의 자유수이며, 나머지의 10%의 물분자는 세포막의 바깥쪽에 접하고 있는 자유수이다. 그 결합수는 다른 물분자와는 달리 소정의 우위적인 배행을 유지하고 있고, 생체고분자와 직접 결합한 물분자에 의거하여 물분자층에 걸쳐 배향한 상태에 있다.

전형적으로는 생체조직 내의 총 수분량 중, 결합수가 약 10% 내지 약 20%, 자유수가 약 80% 내지 약 90%를 차지하는 것으로 이해된다. 래트의 심장내에서는, 장기 총 중량을 기준으로 하여 전형적인 총 수분량이 약 80질량%이고, 결합수는 8질량% 내지 16질량%, 자유수는 64질량% 내지 72질량%가 된다.

본 발명에 관한 탈수공정에서는, 이론적으로는 장기 총 중량의 약 25wt% 내지 60wt%의 수분제거가 가능하다고 생각된다. 이 정도이면, 제거되는 물은 모두 자유수라고 생각된다.

따라서, 탈수의 결과, 래트의 심장 내에 잔존하는 자유수의 질량%는 수% 내지 40%대까지 내려가나, 결합수의 절대량은 변하지 않는다. 실제의 수분량은 동물종이나 장기의 종류에 따라 다소 다르다고 하여도, 탈수 전의 장기 총 중량에 대한 중량비로 약 25% 이상의 자유수의 제거에 의하여, 탈수 전의 총 수분량에 대한 중량비로 약 10% 내지 20% 이상의 수분(결합수를 포함함)을 남길 수 있다.

장기에 허용되는 자유수의 제거율은, 탈수방법, 장기의 종류, 의도하는 보존기간, 그 밖의 보존조건에 따라 다르다. 현재 시점에서, 래트의 심장에서는 약 25% 내지 35%가 안전하다고 보인다. 돼지의 심장에서는, 약 10% 내지 50%, 특히 15% 내지 25%가 적절하다고 생각된다.

현 단계에서는, 상기의 탈수상태가 어떻게 장기의 보존기간의 증대에 결부되는지의 메카니즘은 충분히 해명되어 있지 않다. 본 발명자의 연구에 의하여 적어도 보존기간의 증대는, 보존액의 성분이 아니라, 장기의 조직이나 세포내의 물분자의 절대량에 크게 의존하고 있음을 알고 있다. 각 조직 및 세포의 탈수에 의하여 실질적인 생명활동이 인정되지 않게 된 장기가 그 후에 소생한 사실로부터, 장기는 가사상태(apparent death)에 이른다고 생각된다. 이 가사상태는, 「immortal state」또는 학술적으로는「crypotbiotic state」라 불리어도 된다(Vreeland H.R. et al; Nature Vol.407 pp.897-900, 19 OCt.2000 : Cano J.R at al; ScienceVol.268 pp.1060-1064, 19 May.1995).

탈수된 장기는, 물 및 기름에 불용성인 불활성 매체인 퍼플루오로카본 중에 보존한다. 불활성 매체에 대한 장기의 침지는, 일반적으로 상압하의 밀폐상태에서 행하여지고, 또 필요에 따라 가압상태에서 행할 수도 있다. 이때, 상기한 바와 같이 탈수제와 함께 보존되어도 좋다. 또 불활성 매체는, 바람직하게는 순산소로 폭기된다.

본 발명에서 말하는 「냉장온도 이하의 온도」는, 약 +1℃ 내지 약 +8℃, 바람직하게는 약 +2℃ 내지 약 +4℃ 부근이며, 이 보존상태에서 소정일수가 유지된다. 또한, 장기의 자유수가 충분히 제거되어 있으면, 이론적으로는 냉동온도, 예를 들면 액체질소 내에 보존하는 것도 가능하다.

장기의 보존상태로부터의 소생에는, 상기 랑겐도르프법을 이용할 수 있다. 우선 보존 장기는, 퍼플루오로카본 중으로부터 인출하여, 탈수제가 있으면 이것을 제거한다. 그 장기를 +4℃의 샤알레 내의 KH액, 바람직하게는 순산소로 폭기한 KH액 중에 넣는다. 이 장기의 대동맥에 관류용 카테테르를 고정하고, 바람직하게는 O₂-CO₂혼합기체로 연속 폭기하거나 37℃로 따뜻해진 KH액을 관류펌프에 의한 일정유량으로 대동맥측의 카테테르에 보내 준다. 이 관류에 의하여 장기의 소생이 도모된다.

포유류 동물의 장기보존에서 문제가 되는 것은, 보존 후에 과연 장기의 어느 조직이 생존하고 있는지 등을 검증하지 않으면 안되는 점이다. 그 방법으로서는,조직해부학적 방법, 실제로 이식하여 검증하는 이식법, 전기생리학적 방법 등이 있다. 이들 어느 방법을 채용하든 간에, 우선 조직세포가 생존하고 있는지의 여부를 검증하지 않으면 안된다.

본 발명에 있어서는, 조직세포의 소생을 검증하는 방법으로서, 전기생리학 방법, 예를 들면 심장에 심전도 측정을 사용하였다. 심전도는, 신경 세포조직의 활동을 실시간으로 기록할 수 있어, 신경세포의 활동이 소멸한 시점에서 세포사가 생긴 것으로 판단할 수 있다. 또 보조적으로 육안에 의하여 장기조직의 변색정도, 아울러 심장이면 박동의 유무를 확인함으로써, 장기로서의 소생상태를 관찰할 수 있다.

오일막의 형성 및 기체에 대한 폭로에 의한 탈수를 포함하는 발명

본 발명은, 상기한 맥관계로부터의 탈수 대신에, 장기의 기체에 대한 폭로에 의한 수분의 증발을 사용한다. 그 탈혈공정 및 소생공정은 상기한 맥관계로부터의 탈수에 의한 발명과 기본적으로 동일하다. 기체 중에의 폭로에 의한 본 발명에서는 그 보존공정은, 불활성 매체 중에 장기를 침지하는 상기한 보존방법을 적용할 수도 있고, 적용하지 않을 수도 있다. 불활성 매체 중에 장기를 침지시키지 않는 경우, 건조된 장기는, 원하는 보존기간, 적절한 습도의 기체 중에 냉장온도로 유지된다.

탈혈한 장기는, 카뉴레와 함께 관류장치로부터 떼어 내어 오일에 가볍게 침지시킨다. 장기의 전 표면에 오일막을 형성한다. 오일막의 형성은, 건조기체하에서의 수분제거로 염려되는 적출심장의 건조속도의 편차 및 그것에 의한 심장 표면의 수축이나 각질화를 방지할 수 있다.

사용하는 오일은, 장기에 무해하고, 장기의 표면에 적절한 두께의 오일막을 형성할 수 있는 점도를 가지는 것이 좋고, 전형적으로는 실리콘오일이다. 실리콘오일은 유기산화규소의 폴리머로 이루어지고, 생리학적으로 거의 무해하고 화학적으로 불활성인 물질이다. 뒤에서 설명하는 실시예에서 사용한 실리콘오일은 동점도 100mm2/S(섭씨 25℃)에서 불휘발성이어서 장시간에 걸친 심장 표면의 과잉건조로부터의 보호에 적합하다고 생각된다. 심장의 표면에 오일막을 형성하면, 오일이 없을 때의 건조에 의하여 생기는 심장 표면의 균열 등의 물리적 상해가 경감되는 것을 육안으로 확인할 수 있다.

사용하는 기체는, 전형적으로는 공기, 또는 O₂-CO₂혼합기체를 사용할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 건조용 기체로서는 O₂-CO₂혼합기체가 바람직하다.

뒤에서 설명하는 실시예에서 나타내는 바와 같이, 보존용 기체로서는 Xe(키세논)을 함유하는 것을 사용하여도 좋다. 키세논은 극성을 가지지 않는 불활성 기체 이기 때문에, 주위의 물과 소수성 수화하여 물분자의 열운동을 억제할 수 있다. 물의 구조화가 높아져 분자운동이 느려지면 물의 점도는 상승하고, 그리고 생체반응은 물을 거쳐 행하여지기 때문에, 물의 점도가 상승하면 세포의 대사가 억제된다고 생각된다. 자유수의 제거 및 저온하에서의 유지에 아울러 보존기체에 키세논을 사용하면, 장기의 대사는 한층 억제된다.

또, 키세논은 그 해리압(섭씨 0℃)이 1.15기압(0.1115 MPa)으로서, 비교적낮은 가압으로 기체 수화물을 만들기 쉬워지는 것이 알려져 있다. 따라서 키세논을 사용하는 경우는 장기를 가압하에서 보존하면 좋다. 가압환경하에서는, 장기(세포의 내 및 외를 포함함) 내에서의 수상에 대한 키세논의 용해도가 높아진다고 생각된다. 장기를 둘러 싸는 키세논을 가압하면, 장기 내의 물의 구조화가 촉진되어, 장기의 대사는 현저하게 억제된다고 추정된다.

기체에 대한 폭로를 사용하는 탈수방법은, 예를 들면 실리카겔의 건조제를 넣어 냉장온도로 유지된 밀폐용기 속에 탈혈 후의 장기를 넣어, 장기를 소정기간에 걸쳐 건조한 기체에 노출시킨다. 달성해야 할 탈수율은, 장기의 중량에 따라 다르나, 탈수 전의 장기 총 중량의 10wt% 내지 50wt% 이다. 단, 동일한 건조조건에서는 달성되는 탈수율은, 장기의 크기(중량 등)에 의존하기 때문에, 그것을 고려한 건조조건을 적용하는 것이 바람직하다고 생각된다.

탈수를 위한 시간은, 장기의 중량 및 건조제의 양에 따라 다르다. 예를 들면, 래트의 심장이면 24시간 내지 48시간 전후, 돼지의 심장이면 일주일 전후이나 이들에 한정되지 않는다. 그것들의 각 건조기간 후, 장기를 불활성 매체 중에 보존하면 좋다. 이 탈수방법으로 장기를 손상하지 않고 장기보존에 바람직한 높은 탈수율을 달성할 수 있다. 장기의 손상이 적기 때문에, 비교적 짧은 기간의 보존에서는 소생상태가 매우 좋고, 또 장기간의 보존에서도 소생율이 상승한다.

뒤에서 설명하는 실시예 4에서는 돼지의 장기를 37일간 후에 소생시키는 것에 성공하였다. 종래의 냉장보존에서는 장기가 부패되는 기간이나, 장기의 심근조직이 소생하였다고 확인되었다.

실시예 1(맥관계를 거쳐 탈수시킨 래트의 심장의 보존)

미국의 NIH의 실험동물 기준에 맞추어 인공번식된 7주령의 Wistar계 수컷 래트(체중 300g)를 실험동물로서 사용하였다.

래트의 복강 내에 넴푸탈 0.25㎖ 및 헤파린나트륨(Heparin Sodium Salt) 5mg을 주사투여하여, 체중을 측정하고 나서 심장적출을 개시하였다. 적출한 심장을 항온조 속에 두고 대동맥에 카테테르를 삽입하고 나서 트레할로스 117mmol을 용해시켜 95%O₂-5%CO₂혼합기체를 폭기한 KH액을 사용하여, 랑겐도르프식에 의한 탈혈관류를 행하였다. 항온조의 온도를 내려 심장을 정지시키고 탈혈관류를 종료하였다.

심장중량을 측정한 후, 그 관류장치에 의하여 심장에 상기 95%O₂-5%CO₂혼합 기체를 보내어 탈수를 개시하였다. 심장의 중량을 측정하여 수분 제거율을 기록하면서, 탈수개시로부터 1시간 30분 정도 후에 기체관류를 정지하였다. 심장의 총 중량은, 외표면의 수분을 닦아낸 만큼의 상태로 측정하였다.

탈수한 심장은, 미리 순산소를 1분간 폭기한 4℃의 퍼플루오로카본액(스미토모 3M사 제품, 플로리나트 FC77; C8F17) 500㎖ 중에 침지시키고, 이것을 밀폐용기 중에 밀봉하여, 냉장고내에 보존하였다.

소정의 시간 후에 퍼플루오로카본액으로부터 보존심장을 인출하여, 대동맥 카테테르를 삽입하여 상기 혼합기체를 폭기한 따뜻한 KH액을 사용하여 랑겐도르프식 관류에 의한 소생을 시도하였다.

·실험 1 (4시간 보존)

R349(5주령 wistar계 수컷 래트)

2000년 9월 11일 실온 24℃

15 : 39 체중측정 : 130g

15 : 51 심장적출개시

15 : 53 심장적출 및 카테테르삽입 종료

15 : 53 탈혈관류개시 : 항온조 온도 5.0℃, 속도 1.0 내지 3.8㎖/min

16 : 14 심장정지, 탈혈관류 종료 : 항온조 온도 5.0℃, 심장온도 18.2℃

16 : 14 심장중량 측정 : 0.663g

16 : 18 혼합기체관류에 의한 탈수개시 : 가스압 0.05kgf/㎠, 항온조 온도 2.8℃

16 : 48 심장중량 측정 : 0.516g, 수분제거율 22.2%

16 : 50 탈수속행 : 가스압 O.05 kgf/㎠, 항온조 온도 1.1℃

17 : 20 심장중량 측정 : 0.458g, 수분제거율 30.9%

17 : 21 탈수속행 : 가스압 0.05kgf/㎠, 항온조 온도 1.6℃

17 : 51 심장중량 측정 : 0.394g, 수분제거율 40.6%

17 : 55 PFC액에 침지시켜 4시간 보존 : 0.6℃

21 : 54 보존종료, 심장인양(실온 26℃)

21 : 55 심장중량 측정 : 0.436g

21 : 55 소생 관류개시 : 항온조 온도 34.4℃, 속도 1.0 내지 3.8㎖/min

23 : 40 소생 관류종료 : 항온조 온도 33.7℃

평가 : KH관류개시후 4분에 미약하면서 심근의 수축이 보였으나, 심방은 움직이지 않았다.

심근은 관류를 정지할 때까지 계속 움직였다. 심장은 약간 팽창하였다.

·실험 2 (8시간 보존)

R350(5주령 wistar계 수컷 래트)

2000년 9월 12일 실온 25℃

19 : 10 체중측정 : 150g

19 : 20 심장적출 개시

19 : 22 심장적출 및 카테테르삽입 종료

19 : 22 탈혈관류 개시 : 항온조 온도 5.0℃, 속도 1.0 내지 3.8㎖/min

19 : 37 심장정지, 탈혈관류 종류 : 항온조 온도 4.6℃, 심장온도 15.7℃

19 : 39 심장중량 측정 : 0.718g

19 : 43 혼합기체 관류에 의한 탈수개시 : 가스압 0.1kgf/㎠, 항온조 온도 4.4℃

20 : 13 심장중량 측정 : 0.647g, 수분제거율 9.9%

20 : 15 탈수속행 : 가스압 0.1kgf/㎠, 항온조 온도 2.4℃

20 : 35 심장중량 측정 : 0.550g, 수분제거율 23.4%

20 : 48 탈수속행 : 가스압 0.05kgf/㎠, 항온조 온도 4.8℃

20 : 18 심장중량 측정 : 0.483g, 수분제거율 32.7%

20 : 55 PFC액에 침지시켜 8시간 보존 : 0.6℃

2000년 9월 13일

05 : 21 보존종료, 심장인양(실온 27℃)

05 : 23 심장중량 측정 : 0.523g

05 : 24 소생관류개시 : 항온조 온도 33.6℃, 속도 1.0 내지 3.8㎖/min

05 : 25 소생관류종료 : 항온조 온도 36.6℃

평가 : 05 : 29부터 심근이 심하게 수축하였으나, 약 10초정도에서 멈추었다. 0600경, 폐동맥 주변(우심)부근이 미약하게 움직이고 있던 것을 확인하였다. 심장이 매우 팽창되어 외견으로는 박동을 거의 확인할 수 없으나, 관류를 정지하고 심장의 KH액을 뽑으면, 확실하게 박동하고 있음을 알 수 있었다.

. 실험 3 (16시간 보존)

R351(5주령 wistar계 수컷 래트)

2000년 9월 13일 실온 24℃

16 : 22 체중측정 : 120g

16 : 28 심장적출개시

16 : 31 심장적출 및 카테테르삽입 종료

16 : 31 탈혈관류개시 : 항온조 온도 26.9℃, 속도 1.0 내지 3.8㎖/min

16 : 44 심장정지, 탈혈관류종료 : 항온조 온도 4.6℃, 심장온도 16.2℃

16 : 45 심장중량 측정 : 0.605g

16 : 50 혼합기체 관류에 의한 탈수개시 : 가스압 0.1kgf/㎠, 항온조 온도 3.3℃

17 : 20 심장중량 측정 : 0.534g, 수분제거율 11.7%

17 : 23 탈수속행 : 가스압 0.1kgf/㎠, 항온조 온도 1.3℃

17 : 53 심장중량 측정 : 0.517g, 수분제거율 14.5%

17 : 55 탈수속행 : 가스압 0.2kgf/㎠, 항온조 온도 0.5℃

18 : 25 심장중량 측정 : 0.522g, 수분제거율 13.7%

18 : 30 PFC액에 침지시켜 16시간 보존 : 2.8℃

2000년 9월 14일

10 : 28 보존종료, 심장인양(실온 25℃)

10 : 30 소생관류개시 : 항온조 온도 32.9℃, 속도 1.0 내지 3.8㎖/min

17 : 25 소생관류종료 : 항온조 온도 34.5℃

평가 : 심장의 팽창이 심하여, 박동의 상태가 불명하기 때문에, 심전도에 의한 기록을 취하였다.

·실험 4

래트 R443 (24시간 보존)

2001년 2월 6일

16 : 10 심장적출

16 : 20 탈혈관류개시 : 항온조 온도 26.8℃ →7.9℃

16 : 45 탈혈관류종료, 심장중량 측정 : 0.582g

16 : 45 대동맥으로부터 공기를 관류(0.1kgf/㎠)하면서 PFC액 중에 침지

2001년 2월 7일

16 : 48 PFC액으로부터 심장인양

16 : 50 심장중량 측정 : 0.430g, 수분제거율 26.1%

16 : 50 KH액에 의한 관류개시(항온조 27.0℃ →35.5℃)

18 : 30 소생확인, 안정된 박동소생있음

·실험 5

래트 R444 (24시간 보존)

2001년 2월 7일

18 : 55 넴부탈 0.2㎖ 투여

18 : 57 헤파린나트륨 5mg 투여

18 : 57 체중측정

19 : 00 심장적출

19 : 03 트레할로스용해 KH액 관류(항온조 27.6℃ →5.5℃)

19 : 23 관류종료, 심장중량 측정 : 0.767g

19 : 27 병 내에서 공기관류(0.1kgf/㎠, 0.8℃)

19 : 57 관류종료, 심장중량 측정 : 0.483g, 수분제거율 34.8%

20 : 00 PFC 침지

2001년 2월 8일

20 : 25 PFC(0.5℃)로부터 심장인양

20 : 27 심장중량 측정

20 : 27 KH액 관류개시(항온조 온도 26.9℃ →35.4℃)

21 : 27 소생확인, 수회 박동정지

실시예 2(맥관계를 거쳐 탈수시킨 래트의 심장보존)

실험동물은, 미국의 NIH 실험동물 기준에 준거하여 번식한 5주령 wister계 수컷 래트를 사용하였다. 하기의 각 실험예에는, 각각 래트를 5마리씩 사용하였다. 불활성 매체로서 퍼플루오로카본(PFC)을 사용하였다.

·실험 1 (4시간 보존)

래트에 넴푸탈 0.2㎖m 1을 복강 내 투여후, 헤파린나트륨 5mg을 0.3㎖의 생리식염수에 용해시킨 용액을 복강 내 투여하였다. 래트를 개흉(開胸)하여 심장을 적출한 후, 적출심장의 대동맥에 카테테르를 삽입하여 목면사로 결찰(結紮)하였다. 카테테르를 삽입한 적출심장을 정류량 관류장치에 장착하여, 트레할로스를 117mmol 용해시킨 27℃의 KH액을 3.2㎖/min 으로 관류시켰다. KH액은 95% O₂-5% CO₂의 혼합가스로 상시 폭기하였다. 서서히 관류액의 온도를 내려 심장을 정지시키고, 완전히 정지한 심장의 중량을 측정한 후, 카테테르로부터 공기가스를 0.1kgf/㎠의 유압으로 관류시켜 심장을 건조시켰다. 건조시킨 심장의 중량을 측정한 후, 혼합가스로 상시 폭기하면서 4℃로 보냉한 PFC 중에 침지 보존하였다. 4시간 후, 보존액으로부터 심장을 인출하여 정류량 관류장치에 장착하고, 혼합가스로 상시 폭기한 27℃의 KH액을 3.2 ㎖/min으로 관류시켰다. 적출심장은 보존 후 다시 관류를 개시하면, 조직세포가 생명을 유지하고 있으면 자율적으로 소생하여 신경활동이 출현하는 것이 알려져 있다. 소생한 심장에 전극을 장착하여 펜오실로그래프로 표면 심전도를 기록하였다.

·실험 2 (16시간 보존)

보존시간을 16시간으로 한 것 외에는 상기의 실험예 12와 동일하게 하여 행하였다.

상기 각 래트의 기체관류 시간과 수분제거율을 하기에 나타낸다.

실험 1의 탈수율

1-1 1시간 34분 44.1%

1-2 2시간 37분 32.8%

1-3 2시간 37분 44.4%

1-4 2시간 37분 47.5%

1-5 3시간 7분 41.1%

실험 2의 탈수율

2-1 1시간 35분 44.4%

2-2 2시간 37분 41.2%

2-3 1시간 3분 45.8%

2-4 3시간 12분 41.3%

2-5 2시간 9분 41.4%

실시예 2의 결과 : 실험 1 및 실험 2의 양쪽에서 모두 시료가 소생하였다. 상기 실험 1 및 2에서는, 수분제거에 요했던 시간과 수분제거율에 현저한 불균일을 볼 수 있었다. 이는 적출시의 심장의 상태가 일정하지 않은 것이 원인이라고 생각된다. 대동맥에 삽입된 카테테르로부터 보내진 공기는 좌우 관상동맥구로부터 심근의 모세혈관으로 골고루 퍼져 각 심근세포를 건조시키나, 모세혈관에 약간이라도 혈전이 생겨 있으면 공기가스는 그 앞의 세포에는 미치지 않아, 시간과 제거율이 비례하지 않았을 것이다. 어쨌든 이번의 실험으로, 수분제거율 40% 이상의 래트의 심장이, 4시간 및 16시간의 보존으로, 100%의 확립으로 소생한 것은 놀랄만한 일이었다.

실시예 3 (기체에 폭로하여 탈수시킨 래트의 심장보존)

본 실시예에서는, 래트로부터의 적출심장에 실리콘오일을 도포하고, 그 심장을 건조기체의 가압으로, 4℃에서 3일간 보존하였다.

본 실험에서 사용한 래트는, 미국 NIH의 실험동물 기준에 맞추어 인공 번식된 7주된 Wistar계의 수컷(300g)을 사용하였다. 래트로부터 적출한 심장은 탈혈한 후, 심근 보호액(Miotecter 모시다세이야쿠 제품) 2㎖를 카테테르로부터 주입하여 심장을 정지시켰다.

관류를 종료한 심장의 표면에 실리콘오일(WF·30 와코쥰야쿠 제품)을 도포하고, 멸균거즈(120 × 120mm)에 심장을 싸서, 규격병(60㎖)에 넣었다. 실리카겔을 깔아 채운 내압 챔버 내에 심장이 들어 간 병을 놓고 밀폐하였다. 챔버 내는 혼합가스(산소 95%, 이산화탄소 5%)로 치환한 후, 0.2Mpa가 되도록 혼합가스를 봉입하였다. 처리 후, 챔버는 섭씨 4도의 냉장고에 보존하였다.

필요에 따라 24시간마다 챔버를 열고, 적출심장에 실리콘오일을 다시 도포하였다. 소정기간의 경과 후에 챔버 내의 실리콘오일로부터 심장을 인출하여 정압관류장치에 세트하였다. 산소 95%, 이산화탄소 5%의 혼합가스로 연속 폭기하고 있는 KH액으로 채워진 관류액 저류조로부터 유도된 관류액은, 일정압(약 60mmHg)으로 대동맥 카테테르에 보내 주었다. 적출심장은, 섭씨 37도에서 관류를 개시하였다. 관류 중은, 좌심실과 대동맥 개구부에 심전도 기록용 전극을 장착하여, 쌍곡유도로 심전도를 생체 앰프(Bioview-ENEC 산에이 제품)를 사용하여 연속기록하였다.

. 기본적인 실험순서는 이하와 같다.

1. 적출한 심장을, KH액을 채운 샤알레 내에 침지시킨다.

2. 샤알레 내에서 카뉴레를 대동맥에 삽입하여, 목면사로 고정한다.

3. 카뉴레를 랑겐도르프식 정압관류장치에 장착하여, KH액을 심장에 탈혈관류한다. 이때의 KH액에는 페니실린칼륨 20만 U/L을 첨가하고 있다. 관류온도는 약 37℃, 관류압은 60mmHg 이다.

4. 20분의 관류 후, 심정지액(심근 보호액) 미오테쿠타를 2㎖ 정도 심장에 관류시켜 심정지를 촉진한다.

5. 심장을 카뉴레마다 관류장치로부터 떼어 내어 표면의 수분을 거즈로 닦아 심장의 중량을 측정한다.

6. 심장을 실리콘오일에 가볍게 침지시켜, 표면에 실리콘오일의 층을 만든다.

7. 심장을 거즈에 느슨하게 싸서 용기에 넣는다.

8. 심장이 들어 간 용기를 내압 챔버에 넣는다. 챔버 내의 바닥에는 실리카겔을 전면에 깔아 둔다.

9. 챔버를 밀폐하고, 혼합가스(95% 산소, 5% 이산화탄소)를 보내어 0.3MPa가 될 때까지 가압한다. 필요에 따라 키세논가스를 사용한다(예를 들면, 키세논 약 0.1MPa 및 혼합가스 0.2MPa).

10. 가압완료 후, 챔버마다 냉장고에 넣어, 2 내지 4℃에서 보존한다.

11. 3일 후에 챔버를 냉장고에서 꺼내고 나서, 가스를 배출시킨다.

12. 챔버를 열고, 심장을 인출하여 중량을 측정한다.

13. 심장을 랑겐드로프식 정압관류장치에 장착하고 관류를 개시한다. 예를 들면 관류온도는 37.0℃, 관류압은 60mmHg이다.

14. 소생을 확인하였으면 심장 표면의 심전도를 측정한다.

또한, 시료에 따라서는 챔버 내에 봉입하는 가스를 바꾸거나, 건조기간을 바꾸기도 하였다. 건조기간이 종료한 시료는, 보존액(실리콘오일·PFC)에 침지시켜, 건조시와 마찬가지로 챔버내에서 가압 보존하였다.

상기 방법을 적용하여 소생이 확인된 실험을 이하에 예시한다.

· 실험 1

보존 전의 심장중량 : 1.46g

보존개시일시 : 2001년 12월 30일 21 : 07

사용기체 : 혼합가스 0.3MPa

소생개시일시 : 2002년 1월 2일 16 : 09

소생개시 전의 심장중량 : 0.97g(3일간 35%의 수분제거)

·실험 2

보존 전의 심장중량 : 1.29g

보존개시일시 : 2001년 12월 30일 21 : 07

사용기체 : 혼합가스 0.3MPa

소생개시일시 : 2002년 1월 2일 17 : 42

소생개시 전의 심장중량 : 0.89g(35%의 수분제거)

·실험 3

보존 전의 심장중량 : 1.37g

보존개시일시 : 2002년 1월 8일 19 : 20

사용기체 : 혼합가스 0.2MPa에 더하여 Xe 0.1MPa

소생개시일시 : 2002년 1월 11일 14 : 34

소생개시 전의 심장중량 : 0.98g(32%의 수분제거)

·실험 4

보존 전의 심장중량 : 1.41g

보존개시일시 : 2002년 1월 8일 19 : 20

사용기체 : 혼합가스 0.2MPa에 더하여 Xe 0.1MPa

소생개시일시 : 2002년 1월 11일 15 : 42

소생개시 전의 심장중량 : 1.1Og (27%의 수분제거)

·실험 5

보존 전의 심장중량 : 1.60g

보존개시일시 : 2002년 1월 9일 10 : 16

사용기체 : 혼합가스 0.2MPa에 더하여 Xe 0.1MPa

소생개시일시 : 2002년 1월 12일 17 : 42

소생개시 전의 심장중량 : 0.94g (46%의 수분제거)

·실험 6

보존 전의 심장중량 : 1.63g

보존개시일시 : 2002년 1월 15일 19 : 13

사용기체 : 혼합가스 0.3MPa

소생개시일시 : 2002년 1월 18일 13 : 49

소생개시 전의 심장중량 : 1.12g (31%의 수분제거)

·실험 7

보존 전의 심장중량 : 1.41g

보존개시일시 : 2002년 1월 15일 19 : 13

사용기체 : 혼합가스 0.3MPa

소생개시일시 : 2002년 1월 18일 16 : 02

소생개시 전의 심장중량 : 1.04g (35%의 수분제거)

·실험 8

보존 전의 심장중량 : 1.43g

보존개시일시 : 2002년 1월 8일 19 : 20

사용기체 : 혼합가스 0.2MPa에 더하여 Xe 0.1MPa

소생개시일시 : 2002년 1월 11일 18 : 54

소생개시 전의 심장중량 : 1.07g (28%의 수분제거)

도 1은 본 실험에 있어서의 심장표면 심전도이다(21 : 04 측정)

·실험 9

보존 전의 심장중량 : 1.61g

보존개시일시 : 2002년 1월 9일 20 : 16

사용기체 : 혼합가스 0.2MPa에 더하여 Xe 0.1MPa

소생개시일시 : 2002년 1월 12일 19 : 18

소생개시 전의 심장중량 : 1.00g (42%의 수분제거)

도 2는, 본 실험에 있어서의 심장표면 심전도이다(20 : 25)

실시예 4 (기체에 폭로하여 탈수시킨 돼지의 심장보존)

본 실시예에서는, 돼지의 심장을 혼합가스에 폭로하여 탈수시키고, 그 혼합가스하에서 7 내지 8일간 보존하였다.

·실험 1 (7일간)

보존 전의 심장중량 : 31.9g

보존개시일 : 2002년 2월 16일

사용오일 : 실리콘오일

사용기체 : 혼합가스(가압없음)

순서 : 오일을 도포한 심장을 폴리우레탄폼으로 싸서 용기(병)에 수납하고, 용기마다 챔버에 넣어 혼합가스로의 치환을 행하였다. 그것을 냉장고에 넣고 2 내지 4℃의 냉장온도로 유지하였다. 장기를 하루마다 인출하여 실리콘오일을 다시도포하였다.

소생개시일 : 2002년 2월 23일

소생개시 전의 심장중량 : 25.6g (19.7%의 수분제거)

도 3은, 7일간의 보존 후에 소생시킨 그 심장표면의 심전도이다.

·실험 2 (8일간)

보존 전의 심장중량 : 31.2g

보존개시일 : 2002년 2월 17일

사용오일 : 실리콘오일

사용기체 : 혼합가스(가압없음)

순서 : 오일을 도포한 심장을 폴리우레탄폼으로 싸서 용기(병)에 수납하고, 용기마다 챔버에 넣어, 혼합가스로의 치환을 행하였다. 그것을 냉장고에 넣어 2 내지 4℃의 냉장온도로 유지하였다. 장기를 하루마다 인출하여 실리콘오일을 다시 도포하였다.

소생개시일 : 2002년 2월 25일

소생개시 전의 심장중량 : 23.5g (24.6%의 수분제거)

도 4는, 8일간의 보존 후에 소생시킨 그 심장표면의 심전도이다.

실시예 5 (기체에 폭로하여 탈수시킨 돼지심장의 장기보존)

본 실시예에서는, 돼지심장을 기체에의 폭로에 의한 탈수를 적용하여 장기보존(37일간)을 시도하였다.

돼지의 체중 : 5kg, 보존 전의 심장중량 : 32.6g

보존개시일시 : 2001년 12월 16일

사용기체 : 혼합가스(가압없음)

순서 : 오일을 도포한 심장을 폴리우레탄폼으로 싸서 용기(병)에 수납하였다. 용기마다 챔버에 넣어 혼합가스로의 치환을 행하였다. 그 챔버를 냉장고에 넣어 2 내지 4℃의 냉장온도로 유지하였다. 장기는 하루마다 인출하여, 실리콘오일의 재도포를 행하였다. 탈수개시로부터 일주일 후에 불활성 매체(PFC)에 침지시켜, 2내지 4℃의 냉장온도로 유지하였다.

소생개시일시 : 20O2년 1월 22일

탈수개시로부터 37일간 후에 장기를 인출하여 소생을 위한 관류를 행하였다.

소생개시 전의 심장중량 : 25.1g (23%의 수분제거)

도 5에 나타내는 바와 같이 소생개시 후(19 : 04), 심장표면(온도 29.0℃)의 심전도가 출현하였다. 1mV로부터 최대 5mV, 매분 8회 내지 40회의 펄스가 기록되었다.

Claims

생리학상 상식적인 수분량을 함유하는 장기로부터, 그 맥관계를 통하여 상기 장기 내의 수분을 끌어 냄으로써 탈수 전의 장기 총 중량에 대한 중량비로 약 10% 이상의 수분을 제거하고, 또한 탈수 전의 총 수분량에 대한 중량비로 약 10% 내지 약 20% 이상의 수분을 남기는 탈수공정과, 상기 장기를 불활성 매체에 침지시켜 냉장온도로 유지하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 동물의 장기의 보존방법.
심장에 생리적 염류 용액을 관류시켜 심장 내의 혈액을 생리적 염류 용액으로 치환하는 탈혈공정과, 탈혈한 심장으로부터 그 혈관계를 통하여 상기 장기 내의 수분을 끌어 냄으로써 탈수 전의 심장 총 중량에 대한 중량비로 약 10% 내지 약 50%의 수분을 제거하는 탈수공정과, 상기 심장을 불활성 매체에 침지시켜 약 1℃ 내지 8℃의 냉장온도로 유지하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 동물의 장기의 보존방법.
심장에 생리적 염류 용액을 관류시켜 심장 내의 혈액을 생리적 염류 용액으로 치환하는 탈혈공정과, 탈혈한 심장으로부터 그 혈관계를 통하여 상기 장기 내의 수분을 끌어 냄으로써 탈수 전의 심장 총 중량에 대한 중량비로 약 25% 내지 약 60%의 수분을 제거하는 탈수공정과, 상기 심장을 불활성 매체에 침지시켜 약 1℃내지 약 8℃의 냉장온도로 유지하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 동물의 장기의 보존방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 탈수공정이, 수분을 끌어 내는 매체로서 기체를 보내 주는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 동물의 장기의 보존방법.
제 4항에 있어서,

상기 탈수공정이, 기체를 심장의 대동맥에 관류시켜, 상기 기체의 흐름에 의하여 상기 심장의 혈관계로부터 수분을 끌어 내는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 동물의 장기의 보존방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 탈수공정이, 장기 또는 심장의 맥관계에 공기를 보내 주는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 동물의 장기의 보존방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 탈수공정이, 장기 또는 심장의 맥관계에 O₂를 주성분으로 하는 O₂-CO₂혼합기체를 보내 주는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 동물의 장기의 보존방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 탈수공정이, 장기에 불활성 매체에 침지시키고 있는 상기 장기에 탈수제를 접촉시키는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 동물의 장기의 보존방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 생리적 염류 용액에 트레할로스를 용해시켜 사용하는 것을 특징으로 하는 포유류 동물의 장기의 보존방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 불활성 매체로 퍼플루오로카본액을 사용하는 것을 특징으로 하는 포유류 동물의 장기의 보존방법.
제 1항에 있어서,

상기 장기가, 심장, 간장, 신장, 췌장 및 폐장으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 포유류 동물의 장기의 보존방법.
제 1항에 있어서,

상기 장기가, 돼지의 심장인 것을 특징으로 하는 포유류 동물의 장기의 보존방법.
생리학상 상식적인 수분량을 함유하는 장기의 표면에 오일막을 형성하는 공정과, 상기 심장을 기체에 노출시켜 상기 심장 내의 수분을 상기 기체 중으로 증발시킴으로써, 탈수 전의 심장 총 중량에 대한 중량비로 약 10% 이상의 수분을 제거하는 공정과, 상기 장기를 약 2℃ 내지 약 8℃의 냉장온도로 유지하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 동물의 심장의 보존방법.
심장에 생리적 염류 용액을 관류시켜 심장 내의 혈액을 생리적 염류 용액으로 치환하는 탈혈공정과, 탈혈한 심장의 표면에 오일막을 형성하는 공정과, 상기 심장을 기체에 노출시켜 상기 심장 중의 수분을 상기 기체 중으로 증발시킴으로써, 탈수 전의 심장 총 중량에 대한 중량비로 약 10% 내지 약 50%의 수분을 제거하는 공정과, 상기 장기를 약 1℃ 내지 약 8℃의 냉장온도로 유지하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 동물의 심장의 보존방법.
제 14항 또는 제 15항에 있어서,

수분이 제거된 상기 장기를 불활성 매체에 침지시켜 약 1℃ 내지 약 8℃의 냉장온도로 유지하는 공정을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 동물의 심장의 보존방법.
제 14항 또는 제 15항에 있어서,

상기 장기가, 심장, 간장, 신장, 췌장 및 폐장으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 포유류 동물의 심장의 보존방법.
제 17항에 있어서,

상기 장기가 돼지의 심장인 것을 특징으로 하는 포유류 동물의 심장의 보존방법.