JP4688987B2

JP4688987B2 - 哺乳類動物摘出臓器の保存方法

Info

Publication number: JP4688987B2
Application number: JP24505298A
Authority: JP
Inventors: 邦博関
Original assignee: 株式会社バイオバンク; 臼井龍夫
Priority date: 1998-08-31
Filing date: 1998-08-31
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2018-08-31
Also published as: JP2000072601A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳類動物摘出臓器の保存方法に関する。更に詳しくは、長期間保存を可能とさせる哺乳類動物摘出臓器の保存方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人間の肺臓、心臓、肝臓、腎臓、膵臓等の臓器の臨床移植治療は、既に実用化され、日常化されているが、年々増加する移植待機患者に対するドナー不足の問題が深刻化し、手術迄の待機時間が延長している。また、臓器移植のドナーが出現しても、血液のように長期間の保存や供給体制の整備が十分なされていないのが現状である。
【０００３】
特に、移植臓器にあっては、低温保存が主流であり、約4〜24時間が保存限界であるため、早急な保存、蘇生技術の確立が要望されている。実際には、University of Winsconsin Solution液(ＵＷＳ液)を使用したラット、うさぎ、ひひの摘出心臓の低温保存および蘇生にあっても、6〜18時間が限度である。また、このＵＷＳ液とパーフルオロカーボン媒体とを組合せて用い、ラットの心臓を保存し、移植に成功したのは、24時間(5匹全部)から48時間(5匹中4匹)である。この理由は、摘出心臓が4℃の低温や虚血傷害に曝されると、細胞膜に損害が与えられるため、組織細胞が蘇生できないことによる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は先に、乾燥状態のクマムシ等をパーフルオロカーボン媒体中では、極限の600Mpaというような高水圧環境という負荷にも耐え、生命力を保持していることを発見したが(特願平10-122953号)、ここでの乾燥状態はタン状態または樽状態によって形成されている。
【０００５】
本発明の目的とするところは、哺乳類動物の摘出臓器に適用され、それの長期保存を可能とする摘出臓器の保存方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
かかる本発明の目的は、哺乳類動物の摘出臓器をトレハロースを溶解させた溶液で浸せき処理した後、30〜60％の脱水量で脱水処理し、次いでパーフルオロカーボン中に浸せきして冷蔵温度に維持する摘出臓器の保存方法によって達成される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
哺乳類動物の摘出臓器としては、前記の如き臨床移植治療に用いられるものであれば任意のものを用いることができる。
【０００８】
これらの摘出臓器は、まず脱水処理される。脱水処理は、摘出臓器の周囲をシリカゲル、モレキュラーシーブ、ゼオライト等の脱水剤で取り囲むことによって行われる。これは、摘出臓器の保存期間の増大は、保存液の成分ではなく、臓器組織細胞内の水分子の絶対量が関与しており、臓器組織細胞内の脱水および吸水の生理的メカニズムを、前記クマムシと同様な条件とすることによって、長期間保存を可能とし、また蘇生を可能とする。このような観点から、脱水剤による脱水は実際的な見地から理論量の30〜60%として行われる。
【０００９】
このようにして保存される摘出臓器は、まずトレハース混合液に浸せきした後、シリカゲル等の脱水剤で脱水処理される。トレハースC₁₂H₂₂O₁₁は、自然界に広く分布する非還元性の２糖類であって、様々なストレス条件下において、細胞膜構造の安定化乃至保護作用を有することが知られている。
【００１０】
例えば、摘出心臓を保存する前に、トレハロースを溶解させた溶液で心臓内を脱血灌流させると、組織細胞内の水分子がトレハロースとパーフルオロカーボン媒体内に保存中に置換されるものと考えられ、またトレハロースは心臓が4℃といった低温や虚血傷害に曝されると、細胞膜に対して保護作用を示すことも知られている。
【００１１】
そのため、摘出臓器組織細胞から脱水剤を用いて積極的に脱水させる際、各細胞から脱水した水分子はトレハロースと置換し、更に低温に維持することにより、抽出臓器の組織細胞の酸素採取量は極端に低下し、前記クマムシが樽状態で長期間生命を維持しているのと同じような状態になるものと考えられ、こうした現象が摘出臓器の保存および蘇生に有効に作用しているものと推測される。
【００１２】
摘出臓器の周囲を脱水剤で取り囲み、パーフルオロカーボンに浸せき、維持する具体的な方法としては、例えば金網、合成繊維ネット等のパーフルオロカーボンに対して不活性な材質のものを用い、その中に脱水剤で臓器の周囲を取り囲んだ状態で収容し、そのままパーフルオロカーボン液中に浸せきし、冷蔵温度に維持する方法がとられる。パーフルオロカーボン、好ましくは純酸素で暴気したパーフルオロカーボン中への浸せきは、一般に常圧下の密閉状態で行われるが、必要に応じて加圧した状態で行うことができ、また冷蔵温度としては、一般に約1〜8℃、好ましくは4℃の温度が用いられる。
【００１３】
所定日数がこのような状態に保持される摘出臓器は、保存液中から取り出され、脱水剤を除去した後、例えば心臓の場合＋4℃のシャーレ内のKrebs-Henseleit液(ＫＨ液)、好ましくは純酸素で暴気したＫＨ液中に入れ、灌流用のカテーテルを大動脈に固定し、ＫＨ液、好ましくはO₂-CO₂混合ガスで連続暴気しているＫＨ液で満たされ、37℃に暖められた灌流液を、灌流ポンプによる一定流量で大動脈カテーテルに送り込むことにより、心臓の灌流液による灌流蘇生が図られる(Langendorff法による)。
【００１４】
哺乳類動物の臓器保存で問題となるのは、保存後果して臓器のどの組織が生存しているかどうかを検証しなければならないという点である。その手法としては、組織解剖学的手法、実際に移植して検証する移植法、電気生理学的手法などがあるが、これらいずれの手法を採用するにせよ、それぞれの組織細胞が生存しているか否かを検証しなければならない。
【００１５】
本発明にあっては、組織細胞の検証方法として、電気生理学手法、例えば心臓の場合にあっては心電図が好ましい方法として用いられる。この方法は、神経細胞組織の活動がリアルタイムが記録できることが大きなメリットであり、神経細胞の活動が消滅した時点で細胞死が生じたものと判断することができる。
【００１６】
【発明の効果】
本発明方法により、哺乳類動物の摘出臓器の保存日数を大幅に増加させることができ、実際に心臓の神経系に過度の損傷を起こすことなく約20日間以上の保存を可能とさせる。
【００１７】
【実施例】
次に、実施例について本発明を説明する。
【００１８】
実施例
アメリカのＮＩＨの実験動物基準に合わせて、人工繁殖した７週令のWistar系雄ラット(体重300g)を実験動物として使用し、このラットにネンプタール麻酔薬を投与した後、心電図を記録した。その後、ラットの心臓を摘出し、純酸素で暴気したＫＨ液に117ミリモルのトレハロースを混合した液に浸し、摘出した心臓に付着している血液を洗浄した。
【００１９】
上記と同じ混合液で摘出心臓の大動脈および大静脈にカテーテルを挿入し、心臓内を灌流させて脱血した後、ボール型の金網にシリカゲル9〜10g(心臓の水分量を60%近く除去する量)入れ、その上に前処理を終了した摘出心臓を置き、予め純酸素を１分間暴気した4℃のパーフルオロカーボン液(住友3M製品フロリナートFC77；C₈ F ₁₈)500ml中に浸せきし、これを容量500mlの密閉瓶中に封入し、冷蔵庫内に保存した。
【００２０】
10日後、保存液中から心臓を取り出し、シリカゲルをピンセットで除去した後、4℃のシャーレ内のＫＨ液に入れ、灌流用のカテーテルを大動脈に綿糸で固定し、定流量灌流装置にセットした。O₂-CO₂(容量比95:5)混合ガスで連続暴気しているＫＨ液で満たされた灌流液貯留槽から導かれた灌流液は、恒温槽内のガラス蛇管内で37℃に暖められた後、灌流ポンプ(Cole-parmar Instrument社製Masterflex Model No.7520-10)により、毎分6ml/g（心臓重量）の一定流量で、大動脈カテーテルに送り込んだ。
【００２１】
組織細胞が生命を維持していれば、自動的に蘇生し、神経反応が出現することが知られているが、摘出心臓を所定温度で灌流を開始させ、灌流中左心室と大動脈開口部に心電図記録用電極を装着し、双曲誘導で心電図を生体アンプ(NEC三榮製Bioview-E)を用いて連続記録した。
【００２２】
このような一連の処置および操作は、具体的には以下に示される。
【００２３】
実験例１
RO16のラットは、1998年７月７日15時10分にネンブタール麻酔下で開胸して心臓を摘出し、脱血灌流した。前処理を終了した摘出心臓の重量は、1.240gであった。
【００２４】
10日後の1998年７月16日17時20分に、4℃のパーフルオロカーボン保存液から摘出心臓を取り出し、シリカゲルを除去した灌流開始前の心臓の重量は0.774gであり、保存中に心臓組織細胞内の水分は約38%シリカゲルに吸収されていた。
【００２５】
その後、大動脈にカテーテルを挿入し、綿糸で固定して、定流量灌流装置にこの摘出心臓をセットし、17時25分より37℃で灌流を開始した。摘出心臓は蘇生し、図１(18時31分記録、心拍数毎分40回)に示されるような心表面心電図が記録された。その後、18時47分には心拍数が毎分27回まで低下した。
【００２６】
実験例２
RO20のラットは、1998年７月10日17時30分に開胸して心臓を摘出し、脱血灌流した。前処理を終了した摘出心臓の重量は、1.521gであった。
【００２７】
20日後の1998年７月30日15時12分に、保存液から摘出心臓を取り出し、シリカゲルを除去した灌流開始前の心臓の重量は1.063gであり、保存中に心臓組織細胞内の水分は約30%シリカゲルに吸収されていた。
【００２８】
その後、大動脈にカテーテルを挿入し、綿糸で固定して、定流量灌流装置にこの摘出心臓をセットし、15時13分に32℃で灌流を開始した。摘出心臓は蘇生し、図2(15時19分記録、心拍数毎分42回)に示されるような心表面心電図を記録することができた。
【００２９】
実験例３
RO29のラットは、1998年７月26日14時40分に開胸して心臓を摘出し、脱血灌流した。前処理を終了した摘出心臓の重量は、1.291gであった。
【００３０】
10日後の1998年8月5日16時55分に、保存液から摘出心臓を取り出し、シリカゲルを除去した灌流開始前の心臓の重量は0.832gであり、保存中に心臓組織細胞内の水分は約36%シリカゲルに吸収されていた。
【００３１】
その後、大動脈にカテーテルを挿入し、綿糸で固定して、定流量灌流装置にこの摘出心臓をセットし、17時19分に34℃で灌流を開始した。摘出心臓は蘇生し、図3(17時39分記録、心拍数毎分42回)に示されるような心表面心電図を記録することができた。更に、心臓の活動が視認された。
【００３２】
実験例４
RO33のラットは、1998年７月29日14時40分に開胸して心臓を摘出し、脱血灌流した。前処理を終了した摘出心臓の重量は、1.293gであった。
【００３３】
10日後の1998年8月7日15時58分に、保存液から摘出心臓を取り出し、シリカゲルを除去した灌流開始前の心臓の重量は0.808gであり、保存中に心臓組織細胞内の水分は約38%シリカゲルに吸収されていた。
【００３４】
その後、大動脈にカテーテルを挿入し、綿糸で固定して、定流量灌流装置にこの摘出心臓をセットし、16時15分に36℃で灌流を開始した。摘出心臓は蘇生し、図4(16時19分記録、心拍数毎分108回)に示されるような心表面心電図を記録することができた。更に、実験例３と同様に心臓の活動が視認された。
【００３５】
実験例５
RO34のラットは、1998年７月29日16時01分に開胸して心臓を摘出し、脱血灌流した。前処理を終了した摘出心臓の重量は、1.375gであった。
【００３６】
10日後の1998年8月7日17時48分に、保存液から摘出心臓を取り出し、シリカゲルを除去した灌流開始前の心臓の重量は0.808gであり、保存中に心臓組織細胞内の水分は約38%シリカゲルに吸収されていた。
【００３７】
その後、大動脈にカテーテルを挿入し、綿糸で固定して、定流量灌流装置にこの摘出心臓をセットし、17時57分に約30℃前後で灌流を開始した。摘出心臓は蘇生し、図5(18時11分記録、心拍数毎分66回)に示されるような心表面心電図を記録することができた。
【００３８】
実験例６
RO41のラットは、1998年8月1日14時30分に開胸して心臓を摘出し、脱血灌流した。前処理を終了した摘出心臓の重量は、1.295gであった。
【００３９】
11日後の1998年8月12日17時40分に、保存液から摘出心臓を取り出し、シリカゲルを除去した灌流開始前の心臓の重量は0.797gであり、保存中に心臓組織細胞内の水分は約39%シリカゲルに吸収されていた。
【００４０】
その後、大動脈にカテーテルを挿入し、綿糸で固定して、定流量灌流装置にこの摘出心臓をセットし、17時56分に36℃で灌流を開始した。摘出心臓は蘇生し、図6(18時13分記録、心拍数毎分162回)に示されるような心表面心電図を記録することができた。
【００４１】
参考例
RO51のラットは、1998年8月20日13時16分に開胸して心臓を摘出し、脱血灌流した。前処理を終了した摘出心臓の重量は、1.162gであった。
【００４２】
その後、大動脈にカテーテルを挿入し、綿糸で固定して、定流量灌流装置にこの摘出心臓をセットし、13時25分から灌流を開始した。図7のA(13時45分記録、心拍数毎分171回、灌流温度34℃)、B(17時25分記録、心拍数毎分161回、灌流温度32℃)、C(19時25分記録、心拍数毎分134回、灌流温度32.1℃)およびD(22時02分記録、心拍数毎分17回、灌流温度31.1℃)に示されるような心表面心電図が記録された。この場合において、心電図の振幅が1cm当たり4mVの出力が出現している時点においては心臓が盛んに活動していることを視認することができた。その後、22時22分電位は消失し、神経細胞の活動の停止を示した。
【００４３】
以上の各実験例および参考例から、図７（対照実験）に示した心電図の振幅と同様に、図１〜６に示した10〜20日間の保存後における心表面心電図の振幅は1cm当たり2〜4mVの出力を示していることが確認された。
【００４４】
このことは、10〜20日間の保存後においても、対照実験において心臓が盛んに活動していることが視認される場合の出力値と同程度の出力を示すことより、保存期間中の心臓の神経系については過度の損傷を起こしていないことを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】ラットRO16の摘出心臓を10日後に蘇生させたときの心表面心電図である。
【図２】ラットRO20の摘出心臓を20日後に蘇生させたときの心表面心電図である。
【図３】ラットRO29の摘出心臓を10日後に蘇生させたときの心表面心電図である。
【図４】ラットRO33の摘出心臓を10日後に蘇生させたときの心表面心電図である。
【図５】ラットRO34の摘出心臓を10日後に蘇生させたときの心表面心電図である。
【図６】ラットRO41の摘出心臓を11日後に蘇生させたときの心表面心電図である。
【図７】ラットRO51の摘出心臓を対照実験として記録したときの心表面心電図である。

Claims

哺乳類動物の摘出臓器をトレハロースを溶解させた溶液で浸せき処理した後、30〜60％の脱水量で脱水処理し、次いでパーフルオロカーボン中に浸せきして冷蔵温度に維持することを特徴とする摘出臓器の保存方法。
摘出臓器の脱水処理が摘出臓器の周囲を脱水剤で取り囲むことによって行われる請求項１記載の摘出臓器の保存方法。
トレハロースを溶解させた溶液がKrebs-Henseleit液にトレハロースを溶解させたトレハロース混合液である請求項１または２記載の摘出臓器の保存方法。