WO2002069702A1 - Procede de conservation d'un organe de mammifere - Google Patents

Procede de conservation d'un organe de mammifere Download PDF

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WO2002069702A1
WO2002069702A1 PCT/JP2002/002074 JP0202074W WO02069702A1 WO 2002069702 A1 WO2002069702 A1 WO 2002069702A1 JP 0202074 W JP0202074 W JP 0202074W WO 02069702 A1 WO02069702 A1 WO 02069702A1
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heart
organ
water
gas
dehydration
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PCT/JP2002/002074
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Kunihiro Seki
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Biobank Co., Ltd.
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
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    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids

Definitions

  • the present invention relates to a technique for preserving mammalian organs in vitro for a long period of time.
  • cryopreservation is the mainstream, and the effective storage time for organ transplantation is about 4 to 24 hours.
  • trehalose (CH ⁇ Ou) is a non-reducing disaccharide widely distributed in nature and has been reported to have a stabilizing or protecting effect on the cell membrane structure under various stresses (Crowe JH). , Crowe LM, Chapman D; Science 233, 701-703, 1984 and Wiemken A; Antinei Van Leeunwenhoek. 58, 209-217, 1990).
  • Trehalose has been reported to protect cell membranes when the heart is exposed to 4 ° C low-temperature ischemic injury (Stringham JC, Southhard JH, Hegge J, et all; Transplantation, 58, 287-294, 1992 and Hirata T, Fukuse T, Liu CJ, et all; Surgery, 115, 102-107, 1994). It has been reported that trehalose increases by 10 times in anhydrous state in a high hydrostatic pressure experiment of a viper (Crowe JH, Crowe LM, Chapman D; Science 233, 701-703, 1984 and Crowe JH). , Crowe LM, Chapman D, Aurell Wistorm C; Biochemical Journal, 242, 1-10, 1987). This beetle is a multicellular organism composed of about 40,000 cells and also having nerve cells.
  • the present inventor has discovered that dry beetles and the like can withstand the load of a high water pressure environment as extreme as 600 MPa in perfluorocarbon solution and retain vitality (Kunihiro Seki et al; Nature Vol. .395, No. 6705, pp. 853-854, 29 Oct. 1998, and JP-A-11-289917, the contents of which are incorporated herein by reference).
  • the dry state of the viper is formed by the tan state or the barrel state. Its physiological mechanism is not fully understood, but the viper is dehydrated due to an extremely low water content in the body.
  • the metabolic function of the organ is lowered by lowering the temperature of the organ, and the organ is kept alive.
  • the metabolic function is reduced by lowering the temperature, abundant ions are present in the polar medium, water, which causes cell self-destruction, cell death, and necrosis over time.
  • refrigerated storage has the unavoidable possibility that severe thrombosis and dysfunction rapidly increase as the storage time is prolonged, and there is a qualitative limit to the storage period.
  • Organs preserved by the method disclosed in JP-A-2000-72601 can be used to collect living nerves and stem cells after resuscitation, and the organs themselves or the collected tissues can be used for transplantation medicine.
  • organs themselves or the collected tissues can be used for transplantation medicine.
  • histopathological studies the long-term storage of biomaterials that can resuscitate rather than necrotic specimens is significant.
  • the above-mentioned storage method can prevent the self-destruction of cells and tissues of an organ stored outside a living body over time and greatly increase the number of storage days.
  • the dehydration method depends on a dehydrating agent that comes into contact with the organ. ing. In order to further improve its storage method, it is necessary to search for a better dehydration method. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a method for removing an organ such as a mammalian heart, comprising: a dehydration step of removing water from the organ and leaving a revivable amount of water; and a step of immersing the organ in an inert medium and maintaining the organ at a refrigerated temperature. Regarding how to save.
  • the method for preserving mammalian organs comprises the steps of: extracting water from an organ containing a water content that is physiologically common sense through the vascular system to a weight ratio of about 10 to the total weight of the organ before dehydration.
  • a dehydration step of removing at least about 25% or more of water and leaving about 10 to about 20% or more of water by weight with respect to the total amount of water before dehydration, and immersing the organ in an inert medium. And maintaining the temperature at the refrigeration temperature.
  • the above organs include heart, liver, kidney, And lungs.
  • the method for preserving the heart of a mammal includes a blood removal step of perfusing a physiological saline solution into the heart to replace blood in the heart with a physiological saline solution; A dehydration step of deriving water in the organ to remove about 10 to about 50% by weight of water relative to the total weight of the heart before dehydration, and immersing the heart in an inert medium for about 1 to about 8 ° Maintaining the temperature at the refrigeration temperature of C.
  • the invention may also theoretically include a dehydration step to remove from about 25% to about 60% water by weight relative to the total weight of the heart before dehydration.
  • Dehydration using the vascular system involves delivering gas to the vascular system of an organ or heart.
  • the dehydration step may further include contacting the organ, which is immersed in an inert medium, with a dehydrating agent.
  • a dehydrating agent it is preferable to remove blood from the organ using a physiological salt solution prior to the dehydration step in order to avoid the problem of blood coagulating by contact with the perfused gas.
  • blood removal perfusion where the flow pressure is constant.
  • the gas fed into the vascular system is preferably air, an o 2 —co 2 mixture, but an inert gas such as N 2 , He, Ar, Ne, Kr or Xe is used. May be.
  • an inert gas such as N 2 , He, Ar, Ne, Kr or Xe is used. May be.
  • a perfusion device for perfusing a physiological salt solution and to feed gas instead of the physiological salt solution.
  • liquid to be introduced into the vascular system examples include a solvent that uses an osmotic pressure difference to move water from cells, such as a hypertonic solution having a higher concentration than the body fluid of an organ. Also, an inert medium described later or alcohols may be used.
  • the fluid enters the capillary of the vascular system to generate a fluid pressure, reaches almost all of the organ tissues, and circulates through the capillary (eg, from an arterial blood vessel to a venous blood vessel) to reach the other end of the vascular system. .
  • This dehydration uses the water supply pathway that is unique to the organ, so that individual tissues and cells can be targeted to create a loose and uniform dehydration state.
  • Even multi-cellular and multi-tissue organs of mammals can smoothly transition to a highly dehydrated state without applying unnecessary stress to living tissues. Therefore, usually 10 wt.
  • Even with dehydration of 25 wt% or more, fl organs can reach an extremely stable asphyxia state without ischemic injury or damage to living tissues. Then, when water is regained, the function is restored, and the function of not only the cells and tissues but also the organ itself can be revived.
  • the asphyxia state means a biological asphyxia, but the asphyxia intended in the present invention means that the appearance of life phenomenon is not recognized due to the high dehydration state, but the life phenomenon is resumed when the water is recovered. Means a state that can be recognized.
  • the term “resuscitation” as used in the present invention means a phenomenon in which, when water is regained from a dehydrated state, an electrophysiological reaction of a tissue or biological biological activity as an organ is recognized.
  • the present invention provides a step of forming an oil film on the surface of an organ containing a physiologically common water content, and exposing the heart to a gas to evaporate water in the heart into the gas. Removing more than about 10% by weight of water relative to the total weight of the heart before dehydration, and maintaining the organ at a refrigerated temperature of about 1 to about 8 C, preferably about 2 to about 4. And a method for preserving the heart of a mammal.
  • the present invention also provides a blood removal step of perfusing a physiological saline solution into the heart to replace blood in the heart with a physiological saline solution, a step of forming an oil film on the surface of the removed blood heart, Exposing water to a gas to evaporate the water in the heart into the gas to remove about 10 to about 50% of water by weight relative to the total weight of the heart before dehydration; Maintaining the refrigeration temperature of about 8 ° C to about 8 ° C.
  • biological structures such as biological membranes are less susceptible to attack by substances that can be activated in the aqueous phase, especially metal ions.
  • the biological structure is considered to be protected by being surrounded by crystalline water called bound water.
  • bound water As a result of the removal of the polar medium that degrades living tissues, tissues and cells can escape irreversible decay over time, and qualitative improvements in the preservation of organs can be achieved.
  • trehalose in the preservation solution can contribute to stabilization of the biological structure.
  • the heart, liver, kidney, knee, or lung preserved by the method of the present invention may contain a body fluid warmed to about body temperature or a substitute body fluid, such as the above physiological salt solution, artificial blood and / or blood, in the vascular system.
  • the resuscitated organ could be transplanted into the human body with the organ or tissue taken from the organ. Nervous tissue and other living tissues and cells can be collected from resuscitated organs and used for pharmacological tests.
  • the present invention can be applied to organs of mammals other than humans for the purpose of xenotransplantation into the human body, and thereby provides a technology for preserving animal organs, for which clinical demand is expected to increase due to lack of donors.
  • the present invention is useful for preserving organs that can be mass-produced, such as hearts, livers, and kidneys in cultured fish, and uses a preservation technique that can withstand long-term transport, especially air transport that takes more than ten hours. Will provide.
  • technologies that enable long-term preservation such as the present invention, will help establish an organ bank. For example, it is possible to regenerate desired tissues and organs by culturing totipotent stem cells such as embryonic stem cells, and to apply the present invention to preserving them. Preserving spare organs before the disease is discovered will allow them to receive a transplant immediately after the onset of the disease. Further, the present invention may be useful for preserving the brain and other nervous tissues.
  • the “removal of about 10% or more of water” or “removal of about 25% or more of water” in the present invention is intended to remove body fluids in the vascular system and individual cells and free water between cells.
  • the expression "leave about 10 to about 20% or more of water” as used in the present invention means that the living tissue contains bound water and has a sufficient amount of water for resuscitation.
  • it is considered that what determines the freshness of the preserved organ is mainly the amount of free water, and it is theoretically preferable to remove free water as much as possible in order to prolong the storage time.
  • Bound water is water that can be observed in a hydrated or crystalline state, and free water can be defined as water other than bound water.
  • the vascular system is anatomically classified into the vascular and lymphatic systems.
  • the term "vascular system" as used in the present invention preferably includes a nutritional vasculature for supplying water and nutrients to individual cells of an organ.
  • a perfusion device can be connected to a unique vessel connecting to the atria and ventricles to indirectly apply fluid pressure to the coronary arteries and coronary veins connected to the nutritional vasculature of the heart.
  • a functional vasculature may be used in an organ such as the liver.
  • organ containing a water content that is physiologically common sense in the present invention is typically an organ that has been removed from a living body. It can be understood that the blood is replaced with a physiological salt solution by perfusion for the organ. The amount of dehydration can be specified based on the weight of an organ having such a physiologically normal water content.
  • the “physiological saline solution” referred to in the present invention is a body fluid substitute having the same biological activity as blood, and is typically a known Ringer's solution, for example, a KH (Kreps-Henseleit) solution.
  • a physiological salt solution may be used by dissolving a polysaccharide which will help to stabilize a dehydrated anatomy.
  • polysaccharides are preferably trehalose.
  • amino acids such as malic acid, mannitol, glycerol, glycine benzoin, puline, and ectoin can be used by dissolving them in a physiological salt solution.
  • the "inert medium” referred to in the present invention is a medium that is insoluble in water and oil, and is preferably a fluorcarbon solution which is liquid at the storage temperature, particularly a perfluorocarbon solution. Further, as long as similar conditions are satisfied, not only liquid but also gas, sol or gel may be used. Mercury and silicone oil may be used as other inert media.
  • FIG. 1 is an electrocardiogram recorded in Experiment 8 of Example 3.
  • FIG. 2 is an electrocardiogram recorded in Experiment 9 of Example 3.
  • FIG. 3 is an electrocardiogram recorded in Experiment 1 of Example 4.
  • FIG. 4 is an electrocardiogram recorded in Experiment 2 of Example 4.
  • FIG. 5 is an electrocardiogram recorded in the experiment of Example 5.
  • the organ to be preserved for example, the organ removed by surgery, is washed and bled.
  • a perfusion apparatus for blood removal a known Langendorf f apparatus can be used. The technique of blood removal perfusion is based on the Langendorf f method (Doring H. J, Dehnert H; Biomess tec nik-Ver tag Match Gmb, Germany). , 1988).
  • an organ is attached to the aorta of the vascular system with a perfusion catheter (or force generator), and a trehalose-KH (Kreps-Henseleit) mixture is injected into the vascular system.
  • a perfusion catheter or force generator
  • a trehalose-KH Kerr-Henseleit
  • the physiological salt solution is preliminarily subjected to oxygen aeration (aeration), so that a fresh substitute body fluid is always sent into the organ.
  • oxygen aeration oxygen aeration
  • the temperature of the organ is reduced to 1 to 8 ° C, and the activity of the organ is stopped. Enter the dehydration process following blood removal.
  • the dehydration step is achieved by using the Langendor ff device used for the blood removal.
  • gas is sent from the perfusion device to the vena cava of an organ after blood removal is completed at a predetermined flow pressure instead of a physiological saline solution.
  • the artificial perfusion means is not limited to a means for unilaterally sending gas from the aorta, but includes a closed circulatory system connected between the aorta and the vena cava. That is, the gas perfusion is not limited to a method of feeding a gas, but may be a method of suctioning a vascular system.
  • dehydration proceeds so that the physiological saline solution flows out from the vena cava in the organ.
  • the gas that has entered the blood vessel flows through the individual capillaries to the vena cava side, and the individual cells and intercellular water flow out into the gas flowing through the blood vessel due to their vapor pressure.
  • most of the free water in each tissue and cell is drained out of the organs through the vasculature.
  • the above-mentioned dehydration using the vascular system unlike the treatment in which a dehydrating agent is brought into contact, utilizes the extremely large surface area of the capillaries that are uniformly distributed in the organ, and allows the tissue to grow slowly but in a relatively short time. And individual cells can be dehydrated to a target.
  • This advantage is apparent from the fact that there is less dehydration unevenness compared to the above-mentioned dehydrating agent and the degree of discoloration of the dehydrated organ is not serious.
  • dehydration by gas perfusion actually resulted in a very high resuscitation rate and improved resuscitation status.
  • gas dehydration is an active process that can be controlled from the outside, and is a less stressful and efficient means for organs that require quick and careful handling.
  • the gas delivered to the vascular system may be inexpensive compressed gas packed in commercial cylinders. o 2 - If C 0 2 mixed gas, preferably those containing C_ ⁇ 2 of less than 5%. In the embodiments described later, a dry gas is used, but a gas containing moisture may be used. Furthermore as a gas for dehydration will more preferably may use a N 2, H e, A r , inert gases such as N e, K r or X e. Among the inert gases, Xe is expensive, but the anesthesia of living tissue has been reported, so that the advantage of using Xe for the dehydration of the present invention is expected to be great. The use of an inert gas also has the purpose of avoiding damage to living tissues due to active oxygen.
  • a dehydration method in which a dehydrating agent is brought into direct or indirect contact with an organ during storage can also be used together.
  • a simple method of immersing the dehydrating agent adjusted to a desired volume together with the organ in an inert medium described later is simple.
  • an organ surrounded by silica gel, molecular sieve, zeolite, or the like is housed in a wire mesh, a synthetic fiber net, or the like, which is a material inert to an inert storage medium. Immerse in an inert medium.
  • the amount of the dehydrating agent to be used can be calculated from the water removal rate required for the organ as described below, and the dehydrating agent may be removed, added or replaced at an appropriate timing after immersion.
  • the organ immediately before dehydration contains a substitute fluid and contains physiologically common water content. For long-term storage, remove as much free water as possible from the water content.
  • the amount of water to be removed is defined by a water removal rate (weight ratio) based on the total weight of the organ represented by the following formula.
  • Water removal rate (weight ratio) 100— (total weight of organ after dehydration ⁇ total weight of organ before dehydration x 100)
  • the absolute amount of water molecules in the inside or the state thereof may be specified.
  • NMR is the most widely used technique for studying the state of water in living tissues.
  • water consists of three states: about 8% of water molecules are bound water in which biological molecules such as the inner membrane of cell membranes and proteins and nucleic acids are bound, and about 82 water molecules are: In the free water other than the bound water, the remaining 10% of the water molecules are free water in contact with the outside of the cell membrane.
  • the bound water unlike other water molecules, maintains a certain predominant arrangement and is oriented over several molecular layers based on the water molecules directly bonded to the biopolymer.
  • bound water accounts for about 10 to about 20% and free water for about 80 to about 90% of the total water content in living tissue.
  • the typical total water content is about 80% by mass, based on the total organ weight, and the bound water is 8-16% ⁇ free water is 64-72% by mass.
  • the mass of free water remaining in the rat heart can be reduced to several percent to 40%, but the absolute amount of bound water does not change. Even if the actual water content varies slightly depending on the animal species and organ type, the removal of about 25% or more of the free water by weight relative to the total weight of the organ before dehydration will result in a weight ratio based on the total water content before dehydration. About 10 to 20% or more of water (including bound water) can be left.
  • the percentage of free water allowed for an organ depends on the method of dehydration, type of organ, intended storage period, and other storage conditions. At present, approximately 25-35% is considered safe in rat hearts. For porcine heart, about 10-50%, especially 15-25%, may be appropriate.
  • Dehydrated organs are stored in perfluorocarbon, an inert medium that is insoluble in water and oil.
  • the immersion of the organ in the inert medium is generally performed in a sealed state under normal pressure, and may be performed in a pressurized state as needed. At this time, it may be stored together with the dehydrating agent as described above.
  • the inert medium is preferably aerated with pure oxygen.
  • the "temperature below the refrigeration temperature” in the present invention is about +1 to about + 8 ° C, preferably about +2 to about + 4 ° C, and a predetermined number of days is maintained in this storage state.
  • the free water of the organ is sufficiently removed, it is theoretically possible to store it at the freezing temperature, for example, in liquid nitrogen.
  • the above-mentioned Langendor ff method can be used for resuscitation from the preserved state of the organ.
  • the organ is placed in a KH solution in a petri dish at + 4 ° C, preferably in a KH solution that has been agitated with pure oxygen.
  • a perfusion catheter is fixed to the aorta of this organ, and the KH solution, which has been continuously aerated with an o 2 —co 2 gas mixture and warmed to 37 ° C., is supplied at a constant flow rate by a perfusion pump to the large artery. Feed into catheter. By this perfusion, resuscitation of the organ is achieved.
  • the problem with organ preservation in mammals is that it is necessary to verify which tissues of the organ survive after preservation. These include tissue anatomical methods, transplantation methods for actual transplantation and verification, and electrophysiological methods. Regardless of which approach is used, the first step is to verify whether the tissue cells are alive.
  • an electrophysiological technique for example, an electrocardiographic measurement on the heart was used.
  • the electrocardiogram can record the activity of the nerve cell tissue in real time, and can determine that cell death has occurred when the activity of the nerve cell disappears.
  • the resuscitation state of the organ can be observed by visually confirming the discoloration of the organ tissue and, in the case of the heart, the presence or absence of pulsation.
  • Invention involving formation of oil film and dehydration by exposure to gas
  • the present invention uses the evaporation of water by exposing organs to gas instead of the vascular dehydration described above.
  • the blood removal step and the regenerating step are basically the same as the above-mentioned invention by dehydration from the vascular system.
  • the preservation step may or may not employ the above-described preservation method of immersing an organ in an inert medium. If the organs are not immersed in an inert medium, the dried organs are kept at a refrigerated temperature in a gas of appropriate humidity for the desired storage period.
  • the removed organs are removed from the perfusion device together with the forcenula and immersed in oil.
  • An oil film is formed on the entire surface of the organ. The formation of an oil film can prevent unevenness in the drying rate of the isolated heart, which is threatened by the removal of water under dry gas, and consequent contraction and keratinization of the heart surface.
  • the oil used is preferably harmless to the organs and has a viscosity capable of forming an oil film of an appropriate thickness on the surface of the organs, and is typically silicone oil.
  • Silicon oil is composed of organic silicon oxide polymer and is almost physiologically harmless and chemically inert.
  • the silicone oil used in the examples described below is non-volatile with a kinematic viscosity of 100/2 / S (25 ° C) and is considered to be suitable for protecting the heart surface from overdrying for a long time. It can be visually confirmed that when an oil film is formed on the surface of the heart, physical damage such as cracks on the surface of the heart caused by drying in the absence of oil is reduced.
  • Gas used is typically air, or o 2 - co 2 but the mixed gas can be used, but are not limited to these.
  • the gas for drying ⁇ 2 - CO 2 mixed gas is preferred.
  • a gas containing Xe may be used as the gas for storage. Since xenon is an inert gas without polarity, it can be hydrophobically hydrated with surrounding water to suppress the thermal motion of water molecules. As the structuring of water increases and the molecular movement slows down, the viscosity of water increases, and biological reactions take place via water, so it is thought that increasing the viscosity of water suppresses cell metabolism.
  • xenon as a storage gas, in addition to the removal of free water and maintenance at low temperatures, further suppresses organ metabolism.
  • Xenon is known to have a dissociation pressure (0 ° C) of 1.15 atm (0.1115M Pa), which makes it easier to form gas hydrates at relatively low pressure. Therefore, when using xenon, the organs should be stored under pressure. In a pressurized environment, organs (cells It is thought that the solubility of xenon in the aqueous phase inside (including inside and outside) is increased. It is presumed that pressurization of xenon surrounding the organ promotes the structuring of water in the organ and significantly suppresses organ metabolism.
  • the dehydration method using gas exposure includes, for example, putting a degassed organ in a sealed container kept at refrigeration temperature with a silica gel desiccant, and drying the organ for a predetermined period. Exposure to exposed gas.
  • the dehydration rate to be achieved depends on the weight of the organ, but is 10-50% of the total organ weight before dehydration. However, under the same drying conditions, the achieved dehydration rate depends on the size (weight, etc.) of the organ, so it is considered preferable to apply drying conditions taking this into account.
  • the time for dehydration depends on the weight of the organ and the amount of desiccant. For example, a rat heart is about 24 to 48 hours, and a bush heart is about a week, but not limited thereto. After each of these drying periods, the organs may be stored in an inert medium.
  • a high dehydration rate desirable for long-term storage can be achieved without damaging the organ. Due to less damage to the organs, resuscitation is very good during relatively short-term storage, and the resuscitation rate increases with long-term storage.
  • Example 4 the pig organ was successfully revived after 37 days. It was confirmed that the myocardial tissue of the organ was revived during the period in which the organ decayed by conventional refrigerated storage.
  • Example 1 Storage of rat heart dehydrated via vascular system
  • Rats were intraperitoneally injected with 0.25 ml of neptal and 5 mg of heparin sodium (Heparin Sodium Salt), and weighed before starting heart extraction.
  • the excised heart insert the catheter into the aorta placed in a constant temperature bath, dissolving the trehalose 117 thigh ol 95 ⁇ 2 - 5% C_ ⁇ 2 gas mixture with the KH solution aerated, Langendorf f formula Perfusion was performed. The temperature of the thermostat was lowered to stop the heart, and the blood removal and perfusion was completed.
  • the perfusion apparatus After measuring the weight of the heart, the perfusion apparatus sent the above 95% O 2 — 5 C 5 2 mixed gas to the heart to start dehydration. Start dehydration while weighing the heart and recording the water removal rate One hour and 30 minutes after, the gas perfusion was stopped. The total weight of the heart was measured with the outer surface simply wiped off moisture.
  • the dehydrated heart is immersed in 500 ml of 4 perfluorocarbon solution (Florinato FC77; C8 F17, manufactured by Sumitomo 3LM Co., Ltd.) which was previously agitated with pure oxygen for 1 minute, and placed in a sealed container. And stored in the refrigerator.
  • 4 perfluorocarbon solution Fluorocarbon solution
  • the preserved heart was removed from the perfluorocarbon solution, a catheter was introduced into the aorta, and resuscitation was performed by 1 angendor ff perfusion using a warm KH solution in which the above gas mixture was violated. .
  • Example 2 Storage of rat heart dehydrated via vascular system
  • a solution of 5 mg of heparin sodium dissolved in 0.3 ml of physiological saline was intraperitoneally administered.
  • a catheter was inserted into the aorta of the removed heart and ligated with a cotton thread.
  • the isolated heart into which the catheter had been inserted was attached to a constant flow perfusion apparatus, and a KH solution at 27 ° C in which trehalose was dissolved in 117% was perfused at 3.2 ml / min.
  • the KH solution was constantly aerated with a gas mixture of 95% 0 2 — 53 ⁇ 4 C ⁇ 2 .
  • the heart was dried by perfusing air gas at a flow pressure of 0.1 kgf / cm 2 from one ter. After measuring the weight of the dried heart, it was immersed and stored in PFC kept at 4 ° C while constantly aerating with a mixed gas. Four hours later, the heart was taken out of the preservation solution, attached to a constant flow perfusion apparatus, and perfused with a KH solution at 27 ° C constantly aerated with a mixed gas at 3.2 ml / min. It is known that, when the isolated heart starts perfusion again after storage, if the tissue cells are still alive, they will be resuscitated autonomously and neural activity will appear. Electrodes were attached to the resuscitated heart, and surface electrocardiograms were recorded with a pen oscillograph.
  • the experiment was performed in the same manner as in Experimental Example 12 except that the storage time was changed to 16 hours.
  • silicone oil was applied to an isolated heart from a rat, and the heart was stored at 4 ° C. for 3 days under the pressure of dry gas.
  • the rats used in this experiment were 7-week-old male Wistar strains (300 g) that had been artificially bred in accordance with the NIH laboratory animal standards in the United States.
  • the heart was extirpated from the rat, and the heart was bled. After that, 2 ml of a cardiomyopathy (Mi 0 teeter Mochida Pharmaceutical) was injected through a catheter to stop the heart.
  • a cardiomyopathy Mi 0 teeter Mochida Pharmaceutical
  • the surface of the heart was coated with silicone oil (WF-30 Wako Pure Chemical), wrapped in sterile gauze (120 X I 20 mm), and placed in a standard bottle (60 ml).
  • the bottle containing the heart was placed in a pressure-resistant chamber lined with silica gel and sealed.
  • a mixed gas (95% oxygen, 5% carbon dioxide)
  • the mixed gas was sealed to 0.2 MPa.
  • the chamber was stored in a refrigerator at 4 degrees Celsius.
  • the chamber was opened every 24 hours and silicone oil was reapplied to the isolated heart.
  • the heart was removed from the silicon oil in the chamber and set in a constant-pressure perfusion apparatus.
  • the isolated heart started perfusion at 37 degrees Celsius.
  • ECG recording electrodes were attached to the left ventricle and the aortic orifice, and electrocardiograms were continuously recorded by hyperbolic lead using a biological amplifier (Bioview-ENEC Sanei).
  • cardioplegic solution cardioprotective solution
  • the gas sealed in the chamber was changed, and the drying period was changed. After the drying period, the sample was immersed in a preservative solution (silicone oil) and stored under pressure in a chamber as in the case of drying.
  • a preservative solution silicone oil
  • Heart weight before starting resuscitation 0.89 g (35% moisture removal)
  • Heart weight before storage 1.37g
  • FIG. 1 is a heart surface electrocardiogram in this experiment (21:04 measurement). Heart weight before storage: 1.61g
  • Figure 2 shows the heart surface electrocardiogram in this experiment (20:25 measurement)
  • the heart was exposed to a gas mixture to dehydrate and stored under the gas mixture for 7-8 days.
  • the oil-coated heart was wrapped in polyurethane foam and placed in a container (bottle), and the entire container was placed in a chamber and replaced with a mixed gas. It was kept in a refrigerator at a refrigerated temperature of 2-4 ° C. The organs were removed daily and reapplied with silicone oil.
  • FIG. 3 is an electrocardiogram of the surface of the heart resuscitated after 7 days of storage.
  • the oil-coated heart was wrapped in polyurethane foam and placed in a container (bottle), and the entire container was placed in a chamber and replaced with a mixed gas. It was kept in a refrigerator at a refrigerated temperature of 2-4 ° C. The organs were removed daily and reapplied with silicone oil.
  • FIG. 4 is an electrocardiogram of the heart surface resuscitated after 8 days of storage.
  • Example 5 Long-term storage of pig heart dehydrated by exposure to gas
  • long-term storage (37 days) was attempted by applying dehydration by exposing a pig heart to gas.
  • the organs were removed 37 days after the start of dehydration and perfused for resuscitation.

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Description

明細書 哺乳類動物の臓器保存方法 技術分野
本発明は、 哺乳類動物の臓器を生体外で長期間保存する技術に関する。 背景技術
人間の肺臓、 心臓、肝臓、 腎臓、 塍臓等の臓器の臨床移植治療は、 既に実用化され、 日常化されているが、 年々増加する移植待機患者に対するドナー不足の問題が深刻化 し、 手術迄の待機時間が延長している。 また、 臓器移植のドナーが出現しても、 血液 のように長期間の保存や供給体制の整備が十分なされていないのが現状である。
特に移植臓器にあっては、 低温保存が主流であり、 11器移植に有効な保存時間は、 約 4〜24時間が保存限界である （Cooper JD, Patterson GA, Trulock EP et all; J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 107, 460-471, 1994)。
実際に、 University of insconsin Solution液（UWS液）を使用したラッ.ト、 ゥ サギ、 ヒヒの摘出心臓の低温保存および蘇生にあっても、 6〜18 時間が限度である (Makowka I, Zerbe TR, Charapman F, et all; Transplant Proc. 21, 1350, 1989 and Yen T, Hanan SA， Johson DE, et all; Ann. Thorac. Surg. 49, 932, 1990)。
また、 この UWS液とパーフルォロカーボン媒体とを組合せて用い、 ラットの心臓 を保存し、 移植に成功したのは、 2 時間（5匹全部)から 48時間（5匹中 4匹)である
(Kuroda Y, Kawamura T, Tan i oka T, et all; Transplantation, 59, 699-701， 1995)。 この理由は、 摘出心臓が 4°Cの低温ゃ虚血傷害に曝されると、 細胞膜に損害が与えら れるため、 組織細胞が蘇生できないことによる （PeggDE; Organ presevat ion. Surg. Clin. Notth Am. 66, 617, 1986: OzMC, Pinsky DJ, Koga S, et all; Circulation 88, 291-297, 1993: and Heffner JE, Pepine JE; Rev. Pespir. Dis. 140, 531-554, 1989)。 哺乳動物の生体組織の長期間にわたる保存 ·蘇生の技術は、 血液、 精子、 卵子のよ うな単細胞のみで開発が進んでいる。 これは、 細胞の集まりである組織又は幾つかの 組織からなる臓器の低温保存に関しても実用化が進みつつあるが、 いずれにしても、 最大 24時間以内に移植を行わなければならないのが現状である （kalayoglu M, Sol linger HW, Strarra RJ, et all; Lancet, 2, 617, 1988)。
因みに、 トレハロース （C H^Ou) は、 自然界に広く分布する非還元性の二糖 類であり、 様々なストレス下において、 細胞膜構造の安定化ないし保護作用を有する ことが報告されている (Crowe JH, Crowe LM, Chapman D; Science 233, 701-703, 1984 and Wiemken A; Antinei Van Leeunwenhoek. 58, 209-217, 1990)。 トレハロースは、 心臓が摂氏 4度の低温ゃ虚血障害に曝されると細胞膜に対して保護作用を示すことが 報告されている (Stringham JC, Southhard JH, Hegge J, et all; Transplantation, 58, 287-294, 1992 and Hirata T, Fukuse T, Liu CJ, et all; Surgery, 115, 102- 107, 1994)。. また、 クマムシの高静水圧実験において、 無水状態になるとトレハロー スが 10倍も増大することが報告されている（Crowe JH, Crowe LM, Chapman D; Science 233, 701-703, 1984 and Crowe JH, Crowe LM, Chapman D, Aurell Wistorm C; Biochemical Journal, 242, 1-10, 1987)。 このクマムシは、 約 40， 000個の細胞で構 成され、 神経細胞も持っている多細胞生物である。
本発明者は、乾燥状態のクマムシ等がパーフルォロカ一ボン液中では極限の 600Mpa というような高水圧環境という負荷にも耐え、 生命力を保持していることを発見した (Kunihiro Seki et al; Nature Vol.395, No.6705, pp.853-854, 29 Oct.1998, 及び特 開平 11-289917号；この内容は参照により本明細書に取り込まれる）。クマムシの乾燥 状態はタン状態または樽状態によって形成される。 その生理的メカニズムは、 十分に 解明されてはいないが、 クマムシは体内の水分量が極端に減少し、 脱水状態となって いる。
上述の従来における臓器の冷蔵保存は、 臓器の温度を下げることでその代謝機能を 低下させてその生存状態を維持するものである。 温度低下により代謝機能は低下する が、 極性媒体である水分中に豊富なイオンが存在し、 これらが細胞の自己崩壊、 細胞 死、 壊死 (Necrosis) を経時的に引き起こす原因となる。
したがって、 冷蔵保存は、 保存時間が長引くほど深刻な血栓や機能障害が急増する という可能性を不可避的に有し、 その保存期間には質的な限界がある。
他方で、 一般に動物の組織細胞は水分がなければ生存し得ない。 異種組織で構成さ れる高等な臓器であれば、 乾燥状態からの蘇生は不可能であると容易に予想される。 従来において植物や各種細菌類を乾燥保存する技術は既に開発されているが、 高等動 物の器官そのものを乾燥保存後に蘇生させた実験は例を見ない。
本発明者は、 驚くべきことに、 一定の条件下で哺乳類動物の摘出臓器から多量の水 分を除去してその臓器を不活性溶媒中に浸せきして低温で保存したとき、 クマムシが 樽状態で長期間生命を維持しているときと同じような仮死状態 （apparent death) に 至ることを発見した（特開 2000- 72601：この出願はその参照により本明細書に取り込 まれる）。
特に驚くべきことは、 哺乳類動物の多細胞且つ多組織の臓器が極度の脱水状態から 蘇生し、 また、 蘇生した心臓の拍動が確認されたことである。 その臓器の各細胞は酸 素消費量が正常時の 1/1000 以下まで極端に低下し又は酸素消費が実質的に停止した 仮死状態にあると考えられる。
特開 2000-72601に開示された方法により保存された臓器は、蘇生後に生きた神経や 幹細胞を採取しうるし、 臓器自体又は採取された組織を移植医療に利用することがで きる。 また、 病理組織学的研究において、 壊死した標本ではなくを蘇生可能な生体材 料を長期保存できることは大きな意味がある。
上記保存方法は、 生体外に保存される臓器の細胞や組織の経時的な自己崩壊を防止 して保存日数を大幅に増加しうるが、 その脱水方法は、 臓器に接触する脱水剤に依拠 している。 その保存方法の更なる改良のため、 より優れた脱水方法を探求する必要が ある。 発明の開示
本発明は、 臓器から水分を除去し且つ蘇生可能な水分量を残す脱水工程と、 臓器を 不活性媒体に浸せきして冷蔵温度に維持する工程とを含む、 哺乳類動物の心臓のよう な臓器の保存方法に関する。
本発明による哺乳類動物の臓器の保存方法は、 生理学上常識的な水分量を含む臓器 から、 その脈管系を通じて該臓器内の水分を導き出すことにより脱水前の臓器総重量 に対する重量比で約 10%以上又は 25%以上の水分を除去し、且つ脱水前の総水分量に対 する重量比で約 10〜約 20%以上の水分を残す脱水工程と、該臓器を不活性媒体に浸せ きして冷蔵温度に維持する工程とを含む。 上記臓器は、 心齓 肝臓、 腎臓、 勝臓およ び肺臓からなる群より選択され得る。
本発明による哺乳類動物の心臓の保存方法は、 心臓へ生理的塩類溶液を灌流して心 臓内の血液を生理的塩類溶液に置換する脱血工程と、 脱血した心臓から、 その血管系 を通じて該臓器内の水分を導き出すことにより脱水前の心臓総重量に対する重量比で 約 10〜約 50%の水分を除去する脱水工程と、該心臓を不活性媒体に浸せきして約 1〜 約 8°Cの冷蔵温度に維持する工程とを含む。 また、 この発明は、 理論的には、 脱水前 の心臓総重量に対する重量比で約 25〜約 60%の水分を除去する脱水工程も含みうる。 上記脈管系を利用した脱水は、臓器又は心臓の脈管系へ気体を送り込むことを含む。 例えば、 心臓の大動脈へ気体を灌流すると、 該気体の流れにより該心臓の血管系から 水分が導き出される。 即ちその気体の流圧により水分が臓器の外へ押し出される。 流 圧は一定圧が好ましい。 更に、 上記脱水工程が、 臓器に不活性媒体に浸させている該 臓器に脱水剤を接触させることを更に含むこともできる。特に気体を用いた脱水では、 血液が灌流気体に触れて凝固する問題を回避するために、 脱水工程に先立ち、 生理的 塩類溶液を用いて臓器を脱血処理することが好ましい。 最も好ましいのは、 流圧が一 定圧である脱血灌流である。
脈管系に送り込む気体は、 好ましくは空気、 o 2— co2混合気体が使用されるが、 N 2、 H e , A r、 N e、 K r又は X eのような不活性気体が使用してもよい。 例え ば、 生理的塩類溶液を灌流するための灌流装置を用いて、 その生理的塩類溶液の代わ りに気体を送り込むことで可能である。 脈管系への気体灌流により、 臓器内の体液は 押し出され、 そして、 細胞の一つ一つから毛細管を経て水分が導き出される。
脈管系に送り込む液体としては、 臓器の体液よりも濃度の高い高張液のように浸透 圧差を利用して細胞から水分を移動させる溶媒がある。 また後述の不活性媒体、 或い はアルコール類でも可能であろう。
上記脈管系の毛細管へ入り込んで流圧を生じ、 臓器組織全体にほぼ等しく到達し、 ， そして、 毛細管を循環 （例えば動脈血管から静脈血管へ） して脈管系の他端へ達しう る。 この脱水は、 臓器に固有の水分供給経路を利用するため、 個々の組織や細胞を標 的にしてゆつくりと均一な脱水状態を作りだすことができる。 哺乳類動物の多細胞且 つ多組織の臓器であっても生体組織に無用なストレスをかけずにスムーズに高度の脱 水状態へ移行できる。 したがって、 通常は生体組織にストレスとなる 10wt 以上又は 25wt%以上の脱水であっても、 fl 器は虚血障害や生体組織の損傷を伴わずに極めて安定 した仮死状態へ至ることができる。 そして、 水分を取り戻したときに機能を復帰し、 その細胞や組織のみならず臓器自体の機能が蘇生しうる。
一般に仮死状態とは生物学的仮死を意味するが、 本発明で意図する仮死とは、 高度 の脱水状態によつて外観上の生命現象は認められなくなるが、 水分を取り戻したとき に再び生命現象が認められうる状態を意味する。 本発明にいう 「蘇生」 とは、 その脱 水状態から水分を取り戻したときに組織の電気生理学な反応、 又は器官としての生物 学的な生命活動が認められる現象を意味する。
他の側面において、 本発明は、 生理学上常識的な水分量を含む臓器の表面にオイル 膜を形成する工程と、 該心臓を気体に曝して該心臓内の水分を該気体中へ蒸発させる ことにより、 脱水前の心臓総重量に対する重量比で約 10%以上の水分を除去する工程 と、 該臓器を約 1〜約 8 C、 好ましくは約 2〜約 4での冷蔵温度に維持する工程とを含 む、 哺乳類動物の心臓の保存方法に関する。
また、 本発明は、 心臓へ生理的塩類溶液を灌流して心臓内の血液を生理的塩類溶液 に置換する脱血工程と、 脱血した心臓の表面にオイル膜を形成する工程と、 該心臓を 気体に曝して該心臓中の水分を該気体中へ蒸発させることにより、 脱水前の心臓総重 量に対する重量比で約 10〜約 50%の水分を除去する工程と、該臓器を約 1〜約 8°Cの冷 蔵温度に維持する工程とを含む、 哺乳類動物の心臓の保存方法に関する。
本発明の方法により臓器の組織及び細胞から自由水が除去されると、 生体膜等の生 体構造は水相中で活性化しうる物質、 特に金属イオンによる攻撃を受け難くなる。 ま た、 その生体構造は、 その周囲を結合水と呼ばれる結晶状態の水で取り囲まれ保護さ れていると考えられる。 生体組織を劣化させる極性媒体が除去される結果、 組織や細 胞は不可逆的な経時的崩壊を逃れることができ、 臓器の保存状態の質的な改善が図ら れる。 またこのとき、 保存液中のトレハロ一スは生体構造の安定化に寄与しうる。 本発明の方法により保存された心臓、 肝臓、 腎臓、 膝臓又は肺臓は、 その脈管系に 体温程度に暖められた体液又は代用体液、 例えば上記生理的塩類溶液、 人工血液及び /又は血液を灌流することで蘇生しうる。 蘇生した臓器は、 その臓器又はその臓器か ら採取した組織を人体へ移植することができるであろう。 また、 蘇生した臓器から、 神経組織、 その他の生きた組織や細胞を採取して薬理試験などに使用できる。 また、 本発明は、 人体への異種移植を目的としたヒトを除く哺乳類動物の臓器に適 用でき、 それによりドナ一不足によって臨床上の需要増大が見込まれている動物臓器 の保存技術が提供される。 特に本発明は、 養殖ブ夕の心臓、 肝臓、 塍臓などの量産さ れうる臓器の保存にも有用であり、 長時間の輸送、 とりわけ十数時間を越える航空輸 送に耐えうる保存技術を提供するであろう。
また、 本発明のように長期保存を可能とする技術は、 臓器バンクの設立に役立つで あろう。 例えば、 胚性幹細胞のように全能性を有する幹細胞を培養して所望の組織や 器官を再生し、 それらの保存に本発明を適用することが可能である。 疾病が発見され る前に予備の臓器を保存しておくことで、 発病後直ちに移植を受けることができるで あろう。 さらに本発明は、 脳やその他の神経組織等の保存にも有用であろう。
用語の定義 ,
本発明にいう 「約 10%以上の水分の除去」又は「約 25%以上の水分の除去」 とは、 脈 管系内の体液並びに個々の細胞及び細胞間の自由水の除去を意図している。 また、 本 発明にいう 「約 10〜約 20%以上の水分を残す」 とは、 生体組織内に結合水を含み、 蘇 生に充分な量の水分を有することを意図している。 本発明において、 保存臓器の鮮度 を左右するものは主に自由水の量であると考えられ、 理論上、 保存時間の長期化のた めには自由水を可能な限り除去することが好ましい。 また、 蘇生能力を維持するため には、 結合水が維持される範囲の水分量を残すことが好ましい。 結合水とは、 水和状 態又は結晶状態を観測できる水であり、 自由水とは結合水以外の水と定義することが できる。
脈管系は、解剖学上、 血管系とリンパ系に分類される。 本発明にいう 「脈管系」 は、 好ましくは臓器の個々の細胞へ水分及び養分を補給するための栄養血管系を含む。 ま た、 心臓であれば心房及び心室に繋がる固有の脈管に灌流装置を接続して、 心臓の栄 養血管系に繋がる冠状動脈および冠状静脈へ間接的に流圧をかけることができる。 さ らに、 肝臓のように栄養血管系とは別に門脈循環に関する機能血管系を有する臓器で は、 そのような機能血管系を利用してもよい。
本発明にいう 「生理学上常識的な水分量を含む臓器」 とは、 典型的には生体から摘 出後された状態の臓器であり、 また、 例えば脱血工程を含む発明では、 脱血のための 灌流によりその血液が生理的塩類溶液に置換された状態の臓器であると理解しうる。 そのような生理学上正常な水分量を有する臓器の重量を基準として、 上記脱水量を特 定することができる。
本発明にいう 「生理的塩類溶液」 は、 血液と同様の生物学的活性を備えた代用体液 であり、 代表的には公知のリンゲル液、 例えば KH (Kreps-Henselei t) 液である。 こ の種の生理的塩類溶液には、 脱水状態の生体構造の安定を助けるであろう多糖類を溶 解して使用してもよい。 その種の多糖類はトレハロ一スが好ましい。 また、 他の生体 構造物質としては、 リンゴ酸、 マンィトール、 グリセ口一ル、 グリシンべ夕イン、 プ 口リン、 ェクトインなどのアミノ酸も、 生理的塩類溶液に溶解して使用しうる。
本発明にいう 「不活性媒体」 は、 水及び油に不溶性の媒体であり、 保存温度で液状 のフルォロカ一ボン液、 特にパ一フルォロカ一ボン液が好ましい。 また、 それに似た 条件を満足すれば、 液体に限らず、 気体、 ゾル又はゲルを使用してもよい。 また、 そ の他の不活性媒体として、 水銀やシリコーンオイルを使用し得る。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 3の実験 8で記録された心電図である。
図 2は、 実施例 3の実験 9で記録された心電図である。
図 3は、 実施例 4の実験 1で記録された心電図である。
図 4は、 実施例 4の実験 2で記録された心電図である。
図 5は、 実施例 5の実験で記録された心電図である。 発明を実施するための好ましい形態
脈管系を利用した脱水を含む発明の形態
一般に血液は気体に触れたり低温に曝されると固まつて血栓を起こし、 これは後述 の脱水や蘇生の妨げになる。 そこで、 保存対象の臓器、 例えば手術により摘出された 臓器は洗浄され、 脱血される。 脱血のための灌流装置としては公知の Langendorf f の 装置を使用でき、 その脱血灌流の技術は、 Langendorf f 法 （Doring H. J, Dehnert H; Bi omess tec nik-Ver tag Match Gmb, Germany, 1988) として当業者に知られている。 Langendor f f 法に従い、 臓器は、 その血管系の大動脈に灌流用のカテーテル （又は力 ニュ一レ） が取り付けられ、血管系へトレハロース— KH (Kreps-Henselei t) 混合液を 送り込み、 臓器の血液を生理的塩類溶液に置換する。 この生理的塩類溶液には、 予め 酸素が暴気 （エアレーシヨン） されて臓器内は常に新鮮な代用体液が送られる。 この 灌流による脱血時に臓器の温度を 1〜8°Cまで下げ、臓器の活動を停止させる。脱血に 引き続き、 脱水工程に入る。
脱水工程は、 上記脱血に用いた Langendor f f の装置を利用することで達成される。 例えば、 脱血が完了した臓器の大静脈へ、 その灌流装置から生理的塩類溶液の代わり に所定の流圧で気体を送り込む。 また、 人工の灌流手段は、 気体を大動脈から一方的 に送り込む手段に限らず、 大動脈と大静脈との間に接続された閉循環系を含むことは 当業者に容易に理解される。 すなわち、 上記気体灌流は、 気体を送り込む方法に限ら ず、 脈管系内を吸引する方法でもよい。
上記灌流装置によつて脈管系へ流圧がかかると、 臓器内の大静脈側から生理的塩類 溶液が流出するようにして脱水が進む。 好ましくは、 血管内へ入り込んだ気体は個々 の毛細血管を通って大静脈側へ流れ、 そして、 血管内を流れる気体中へ個々の細胞及 び細胞間の水分がその蒸気圧によって出ていく。 最終的には各組織及び細胞内の自由 水の大部分が血管系を通つて臓器の外へ排出される。
上記血管系を利用した脱水は、 脱水剤を接触させる処理と異なり、 臓器内に均一に 分布する毛細血管の極めて広大な表面積を利用したものであり、 ゆっくりとであるが 比較的短時間に組織および個々の細胞を標的に脱水しうる。 この利点は、 上記脱水剤 と比較して脱水ムラが少なく、 脱水された臓器の変色具合も深刻ではないことから明 らかである。 後述の実施例で示すように、 気体灌流による脱水では、 実際に蘇生率が 非常に高く、 蘇生状態の改善が見られた。 また、 気体による脱水は、 外部から制御の 効く能動的な処理であり、 迅速かつ慎重な取り扱いを求められる臓器にとってストレ スが少なく且つ効率的な手段である。
脈管系に送り込む気体は、 市販ボンベに詰められた安価な圧縮気体でよい。 o 2— C 02混合気体であれば、 5%未満の C〇2を含むものが好ましい。 また、 後述の実施例 では乾燥気体を用いるが湿気を含む気体を用いてもよい。さらに脱水用の気体として、 より好ましくは N 2、 H e、 A r、 N e、 K rまたは X eのような不活性気体を使用 しうるであろう。 不活性気体のなかでも、 X eは高価であるが、 生体組織への麻酔作 用が報告されているので、 X eを本発明の脱水に使用する利点は大きいと予想される。 また、 不活性気体を使用することは、 活性酸素による生体組織の損傷を回避する意味 もある。
上記気体港流による脱水に加え、 保存時に脱水剤を臓器に直接又は間接的に接触さ せる脱水方法を補助的に併用することもできる。
'脱水工程において脱水剤を使用する場合は、 所望の容量に調整された脱水剤を臓器 と共に、 後述の不活性媒体中に浸せきする方法が簡易である。 具体的には、 例えばシ リカゲル、 モレキュラーシ一ブ、 ゼォライト等で取り囲んだ臓器を、 保存用の不活性 媒体に対して不活性な材質である金網、 合成繊維ネット等の中に収容し、 これらを不 活性媒体中に浸せきする。
使用する脱水剤の量は、その臓器に必要とされる後述の除水率から計算でき、また、 浸せき後に、 脱水剤を適当なタイミングで除去、 追加又は交換してもよい。
また、 本発明者によるクマムシの実験では、 高湿度、 好ましくは湿度 80%の環境下 で脱水処理を行ったときに蘇生率 100%が達成された。 このことを考慮すると、臓器も 高湿度下で脱水処理することが好ましいと考えられる。
上記気体灌流の条件の一例は、 ラットの心臓の大動脈に 0. 05〜0. 2kgf/cm 好まし くは O. lkgf/cm2の流圧で、 1時間〜 1時間 30分以上、 空気を灌流する。 最も好ましく は一定圧での灌流である。 このような空気の灌流により、 その脱水直前の臓器に対し て 25wt%以上の除水率を達成しうる。
脱水直前の臓器は、 代用体液を有し生理学上常識的な水分量を含むものであり、 長 期保存のためにはその水分量から可能な限り多量の自由水を除去する。 本発明では、 除去すべき水分量を、下記式で表される臓器総重量を基準とした水分除去率（重量比） で規定する。
水分除去率 （重量比） = 100— （脱水後の臓器総重量 ÷脱水前の臓器総重量 X 100) 上記脱水状態を特定するにあたり、 重量比としての水分除去率のほか、 NMRを用い て臓器内の水分子の絶対量やその状態を規定してもよい。 NMRは生体組織中の水の状 態の研究に最も広く用いられてきた手法である。
NMRを用いた生体組織中の水についての最初の研究は、 Bel ton, P. S.， Jackson, R. R. ,
Packer, K. J.： Pul sed NMR s tudi es of water in s trained musc l e, I. Transverse nuclear spin rel axat i on t imes and f reez ing ef fects ； Biochem. Biophys. Acta. 286 : 16-25 (1972)により報告された。 さらに、 MR による水の 構造解析は、例えば、 Haz le ood, C. F. , Chang, D. C. , Woessner, D. E. , Nichol s, B. C. ： Nuc lear magnet ic resonance transverse rel axat ion t imes of water protons in skeletal muscle. Biophys. J. 14: 583- 605 (1974)により報告されている。
Bel ton等は、水は 3つの状態からなることを結論づけ、約 8%の水分子が細胞膜の内 膜やタンパク質や核酸といった生体内分子に結合した結合水であり、 約 82 の水分子 は、 結合水以外の自由水で、 残りの 10%の水分子は、 細胞膜の外側に接している自由 水である。 その結合水は、 他の水分子とは異なりある優位的な配行を保っており、 生 体高分子と直接結合した水分子に基づいて数分子層にわたって配向した状態にある。 典型的には、 生体組織内の総水分量のうち、 結合水が約 10〜約 20%、 自由水が約 80 〜約 90%を占めると理解される。 ラットの心臓内では、 臓器総重量を基準として、 典 型的な総水分量が約 80質量％であり、 結合水は 8〜16質量^ 自由水は 64〜72質量％ となる。
本発明に関する脱水工程では、 理論的には臓器総重量の約 25〜60wt%の水分除去が 可能と考えられる。 この程度であれば、 除去される水はすべて自由水であると考えら れる。
したがって、脱水の結果、 ラット心臓内に残存する自由水の質量 ま、数 %〜40%台ま で下がるが、 結合水の絶対量は変わらない。 実際の水分暈は動物種や臓器の種類によ つて多少異なるとしても、 脱水前の臓器総重量に対する重量比で約 25%以上の自由水 の除去によって、 脱水前の総水分量に対する重量比で約 10〜20%以上の水分 （結合水 を含む） を残すことができる。
臓器に許容される自由水の除去率は、 脱水方法、 臓器の種類、 意図する保存期間、 その他の保存条件によって異なる。 現在のところ、 ラット心臓では約 25〜35%が安全 であると見られる。ブタ心臓では、約 10〜50%、特に 15〜25%が適切であると考えられ る。
現段階では、 上記の脱水状態がどのように臓器の保存期間の増大に結びつくかのメ 力二ズムは充分に解明されていない。 本発明者の研究により、 少なくとも保存期間の 増大は、 保存液の成分ではなく、 臓器の組織や細胞内の水分子の絶対量に大きく依存 していることが判っている。 各組織及び細胞の脱水により実質的な生命活動が認めら れなくなった臓器がその後に 生した事実から、 11蔵器は仮死状態 （apparent death) に至ると考えられる。 この仮死状態は、 「imior tal s tate」 又は学術的には 「crypotbio t i c s tatej と呼んでもよい （Vreeland H. R. et al ; ature Vol . 407 pp. 897-900, 19 Oc t. 2000 ： Cano J. R at al ; Sc ience Vol . 268 pp. 1060-1064, 19 May. 1995)。
脱水された臓器は、 水および油に不溶性の不活性媒体であるパーフルォロカーボン 中に保存する。 不活性媒体への臓器の浸せきは、 一般に常圧下の密閉状態で行われ、 また必要に応じて加圧状態で行うこともできる。 このとき、 上述したように脱水剤と 共に保存されてもよい。 また、 不活性媒体は、 好ましくは純酸素で暴気される。
本発明にいう 「冷蔵温度以下の温度」 は、 約 +1〜約 +8°C、 好ましくは約 +2〜約 +4°C 近辺であり、 この保存状態で所定日数が維持される。 なお、 臓器の自由水が充分に除 去されていれば、 理論的には冷凍温度、 例えば液体窒素内に保存することも可能であ る。
臓器の保存状態からの蘇生には、 上記 Langendor f f 法を利用することができる。 ま ず保存臓器は、 パ一フルォロカーボン中から取り出し、 脱水剤があればこれを除去す る。 その臓器を +4°Cのシャーレ内の KH液、 好ましくは純酸素で暴気した KH液中に入 れる。 この臓器の大動脈に灌流用のカテーテルを固定し、 好ましくは o 2— c o 2混合 気体で連続暴気し且つ 37°Cに暖められた KH液を、 灌流ポンプによる一定流量で大動 脈側のカテーテルに送り込む。 この灌流により臓器の蘇生が図られる。
哺乳類動物の臓器保存で問題となるのは、 保存後に果して臓器のどの組織が生存し ているかなどを検証しなければならない点である。 その手法としては、 組織解剖学的 手法、 実際に移植して検証する移植法、 電気生理学的手法などがある。 これらいずれ の手法を採用するにせよ、 まず、 組織細胞が生存しているか否かを検証しなければな らない。
本発明にあっては、 組織細胞の蘇生を検証する方法として、 電気生理学手法、 例え ば心臓に心電図測定を用いた。 心電図は、 神経細胞組織の活動がリアルタイムで記録 できることができ、 神経細胞の活動が消滅した時点で細胞死が生じたものと判断する ことができる。 また補助的に、 目視により臓器組織の変色具合、 加えて心臓であれば 拍動の有無を確認することにより、 臓器としての蘇生状態を観察できる。 オイル膜の形成及び気体への曝露による脱水を含む発明
この発明は、 上述の脈管系からの脱水の代わりに、 臓器の気体への曝露による水分 の蒸発を使用する。 その脱血工程及び蔴生工程は上述の脈管系からの脱水による発明 と基本的に同じである。 気体中への曝露によるこの発明では、 その保存工程は、 不活 性媒体中に臓器を浸漬する上述の保存方法を適用することもできるし、 適用しないこ ともできる。 不活性媒体中へ臓器を浸潰しない場合、 乾燥した臓器は、 所望の保存期 間、 適切な湿度の気体中に冷蔵温度で維持される。
脱血した臓器は、 力ニューレと一緒に灌流装置から取り外し、 オイルに軽く浸漬さ せる。 臓器の全表面にオイル膜を形成する。 オイル膜の形成は、 乾燥気体下での水分 除去で危倶される摘出心臓の乾燥速度の偏り及びそれによる心臓表面の収縮や角質化 を防止することができる。
使用するオイルは、 臓器に無害であり、 臓器の表面に適切な厚みのオイル膜を形成 できる粘度を有するものがよく、 典型的にはシリコンオイルである。 シリコンオイル は有機酸化ケィ素のポリマーからなり、 生理学的にほとんど無害で化学的に不活性な 物質である。後述の実施例で用いたシリコンオイルは動粘度 100匪 2/S (摂氏 25°C)で不 揮発性であり、 長時間にわたる心臓表面の過剰乾燥からの保護に適していると考えら れる。 心臓の表面にオイル膜を形成すると、 オイルが無いときの乾燥により生じる心 S蔵表面のひび割れ等の物理的傷害が軽減されることが目視で確認できる。
使用する気体は、 典型的には空気、 又は o2— c o 2混合気体を使用できるが、 これ らに限定されない。 乾燥用の気体としては〇 2— C O 2混合気体が好ましい。
後述の実施例で示されるように、 保存用の気体としては X e (キセノン） を含むも のを使用してもよい。 キセノンは極性をもたない不活性気体であるため、 周囲の水と 疎水性水和して水分子の熱運動を抑制することができる。 水の構造化が高まり分子運 動が遅くなると水の粘度は上昇し、 そして生体反応は水を介して行われることから、 水の粘度が上昇すれば細胞の代謝が抑制されると考えられる。 自由水の除去及び低温 下での維持に加えて保存気体にキセノンを使用すれば、臓器の代謝は一層抑制される。 また、 キセノンは、 その解離圧 (摂氏 0°C)が 1. 15気圧 (0. 1115M P a )であり、 比較 的低い加圧で気体水和物を作りやすくなることが知られている。 したがって、 キセノ ンを使用する場合は臓器を加圧下で保存するとよい。 加圧環境下では、 臓器 （細胞の 内及び外を含む） 内における水相へのキセノンの溶解度が高まると考えられる。 臓器 を取り囲むキセノンを加圧すれば、 臓器内の水の構造化が促進され、 臓器の代謝は著 しく抑制されると推察される。
気体への曝露を使用する脱水方法は、 例えば、 シリカゲルの乾燥剤を入れて冷蔵温' 度に維持された密閉容器の中に脱血後の臓器を入れて、 臓器を所定期間かけて乾燥し た気体に曝す。 達成すべき脱水率は、 臓器の重量により異なるが、 脱水前の臓器総重 量の 10〜50 ％である。 但し、 同一の乾燥条件では、 達成される脱水率は、 臓器の大 きさ （重量等） に依存するので、 それを考慮した乾燥条件を適用することが好ましい と考えられる。
脱水のための時間は、 臓器の重量及び乾燥剤の量によって異なる。 例えば、 ラット 心臓であれば 24〜48時間前後、ブ夕心臓であれば 1週間前後であるがこれらに限定さ れない。 それらの各乾燥期間後、 臓器を不活性媒体中に保存するとよい。 この脱水方 法で、 臓器を傷めずに長期保存に望ましい高い脱水率を達成することができる。 臓器 の損傷が少ないため、 比較的短期間の保存では蘇生状態が非常によく、 また、 長期間 の保存でも蘇生率が上昇する。
後述の実施例 4では、 ブタ臓器を 3 7日間後に蘇生させることに成功した。 従来の 冷蔵保存では臓器が腐敗する期間であるが、臓器の心筋組織が蘇生したと確認された。 実施例
実施例 1 (脈管系を介して脱水させたラット心臓の保存）
アメリカの N I Hの実験動物基準に合わせて、人工繁殖した 7週令の Wi s t ar系雄ラ ット（体重 300g)を実験動物として使用した。
ラットの腹腔内にネンプタール 0. 25ml 及びへパリンナトリウム （Heparin Sodium Sal t) 5mgを注射投与し、 体重を測定してから心臓摘出を開始した。 摘出した心臓を 恒温槽中におき大動脈へカテーテルを挿入してから、 トレハロース 117腿 olを溶解さ せ 95 〇2— 5%C〇2混合気体を暴気した KH液を用いて、 langendorf f 式による脱血灌 流を行った。 恒温槽の温度を下げて心臓を停止させ脱血灌流を終了した。
心臓重量を測定した後、 その灌流装置により心臓へ上記 95%0 2— 5 C〇2混合気体 を送って脱水を開始した。 心臓の重量を測定して水分除去率を記録しつつ、 脱水開始 から 1時間 30分ほど後に気体灌流を止めた。心臓の総重量は、外表面の水分を拭き取 つただけの状態で測定した。
脱水した心臓は、予め純酸素を 1分間暴気した 4 のパーフルォロカーボン液 (住友 スリーェム社製、 フロリナ一ト FC77 ; C8 F 1 7)500ml中に浸せきし、 これを密閉容 器中に封入し、 冷蔵庫内に保存した。
所定の時間後にパーフルォロカーボン液から保存心臓を取り出し、 大動脈へカテー テルを揷入して上記混合気体を暴気した暖かい KH液を用いて 1 angendor f f式灌流によ る蘇生を試みた。
•実験 1 (4時間の保存）
R349(wistar rat 5週齢ォス）
2000年 9月 11日 室温 24°C
15:39 体重測定： 130g
15:51 心臓摘出開始
15:53 心臓摘出及びカテーテル挿入終了
15:53 脱血灌流開始：恒温槽温度 5.0°C、 速度 1.0〜3.8ml/min
16:1 心臓停止、 脱血灌流終了：恒温槽温度 5.0°C、 心臓温度 18.2°C
16:1 心臓重量測定： 0.663g
16:18 混合気体灌流による脱水開始：ガス圧 0.05kgf/cm2, 恒温槽温度 2.8°C
16:48 心臓重量測定： 0.516g、 水分除去率 22.2%
16:50 脱水続行：ガス圧 0.05kgf/cm 恒温槽温度 ΙΛΧ
17:20 心臓重量測定： 0.458g、 水分除去率 30.9%
17:21 脱水続行：ガス圧 0.05kgf/cm2, 恒温槽温度 1.6°C
17:51 心臓重量測定： 0.394g、 水分除去率 40.6¾
17:55 PFC液に浸せきし 4時間の保存： 0.6T:
21:5 保存終了、 心臓引き揚げ （室温 26°C)
21:55 心臓重量測定： 0.436g
21:55 蘇生灌流開始：恒温槽温度 34.4°C、 速度 1.0〜3.8ml/min
23： 40 蘇生灌流終了：恒温槽温度 33.7°C
評価： KH灌流開始後 4分で微弱ながら心筋の収縮が見られたが、 心房は動かなかった。 心筋は灌流を停止するまで動き続けた。 心臓はやや膨張した。
•実験 2 (8時間の保存）
R350 (wistar rat 5週齢ォス)
2000年 9月 12日 室温 25°C
19:10 体重測定： 150g
19:20 心臓摘出開始
19:22 心臓摘出及びカテーテル挿入終了
19:22 脱血灌流開始：恒温槽温度 5.0 、 速度 1. (！〜 3.8ml/min
19:37 心臓停止、 脱血灌流終了：恒温槽温度 4.6で、 心臓温度 15.7°C
19:39 心臓重量測定： 0.718g
19:43 混合気体灌流による脱水開始：ガス圧 0.1kgi/cm2、 恒温槽温度 4.4°C
20:13 心臓重量測定： 0.647g、 水分除去率 9.9%
20:15 脱水続行：ガス圧 0. lkgf/cm2, 恒温槽温度 2.4°C
20： 35 心臓重量測定： 0.550g、 水分除去率 23.4¾
20： 48 脱水続行：ガス圧 0.05kgf/cm2、 恒温槽温度 4.8°C
20:18 心臓重量測定： 0.483g、 水分除去率 32.7¾
17:55 PFC液に浸せきし 8時間の保存： 0.6°C
2000年 9月 13日
05:21 保存終了、 心臓引き揚げ （室温 27 ）
05:23 心臓重量測定： 0.523g
05： 2 蘇生灌流開始：恒温槽温度 33.6 、 速度 1.0〜3.8ml/min
07： 25 蘇生灌流終了：恒温槽温度 36.6°C
評価： 05:29から心筋が激しく収縮したが、 約 10秒程で止まった。 0600頃、肺動脈周 辺 （右心） 付近が微弱に動いていたことを確認した。 心臓がかなり膨張し外見では拍 動をほとんど確認できないが、灌流を止めて心臓の KH液を抜くと、はっきりと拍動し ていることが判った。
-実験 3 (16時間の保存）
R351(wistar rat 5週齢ォス）
2000年 9月 13日 室温 24°C 16:22 体重測定： 120g
16:28 心臓摘出開
16:31 心臓摘出及びカテーテル揷入終了
16:31 脱血灌流開始：恒温槽温度 26.9°C、 速度 1.0〜3.8ml/min
16:44 心臓停止、 脱血灌流終了：恒温槽温度 4.6°C、 心臓温度 16.2°C
16:45 心臓重量測定： 0.605g
16:50 混合気体灌流による脱水開始：ガス圧 0. lkgf/cm2, 恒温槽温度 3.3°C
17:20 心臓重量測定： 0.534g、 水分除去率 11.7%
17:23 脱水続行：ガス圧 0. lkgf/cm2, 恒温槽温度 1.3°C
17:53 心臓重量測定： 0.517g、 水分除去率 14.5%
17:55 脱水続行：ガス圧 0.2kgf/cm 恒温槽温度 0.5で
18:25 心臓重量測定： 0.522g、 水分除去率 13.7%
18:30 PFC液に浸せきし 16時間の保存： 2. S°C
2000年 9月 14日
10:28 保存終了、 心臓引き揚げ （室温 25°C)
10:30 蘇生灌流開始：恒温槽温度 32.9 、 速度 1.0〜3.8ml/min
17:25 蘇生灌流終了：恒温槽温度 34.5°C
評価：心臓の膨張が激しく、 拍動の状態が不明なため心電図による記録を取った。 •実験 4
ラット R443 (24時間の保存）
2001年 2月 6日
16： 10 心臓摘出
16： 20 脱血灌流開始：恒温槽温度 26.8°C→7.9°C
16： 45 脱血灌流終了、 心臓重量測定： 0.582g
16： 45 大動脈から空気を灌流 （O.lkgf/cm2) しながら PFC液中に浸漬
2001年 2月 Ί日
16： 48 PFC液より心臓引揚
16： 50 心臓重量測定： 0.430g 水分除去率 26.1¾
16： 50 KH液による灌流開始 （恒温槽 27.0°C→35.5°C) 18： 30 蘇生確認、 安定した拍動蘇生あり
•実験 5
ラット R444 (24時間の保存）
2001年 2月 7日
18： 55 ネンブタール 0. 2ml投与
18： 57 へパリンナトリウム 5mg投与
18： 57 体重測定
19： 00 心臓摘出
19： 03 トレハロース溶解 KH液灌流 （恒温槽 27. 6°C→5. 5°C)
19： 23 灌流終了、 心臓重量測定： 0. 767g
19： 27 瓶内で空気灌流 (0. Ikgf/cm2, 0. 8°C)
19： 57 灌流終了、 心臓重量測定： 0. 483g、 水分除去率 34. 8%
20： 00 PFC浸漬
2001年 2月 8日
20： 25 PFC (0. 5°C) より心臓引揚
20： 27 心臓重量測定
20： 27 KH液灌流開始 （恒温槽温度 26. 9°C→35. 4°C)
21： 27 蘇生確認、 数回拍動し停止
実施例 2 (脈管系を介して脱水させたラット心臓の保存）
実験動物は、ァメリカの NIH実験動物基準に準拠し繁殖した wis ter rat 5週齢ォス） を使用した。 下記の各実験例には、 それぞれラットを 5匹ずつ使用した。 不活性媒体 としてパーフルォロカ一ボン （PFC) を使用した。
，実験 1 (4時間の保存）
ラットにネンプタール 0. 2mlを腹腔内投与後、 へパリンナトリゥム 5mgを 0. 3mlの 生理食塩水に溶解した溶液を腹腔内投与した。 ラットを開胸して心臓を摘出した後、 摘出心臓の大動脈にカテーテルを揷入して木綿糸で結紮した。 カテーテルを挿入した 摘出心臓を定流量灌流装置に装着して、 トレハロースを 117讓 ol溶解した 27°Cの KH 液を 3. 2ml/minで灌流した。 KH液は 95%02— 5¾ C〇 2の混合ガスで常時曝気した。徐々 に灌流液の温度を下げて心停止させ、 完全に停止した心臓の重量を測定した後、 カテ 一テルより空気ガスを 0. lkgf/cm2の流圧で灌流して心臓を乾燥させた。乾燥させた心 臓の重量を測定した後、 混合ガスで常時曝気しながら 4°Cに保冷した PFC中に浸漬保 存した。 4時間後、 保存液から心臓を取り出し定流量灌流装置に装着して、 混合ガス で常時曝気した 27°Cの KH液を 3. 2ml/minで灌流した。 摘出心臓は保存後再び灌流を 開始すると、 組織細胞が生命を維持していれば自律的に蘇生し神経活動が出現する事 が知られている。 蘇生した心臓に電極を装着し、 ペンオシログラフで表面心電図を記 録した。
•実験 2 (16時間の保存）
保存時間を 16時間としたほかは、 上記の実験例 1 2と同様にして行った。
上記各ラットの気体灌流時間と水分除去率を下記に示す。
実験 1の脱水率
1-1 1時間 34分 44. 1¾
1-2 2時間 37分 32. 8%
1-3 2時間 37分 44. 4%
1-4 2時間 37分 47. 5¾
1- 5 3時間 7分 41. 1% .
実験 2の脱水率
2- 1 1時間 35分 44. 4%
2-2 2時間 37分 41. 2%
2-3 1時間 3分 45. 8%
2-4 3時間 12分 41. 3%
2-5 2時間 9分 41. 4%
実施例 2の結果：実験 1及び実験 2の双方で総ての試料が蘇生した。 上記実験 1及び 2では、 水分除去に要した時間と水分除去率に著しいばらつきが見られた。 これは摘 出時の心臓の状態が一定ではない事が原因と思われる。 大動脈に揷入された力テーテ ルから送り込まれた空気は左右冠状動脈口から心筋の毛細血管に行き渡り各心筋細胞 を乾燥させるが、 毛細血管にわずかでも血栓が生じていると空気ガスはその先の細胞 にはとどかず、 時間と除去率が比例しなかったのであろう。 いずれにしても、 今回の 実験で、 水分除去率 40%以上のラット心臓が、 4時間及び 16時間の保存で、 100%の確 立で蘇生したことは驚くべきことであった。
実施例 3 (気体への曝露で脱水させたラット心臓の保存）
本実施例では、 ラットからの摘出心臓にシリコンオイルを塗布し、 その心臓を乾燥 気体の加圧で、 4°Cで 3日間保存した。
本実験で使用したラットは、 アメリカの NIHの実験動物基準に合わせて人工繁殖し た 7週齢の Wis tar系の雄（300g)を使用した。ラットから摘出し心臓は脱血した後、心 筋保護液 (Mi 0 teeter持田製薬製） 2mlをカテーテルより注入し心臓を停止させた。
灌流を終了した心臓の表面にシリコンオイル (WF · 30和光純薬製）を塗布し、 滅菌ガー ゼ（120 X I 20mm)に心臓を包み、 規格瓶（60ml)へ入れた。 シリカゲルを敷き詰めた耐圧 チェンバ一内へ心臓の入った瓶を置いて密閉した。チェンバー内は混合ガス（酸素 95%、 二酸化炭素 5%)で置換した後、 0. 2Mpaになるよう混合ガスを封入した。 処理後、 チェ ンバ一は摂氏 4度の冷蔵庫に保存した。
必要に応じて、 24時間毎にチェンバ一を開き、 摘出心臓へシリコンオイルを塗布し 直した。 所定期間の経過後にチェンバー内のシリコンオイルから心臓を取り出し、 定 圧灌流装置にセットした。酸素 95%、 二酸化炭素 5%の混合ガスで連続暴気している KH 液で満たされた灌流液貯留槽から導かれた灌流液は、一定圧 (約 60mmHg)で大動脈カテ 一テルに送り込んだ。摘出心臓は、 摂氏 37度で灌流を開始した。灌流中は、左心室と 大動脈開口部に心電図記録用電極を装着し、 双曲誘導で心電図を生体アンプ (Bi ovi ew-ENEC三栄製）を用いて連続記録した。
•基本的な実験手順は以下のとおりである。
1 . 摘出した心臓を、 KH液を満たしたシャーレ内に浸ける。
2 . シャーレ内にて力ニューレを大動脈へ揷入し、 木綿糸で固定する。
3 . 力ニューレをランゲンドルフ式定圧灌流装置に装着し、 KH液を心臓へ脱血灌 流する。 この際の KH液にはぺニシリンカリゥム 20万 U/Lを添加してある。 灌流温度 は約 37°C、 灌流圧は 60腿 Hgである。
4 . 20分の灌流の後、 心停止液 (心筋保護液）ミオテク夕一を 2ml程心臓へ灌流し、 心停止を促す。
5 . 心臓を力ニューレごと灌流装置から外し、 表面の水分をガーゼで拭き取り心 臓の重量を測定する。 6. 心臓をシリコンオイルに軽く浸けて、 表面にシリコンオイルの層を作る。
7. 心臓をガーゼに緩く包み、 容器に入れる。
8. 心臓の入った容器を耐圧チェンバーに収める。 チェンバ一内の底にはシリカ ゲルを敷きつめておく。
9. チェンバーを密閉し、 混合ガス（95%酸素、 5%二酸ィ匕炭素）を送り 0.3MPaにな るまで加圧する。 必要に応じてキセノンガスを使用する （例えば、 キセノン約 O.lMPa 及び混合ガス 0.2MPa)。
1 0. 加圧完了後、 チェンパーごと冷蔵庫に入れ、 2〜4°Cで保存する。
1 1. 3日後にチェンバ一を冷蔵庫より出してから、 ガスを排出させる。
1 2. チェンバーを開け、 心臓を取り出して重量を測定する。
1 3. 心臓をランゲンドルフ式定圧灌流装置へ装着し、灌流を開始する。例えば、 灌流温度は 37.0°C、 灌流圧は 60raiHgである。
14. 蘇生を確認したら心臓表面の心電図を測定する。
なお、 試料によってはチェンバー内に封入するガスを変えたり、 乾燥期間を変えた りした。乾燥期間が終了した試料は、 保存液 (シリコンオイル へ浸漬し、 乾燥時 と同様にチェンバー内で加圧保存した。
上記方法を適用して蘇生が確認された実験を以下に例示する。
•実験 1
保存前の心臓重量: 1.46g
保存開始日時： 2001年 12月 30日 21:07
使用気体:混合ガス 0.3MPa
蘇生開始日時: 2002年 1月 2日 16:09
蘇生開始前の心臓重量: 0.97g (3日間で 35 の水分除去）
'実験 2
保存前の心臓重量： 1.29g
保存開始日時： 2001年 12月 300 21:07
使用気体:混合ガス 0.3MPa
蘇生開始日時: 2002年 1月 2日 17:42
蘇生開始前の心臓重量: 0.89g (35%の水分除去） 保存前の心臓重量： 1.37g
保存開始日時: 2002年 1月 8日 19:20 使用気体:混合ガス 0.2MPaに加えて XeO. IMPa 蘇生開始日時: 2002年 1月 11日 14:34 蘇生開始前の心臓重量: 0.98g (32%の水分除去） た。
•実験 4
保存前の心臓重量： 1.41g
保存開始日時: 2002年 1月 8日 19:20 使用気体:混合ガス 0.2MPaに加えて XeO. IMPa 蘇生開始日時： 2002年 1月 11日 15:42 蘇生開始前の心臓重量： 1.10g (27%の水分除去） 保存前の心臓重量： 1.60g
保存開始日時: 2002年 1月 9日 10:16 使用気体:混合ガス 0.2MPaに加えて XeO. IMPa 蘇生開始日時: 2002年 1月 12日 17:42 蘇生開始前の心臓重量: 0.94g (46%の水分除去） •実験 6
保存前の心臓重量： 1.63g
保存開始日時: 2002年 1月 15日 19:13 使用気体:混合ガス 0.3MPa
蘇生開始日時: 2002年 1月 18日 13:49 . 蘇生開始前の心臓重量: 1.12g (31 の水分除去） •実験 7
保存前の心臓重量： 1.41g
保存開始日時： 2002年 1月 15日 19:13 使用気体:混合ガス 0.3MPa 蘇生開始日時: 2002年 1月 18日 16:02
蘇生開始前の心臓重量： 1.04g (35%の水分除去）
•実験 8
保存前の心臓重量： 1.43g
保存開始日時： 2002年 1月 8日 19:20
使用気体:混合ガス 0.2MPaに加えて XeO. IMPa
蘇生開始日時: 2002年 1月 11日 18:54
蘇生開始前の心臓重量: 1.07g (28%の水分除去）
図 1は、 本実験における心臓表面心電図である （21 :04測定)。 保存前の心臓重量： 1.61g
保存開始日時: 2002年 1月 9日 20:16
使用気体:混合ガス 0.2MPaに加えて XeO. IMPa
蘇生開始日時: 2002年 1月 12日 19:18
蘇生開始前の心臓重量： l.OOg (42%の水分除去）
図 2は、 本実験における心臓表面心電図である （20:25測定）
実施例 4 (気体への曝露で脱水させたブ夕心臓の保存）
この実施例では、ブ夕心臓を混合ガスへ曝露して脱水させ、その混合ガス下で 7〜8 日間保存した。
•実験 1 (7日間）
保存前の心臓重量: 31.9g
保存開始日： 2002年 2月 16日
使用オイル：シリコンオイル
使用気体：混合ガス （加圧なし）
手順：オイルを塗布した心臓をポリウレタンフォームで包んで容器 （ビン） に収め て、 容器ごとチェンバに入れて、 混合ガスへの置換を行った。 それを冷蔵庫に入れて 2〜4°Cの冷蔵温度で維持した。 臓器を一日毎に取り出し、 シリコンオイルを塗布し直 した。
蘇生開始日： 2002年 2月 23日 蘇生開始前の心臓重量: 25. 6g (19. 7%の水分除去）
図 3は、 7日間の保存後に蘇生させたその心臓表面の心電図である。
•実験 2 (8日間）
保存前の心臓重量: 31. 2g
保存開始日： 2002年 2月 17日
使用オイル：シリコンオイル
使用気体:混合ガス （加圧なし）
手順：オイルを塗布した心臓をポリウレタンフォームで包んで容器 （ビン） に収め て、 容器ごとチェンバに入れて、 混合ガスへの置換を行った。 それを冷蔵庫に入れて 2〜4°Cの冷蔵温度で維持した。 臓器を一日毎に取り出し、 シリコンオイルを塗布し直 した。
蘇生開始日： 2002年 2月 25日
蘇生開始前の心臓重量: 23. 5g (24. 6%の水分除去）
図 4は、 8日間の保存後に蘇生させたその心臓表面の心電図である。
実施例 5 (気体への曝露で脱水させたブタ心臓の長期保存）
この実施例では、 ブタ心臓を気体への曝露による脱水を適用して長期保存 （3 7日 間） を試みた。
ブタ体重： 5kg、 保存前の心臓重量： 32. 6g
保存開始日時： 2001年 12月 16日
使用気体:混合ガス （加圧なし）
手順：オイルを塗布した心臓をポリウレタンフォームで包んで容器（瓶）に収めた。 容器ごとチェンバに入れて混合ガスへの置換を行った。 そのチェンバを冷蔵庫に入れ て 2〜4°Cの冷蔵温度で維持した。臓器は一日毎に取り出し、 シリコンオイルの再塗布 を行った。脱水開始から 1週間後に不活性媒体 (PFC) へ浸漬し、 2〜4での冷蔵温度に 維持した
蘇生開始日時： 2002年 1月 22日
脱水開始から 37日間後に臓器を取り出し、 蘇生のための灌流を行った。
蘇生開始前の心臓重量: 25. lg (23%の水分除去）
図 5に示されるように、 蘇生開始後 （19 : 04)、 心臓表面 （温度 29. 0°C) の心電図が 出現した。 lmVから最大 5mV、 毎分 8回〜 4 0回のパルスが記録された。

Claims

請求の範囲
1 . 生理学上常識的な水分量を含む臓器から、 その脈管系を通じて該臓器内の水分を 導き出すことにより脱水前の臓器総重量に対する重量比で約 10%以上の水分を除去し、 且つ脱水前の総水分量に対する重量比で約 10〜約 20%以上の水分を残す脱水工程と、 該臓器を不活性媒体に浸せきして冷蔵温度に維持する工程とを含む、 哺乳類動物の臓 器の保存方法。
2 . 心臓へ生理的塩類溶液を灌流して心臓内の血液を生理的塩類溶液に置換する脱血 工程と、 脱血した心臓から、 その血管系を通じて該臓器内の水分を導き出すことによ り脱水前の心臓総重量に対する重量比で約 10〜約 50%の水分を除去する脱水工程と、 該心臓を不活性媒体に浸せきして約 1〜約 8°Cの冷蔵温度に維持する工程とを含む保 存方法。
3 . 心臓へ生理的塩類溶液を灌流して心臓内の血液を生理的塩類溶液に置換する脱血 工程と、 脱血した心臓から、 その血管系を通じて該臓器内の水分を導き出すことによ り脱水前の心臓総重量に対する重量比で約 25〜約 60¾の水分を除去する脱水工程と、 該心臓を不活性媒体に浸せきして約 1〜約 8°Cの冷蔵温度に維持する工程とを含む保 存方法。 ，
4 . 上記脱水工程が、 水分を導き出す媒体として気体を送り込むことを含む、 クレー ム 1〜 3のいずれかに記載の保存方法。
5 . 上記脱水工程が、 気体を心臓の大動脈へ灌流して、 該気体の流れにより該心臓の 血管系から水分を導き出すことを含む、 クレーム 4に記載の保存方法。
6 . 上記脱水工程が、 臓器又は心臓の脈管系へ空気を送り込むことを含む、 クレーム 1〜 3のいずれかに記載の保存方法。
7 . 上記脱水工程が、 臓器又は心臓の脈管系へ 02を主成分とする 02— C O 2混合気 体を送り込むことを含む、 クレーム 1〜 3のいずれかに記載の保存方法。
8 . 上記脱水工程が、 臓器に不活性媒体に浸させている該臓器に脱水剤を接触させる ことを更に含む、 クレーム 1〜 3のいずれかに記載の保存方法。
9 . 上記生理的塩類溶液にトレハロースを溶解させて用いる、 クレーム 1又は 2に記 載の保存方法。
1 0 . 上記不活性媒体にパ一フルォロカ一ボン液を用いる、 クレーム 1〜 3のいずれ かに記載の保存方法。
1 1 . 上記臓器が、 心臓、 肝臓、 腎臓、 膝臓および肺臓からなる群より選択される、 クレーム 1に記載の保存方法。
1 3 . 上記臓器が、 ブタの心臓である、 クレーム 1に記載の保存方法。
1 4. 生理学上常識的な水分量を含む臓器の表面にオイル膜を形成する工程と、 該心 臓を気体に曝して該心臓内の水分を該気体中へ蒸発させることにより、 脱水前の心臓 総重量に対する重量比で約 10%以上の水分を除去する工程と、該臓器を約 2〜約 8°Cの 冷蔵温度に維持する工程とを含む、 哺乳類動物の心臓の保存方法。
1 5 . 心臓へ生理的塩類溶液を灌流して心臓内の血液を生理的塩類溶液に置換する脱 血工程と、 脱血した心臓の表面にオイル膜を形成する工程と、 該心臓を気体に曝して 該心臓中の水分を該気体中へ蒸発させることにより、 脱水前の心臓総重量に対する重 量比で約 10〜約 50%の水分を除去する工程と、該臓器を約 1〜約 8°Cの冷蔵温度に維持 する工程とを含む、 哺乳類動物の心臓の保存方法。
1 6 .水分が除去された上記臓器を不活性媒体に浸せきして約 1〜約 8°Cの冷蔵温度に 維持する工程を更に含む、 クレーム 1 4又は 1 5に記載の保存方法。
1 7 . 上記臓器が、 心臓、 肝臓、 腎臓、 塍臓および肺臓からなる群より選択される、 クレーム 1 4又は 1 5に記載の保存方法。
1 8 . 上記臓器がブ夕の心臓である、 クレーム 1 7に記載の保存方法。
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