JP6195848B2 - 糖ポリマーを用いた生体分子の安定化 - Google Patents
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- C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
Description
本出願は、2012年1月27日に出願された米国仮出願第61/591,729号および2012年4月18に出願された米国仮出願第61/635,159号の利益を主張するものであり、これらの双方はあらゆる目的で引用することにより本明細書の一部とされる。
本発明は、米国国立科学財団により授与された研究課題番号1112550および米国国立衛生研究所により授与された研究課題番号EB136774の資金援助を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
生体分子を安定化するための組成物および方法が開示される。具体的には、本組成物は、生体分子にコンジュゲートされたまたは非共有結合的に付加された新規なトレハロースに基づくホモポリマーまたはコポリマーを含み、前記ホモポリマーまたはコポリマーは前記生体分子を保護および/または安定化する。
本材料および方法を記載する前に、記載されている特定の方法論、プロトコール、材料、および試薬に限定されず、これらは変更可能であると理解される。また、本明細書で使用される用語は単に特定の実施態様を記載するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は後に出願される本出願によってのみ限定されると理解される。
一つの面において、本発明は、混合物を形成させるために生体分子に添加されるかまたは生体分子に共有結合的にコンジュゲートされるかのいずれかの場合に、生体分子を、好ましくは環境ストレッサーに対して顕著に安定化するホモポリマーまたはコポリマーに関する。用語「ホモポリマー」とは、少なくとも1つのトレハロース側鎖を含有する1種類のみのモノマーの重合から生産されるポリマーを意味する。用語「コポリマー」とは、少なくとも2種類のモノマーに由来するポリマーを意味し、少なくとも1種類のモノマーが少なくとも1つのトレハロース側鎖を含有する。実施例ではホモポリマーだけが記載されているが、当業者ならば、本発明がコポリマーにも及ぶことを理解するであろう。
R1R2C=CR3R4 (1)
を有する1以上のモノマーから生産することができ、式中、R1〜R4は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル(alkynl)、もしくはアリール基、または好ましくは少なくとも1つの炭素原子を含んでなる側鎖から独立に選択され、R1〜R4の少なくとも1つは−L−トレハロースを含んでなる側鎖であり、Lは、少なくとも1つのトレハロースヒドロキシル基(−OH)を介してトレハロースをモノマーに連結するリンカーである。
R5−[R1R2C−CR3R4]n−R6 (2)
を含んでなり、式中、R1〜R4は水素、少なくとも1つの炭素原子を含んでなる側鎖から独立に選択され、R1〜R4の少なくとも1つは−L−トレハロースを含んでなる側鎖であり、Lは、トレハロースを、少なくとも1つのトレハロース−OH基を介してモノマーに連結するリンカー分子であり、末端基であるR5およびR6は、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−−アリール、−C(CN)(アルキル)2、−S2C−S−アルキル、−C(CO)(アルキル)−(OCH2CH2)n−COO−CH2CH2−CO−アルキル(n=1〜10)、および生体分子からなる群から独立に選択される。
組成物および関連の方法を記載する前に、記載されている特定の方法論、プロトコール、材料、および試薬は可変であるので、本発明はこれらに限定されないと理解されるべきである。本明細書で使用する用語は単に特定の実施態様を記載することを目的とするものであり、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範囲は以降に出願される本出願によってのみ限定される。
手順、結果、および考察
開示されているホモポリマーまたはコポリマーの例示的実施例として、まず、重合性トレハロースモノマーを二段階で作製した(スキーム1)。テレフタルデヒドモノジエチルアセタールを用い、Wittig反応により1を収率97%で形成した。次に、これを用いて、弱酸性の条件下でもっぱら4,6位においてトレハロースとのトランスアセタール反応を行い、4,6−O−(4−ビニルベンジル)−α−D−グルコピラノシル−(1→1)−α−D−グルコピラノシド(2)を収率41%で得た。他の異性体は見られず、4,6位の優先性が置換ベンズアルデヒドジエチルアセタールに関して保持されていたことを示す。1H NMRおよび13C NMRを図1に示す。異核種単一量子コヒーレンス全相関分光(Heteronuclear single quantum coherence total correlation spectroscopy)(HSQC−TOCSY)実験を行い、反応の選択性ならびに生成物環系の完全性の両方を確認した。さらに、NOESY NMRを行い、2つのグルコースサブユニットがα,α−1,1−グリコシド結合を中心とする強固なクラムシェル型に保持されている天然二糖類のユニークな構成の保持を実証した。この結果は、それが糖鎖のユニークな物理化学特性および保護特性の形成に決定的な成分であることが分かっているので重要である(Sakurai, Murata, et al., 1997)。
材料 溶媒は総てFisher Scientific(ピッツバーグ、PA)から購入し、特に断りのない限り、それ以上精製せずに用いた。トレハロースはThe Endowment for Medical Research(ヒューストン、TX)から購入し、公知の手順 (Reisener, H.J., Perlin, A.S., Ledingham, G.A. & Goldschmid, H.R. FORMATION OF TREHALOSE AND POLYOLS BY WHEAT STEM RUST (PUCCINIA GRAMINIS TRITICI) UREDOSPORES. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology 40, 1248-& (1962))によって使用前に無水とした。出発化合物1−メルカプトトリエチレングリコールは文献の手順(Steinem, C. et al. Valinomycin-mediated transport of alkali cations through solid supported membranes. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 45, 17-26 (1998))に従って製造した。EnzChek(登録商標)リゾチームアッセイキットはInvitrogenから購入し、製造者の説明に従って用いた。ニワトリ卵白リゾチームおよび他の総ての化学試薬はSigma−Aldrichから購入した。
4−ビニルベンジルアセタール(1)の合成。1は、文献の手順(Sun, G.R., Cheng, C. & Wooley, K.L. Reversible addition fragmentation chain transfer polymerization of 4-vinylbenzaldehyde. Macromolecules 40, 793-795 (2007))に従って合成した。臭化メチルトリフェニルホスホニウム(5.4g、14.5mmol)および45mLのTHFを、火炎乾燥した250mLの丸底フラスコに加えた。反応混合物を−78℃に冷却し、20分間撹拌した。n−BuLiを20分かけて滴下した。この反応物を−78℃で30分間撹拌し、25℃に温め、10分間撹拌した。次に、この橙〜赤色の反応溶液を−78℃に冷却した。7.5mLのTHFに溶かしたテレフタルデヒドモノジエチルアセタール(2.5g、12.0mmol)を1時間かけて滴下した。−78℃で30分間撹拌した後、この反応フラスコを0℃に温め、3時間撹拌した。その後、この反応物を25℃に温め、1時間撹拌した。この反応物を、10mLの飽和NaHCO3溶液を添加することにより急冷した。50mLのH2Oを加えた後に有機層を回収し、水層を20mLのエーテルで3回抽出した。合わせた有機層をMgSO4で乾燥させた。Hex:EtOAc=20:1を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した後、2.40gの生成物が液体の形態で得られた(収率97%)。1H NMR (500 MHz, in CDCl3) δ: 7.55-7.45 (d, J = 7 Hz, 2H), 7.45-7.36 (d, J = 7 Hz, 2H) 6.78-6.68 (dd, 1H), 5.81-5.74 (d, J = 17 Hz, 1H), 5.57-5.51 (s, 1H), 5.29-5.22 (d, J = 11 Hz, 1H), 3.70-3.50 (m, 4H), 1.40-1.10 (t, J = 7 Hz, 6H). 13C NMR (500 MHz in CDCl3) δ : 138.80, 137.43, 136.59, 126.84, 125.93, 113.77, 101.00, 60.65, 15.10。
チオプロピオニルニワトリ卵白リゾチーム(LyzSH)。ニワトリ卵白リゾチームを受け取ったまま10mg/mL(50mM PB、1mM EDTA、pH7.5)の濃度となるように再構成した。次に、10μLのアセチルチオプロピオン酸スクシンイミジル(16mg/mL、DMF中65mM)を加え、この溶液を4時間4℃に冷却した。得られた修飾タンパク質をセントリプレップ限外濾過(MWCO 3kDa、50mM PB、1mM EDTA、pH7.5)により精製し、最終容量1mLとした。その後、このタンパク質を、100μLの0.5Mヒドロキシルアミン溶液(50mM PB、25mM EDTA、pH7.5)で処理することにより脱保護した。最終タンパク質の精製をセントリプレップ限外濾過(MWCO 3kDa、50mM PB、1mM EDTA、pH7.5)により行った後、エルマンアッセイにより遊離チオールの定量を行った(1:1.4 チオール:リゾチーム)。
本発明のモノマーはいずれの重合性単位を用いて調製してもよく、いずれの様式でトレハロース部分側鎖に連結してもよい。本明細書で使用するための、重合可能な別のモノマーの例示的実施例として、メタクリオイルモノマー(methacryoyl monomer)12を調製し(スキーム7)、ポリマー合成のためのその使用を実証した(スキーム8)。
溶媒は総てFisher Scientific(ピッツバーグ、PA)から購入し、トレハロースはThe Endowment for Medical Research(ヒューストン、TX)から購入した。他の化学試薬は総てSigma−Aldrichから購入した。ジメチルホルムアミド(DMF)、塩化メチレン(DCM)、トリエチル アミン(TEA)、および塩化メタクリロイルは使用前に蒸留した。トレハロース二水和物から、エタノールとの共沸蒸留を繰り返すことにより水を除去した。アゾビスブチルルニトリル(Azobisisobutyrlnitrile)(AIBN)はエタノールから3回再結晶化させた。
分子質量の異なる総てのトレハロースポリマーが調製可能である。スキーム1に示されるように、3を用いた2のRAFT重合を80℃で行った。重合に用いた比は[CTA]:[モノマー]:[AIBN]=1:29:0.2であり、0.8M濃度のモノマーを用いた。6時間後、重合を停止させると77%の変換率が得られた。このポリマーをMWCO 2,000g/molで、重炭酸ナトリウム水溶液に対して透析した。ポリマーの分子量は1H NMR分光法により分析し、スチレンから芳香環への末端基ピリジンピークの組込みを比較することによれば9,600Daであった(図12参照)。GPCによる多分散指数(PDI)は1.07であり、明確に定義されたポリマーが形成されたことを示す。トレハロースポリマーの動態試験では、重合中にPDIが1.1より十分低かったことを示した。次に、[CTA]:[モノマー]:[AIBN]比を変更して4,200g/mol〜19,000g/molの範囲の他の分子量(表2、ポリ1〜4)を得たが、総ての場合で狭いPDIが得られた。
スキーム10に示されるように、次に、トレハロースポリマーをチオール化リゾチームにコンジュゲートした。チオ酢酸官能基をアミド結合によりタンパク質に共有結合させることが知られている手順(Hernanson, 1996)にてアセチルチオプロピオン酸スクシンイミジル(SATP)で処理することによりチオールをニワトリ卵白リゾチームに付加した。ヒドロキシルアミンで脱保護し、余分なSATPを除去した後、遊離チオールをチオール化リゾチーム(LyzSH)でエルマンアッセイにより定量した結果、チオール:タンパク質比は1:1.4(71%チオール)となった。次に、LyzSHを種々のトレハロースに基づくホモポリマーとコンジュゲートした(ポリ2、5〜8)。トレハロースポリマーとのインキュベーション後、コンジュゲートはSDS−PAGEにより見られた。コンジュゲーション収率はポリ2ではポリ5〜8に比べて低かった。1つの可能性のある説明としては、TEGリンカーがポリマーの嵩高で水和したトレハロース側鎖からチオール反応性末端基を引き離し、タンパク質表面への接近が改善されるということである。
トレハロースグリコポリマーと慣用賦形剤ポリ(エチレングリコール)(PEG)を比較するための付加的初期研究も行った。従って、PEG(Mn=2〜20kDa)を野生型リゾチームと1または100当量で混合し、前記と同様に凍結乾燥または熱によりストレスをかけた。PEGの凍結保護効果(図12および13参照)は重合度(DP)に依存し、トレハロースグリコポリマーはタンパク質に対して1当量および100当量の両方でPEGより優れていることが分かった。分子量に基づくとはいえ、1当量のグリコポリマーは1当量のPEGと同等の性能を果たし、100当量のグリコポリマーはPEGよりも効果の高い凍結保護剤であった。グリコポリマーと比較したPEGの熱安定性はまた、適切なサンプルを前記のように90℃で1時間の熱負荷に曝すことによっても検討した。PEGが媒介する熱ストレスは最小の程度であるが、トレハロースグリコポリマーは、総ての供試サンプルで、DPまたはMnに基づけばPEGより優れている(図12および13参照)。これらのデータをまとめると、トレハロース側鎖ポリマーは効果が高く、代表的なタンパク質であるリゾチームの、凍結乾燥および熱ストレスに対する安定剤としてPEG単独よりも優れていることを示す。
重合ハンドルとしてのスチレニルアセタールを有するモノマーに加え、トレハロースはメタクリレートアセタール、メタクリレートエーテル、およびスチレニルエーテル部分を有するように修飾し、例として3つの異なるモノマーを得た。これらのモノマーおよびスチレニルアセタールモノマーを次に、開始剤としてのアゾビスイソブチロニトリル(AIBN)とともにフリーラジカル重合を用いて別々に重合し、各トレハロースポリマーを合成した。ホモポリマーを試験したところ、セイヨウワサビペルオキシダーゼでは70℃下で30分間、グルコースオキシダーゼでは50℃下で30分間、インスリンでは90℃で1時間、およびβ−ガラクトシダーゼでは4サイクルの凍結乾燥の後に活性の有意な安定化を示した。また、NIH 3T3、RAW 264.7ネズミマクロファージ、ヒト皮膚線維芽細胞、およびヒト臍帯静脈内皮細胞を用いた細胞傷害性試験では、これらのポリマーの総てが試験した1mg/mLまでの濃度に対して非細胞傷害性であることが示された。
グリコポリマーP1を、モノマー2を用いて作製した(スキーム11)。アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)を開始剤として80℃で用いた。17時間後、モノマー変換率は100%であり、ポリマーをH2Oに対する透析により精製した。得られたポリマーP1は数平均分子量(Mn)34.3kDaおよびPDI 1.96を有していた(図17)。
メタクリレートアセタールトレハロースモノマー15を、スキーム12に示されるように、出発材料として3,3’−ジエトキシプロピルメタクリレート(DEPMA、14)を用いて合成した。DEPMAの自家重合を阻害するためのp−TsOHおよびヒドロキノンを用いた弱酸性条件下で、モノマー15は収率37%で合成された。図18および19はそれぞれ1Hおよび13C NMRスペクトルである。次に、モノマー15を、AIBNを用い、AIBNとモノマーの比を1:43として65℃下で重合した。22時間後、NMRスペクトルで15からのビニルピークが消失し、100%のモノマー変換率が示唆された。H2Oに対する透析および凍結乾燥の結果、Mn 30,100g/molおよびPDI 2.03のP2が得られた(図20)。
別のモノマー16を、文献の手順(Teramoto and Shibata, 2004)を若干改変して、出発材料塩化4−ビニルベンジルから一段階で合成した。トレハロースをNaOHと共にジメチルスルホキシド(DMSO)に溶かし、かつ、この溶液に塩化4−ビニルベンジルをゆっくり加えた。25℃下で24時間後、このDMSO溶液をジクロロメタン(DCM)に滴下し、白色沈殿を得た。この沈殿を乾燥させ、HPLC精製によりモノマー16を白色粉末として収率20%で回収した(図21および図22はNMRスペクトルである)。16の重合は、1:1=DMF:H2Oで行った。75℃下で24時間後、重合を停止させ、H2Oに対する透析により精製した(NMRスペクトル、図23)。
別のモノマーを、具体的には、第一級アルコールの1つを保護し、その位置にメタクリレート部分を付加することにより合成した(スキーム14)。17および18は、これまでの文献の手順(Kurita, Masuda, et al., 1994)を改変することにより合成した。第一級ヒドロキシル基と第二級ヒドロキシル基を識別するためにトリチル基を用いた。トレハロースをまずトリチル化し、次にアセチル化し、その後、そのトリチル基を除去して、第6位に遊離ヒドロキシル基を1個だけ有する18を得た。次に、化合物18を塩化メタクリオイル(methacryoyl)と反応させてアセチル保護メタクリレートグリコモノマー19を収率63.9%で得た(図24および図25)。次に、モノマー19を65℃で19時間、AIBNを用いて重合した。しかしながら、ジエチルエーテル中での沈殿による精製後(NMRは図26として示す)、P4’はMn 18,292g/molおよびPDI=2.40を有した。P4’を次に、本発明者らのこれまでの報告を改変して、触媒量のNaOMeにより脱保護し、脱保護が見られたのでこの生成物を沈殿させた(Vazquez-Dorbatt and Maynard, 2006; Ambrosi, Batsanov, et al., 2002)。P4をHClで中和し、H2Oに対して透析した。1H−NMR分光法から、2ppm前後のOAcメチルプロトンのピークが消失した(図27)。IRから、アセチルC=OおよびC−Oストレッチの消失とO−H吸収の出現が見られた。
セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)
30分間70℃の温度に曝した後のセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)の活性を試験し、結果を図28に示す。HRPの活性は、青色の副生成物を生じる3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)との反応により試験した。HRPサンプルは、添加剤無し、100当量のP1〜P4、または7500当量のトレハロース(P1サンプル中のトレハロースに相当)を含むように調製した。次に、加熱したサンプルのHRP反応性を調べ、加熱および添加剤無しの同濃度のHRPを用いて、元の活性に対するパーセントを計算した(図28)。加熱後、添加剤を含まない溶液中のHRPで見られた活性は元の活性の46%に過ぎなかった。しかしながら、グリコポリマー(P1〜P4)は総て、タンパク質を有意に安定化し、元の酵素活性が100%残存していた。同濃度のトレハロースは80%のHRP活性を維持していたに過ぎなかった。総てのサンプルは6回反復し、無添加と比較したそれらのp値は<0.001であった。
トレハロースグリコポリマーP1〜P4はまた、30分間50℃の加熱に対するグルコースオキシダーゼ(GOX)安定化についても試験した。GOXの活性はAmplex(登録商標)レッドグルコース/グルコースオキシダーゼアッセイキット(Invitrogen)を用いて評価した。GOXはD−グルコースと反応してH2O2を生成し、次にこれがセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)の存在下でAmplex(登録商標)と反応してレゾルフィンを生成し、これを蛍光により検出することができる。GOXサンプルは、添加剤無し、100当量のP1〜P4、および7500当量のトレハロース(P1における繰り返し単位の数に相当する)を含むように調製した。サンプルは総て、30分間50℃に加熱し、6回反復した。次に、加熱したサンプルのGOX反応性を調べ、加熱および添加剤無しの同濃度のGOXを用いて、元の活性に対するパーセントを計算した(図29)。結果は、トレハロースグリコポリマーP1、P2、P3、およびP4が総て85%を超えるGOX活性を維持していたが、添加剤無しのGOXが有していたのはその活性の68%であることを示し、それぞれp<0.01、p<0.001、およびp<0.001であり、統計的有意性を示した。また、総てのポリマーが、元の活性の72%を維持していたトレハロース単独に比べて良好な安定化を示したp<0.05。
添加剤として調製したP1、P2、P3、および同濃度のトレハロースを、90℃下で1時間の加熱に対するインスリンの安定化に関して調べた。加熱後に総てのサンプルを未変性(native)ゲルにのせた(図30)。添加剤を含まないインスリンは変性し、未変性ゲルにおいてそのバンドはほぼ消失した。トレハロースを添加したインスリンのバンドは、大幅に小さくなった。しかしながら、P1およびP3を含むインスリンは、ほとんどのインスリンバンドが残存したことを明らかに示し、タンパク質構造がほとんど変化しなかったことを示した。P2を含むインスリンのバンドはP1およびP3に比べて弱かったが、添加剤を含まない場合またはトレハロースを含む場合よりも強かった。MALDI−TOFデータは、元々5.8kDaであるインスリンが加熱後に変性して主に2つのフラグメントとなることを示す(データは示されていない)。これはインスリンの2つのジスルフィド架橋α鎖およびβ鎖の破断によるものである。
複数回の凍結乾燥サイクルの後のβ−ガラクトシダーゼ(β−Gal)の安定化も調べた。β−Galは凍結乾燥または凍結−解凍サイクルによって容易に変性することが知られている(Pikal-Cleland and Capenter, 2001)。β−Galの活性は、420nmで光を吸収する黄色の生成物であるo−ニトロフェノールを放出するo−ニトロフェニル−β−D−ガラクトシド(ONPG)との反応により測定した。実験は6回反復し、結果は、トレハロースグリコポリマーは凍結乾燥サイクルに対してβ−Galの活性を保護することができる効果的な賦形剤であることを示した。3サイクルの凍結乾燥後、β−Galはその元の活性の40%を有し、4回目のサイクルの後では30%の活性に過ぎなかったが、P1〜P3は、4サイクルの後でもポリマーによって83〜98%の活性を維持していた。トレハロースは元の活性の45%を維持しているに過ぎなかったことから(図31)、これらのポリマーはトレハロースよりも優れた性能であった。
これらのトレハロースグリコポリマーのin vivoにおける可能性を検討するために、比較としての20kDaのPEGおよびトレハロースとともに、P1、P2、およびP3の細胞傷害性を調べた。NIH 3T3(マウス線維芽細胞)、RAW 264.7(マウス白血病単球マクロファージ)、HDF(ヒト皮膚線維芽細胞)、およびHUVEC(ヒト臍帯静脈内皮細胞)をそれぞれ培養し、48ウェルプレートに5×103細胞/ウェルの密度で播種した。24時間後、培養培地を、0.1、0.5、および1mg/mLの濃度で各ポリマーまたはトレハロースを含有する実施培地に置き換えた。48時間のインキュベーション後、細胞をLIVE/DEAD試薬で染色し、各ウェルについて蛍光画像を取り込んだ。生細胞および死細胞を計数し、生細胞の数を細胞総数で割ることにより細胞生存率パーセントを計算した。実験は総て4反復で行い、平均をとり、結果を図32に示す。これらデータにより、P1〜P3トレハロースグリコポリマーは供試した4種類の細胞株の総てに対して非細胞傷害性であることが確認される。また、20kDaPEGおよびトレハロースと比較したところ、P1、P2、P3は細胞傷害性を示さず、このことはin vivo使用のためのそれらの適用性に重要である。
1のフリーラジカル重合。グリコモノマー14(391.8mg、8.58×10−1mmol)をDMF(1.07mL)に溶かした。この溶液にAIBN(3.28mg、2.00×10−2mmol)を加えた。凍結−ポンプ−解凍を5回繰り返し、80℃の油浴に浸漬することにより反応を開始した。17時間後に液体窒素で冷却することにより重合を停止させ、1H NMR分光法によればモノマー変換率は100%であった。生成物をH2Oに対して3日間の透析(MWCO 3,500g/mol)により精製し、凍結乾燥機を用いて乾燥させてP1を得た。GPCによれば、このポリマーのMnは34,300g/molであり、PDIは1.96であった。1H NMR (500 MHz in D6DMSO) δ: 7.11, 6.39, 5.45, 5.23, 4.96, 4.86, 4.41, 4.12, 3.97, 3.78, 3.70, 3.62, 3.48, 3.17, 1.60, 1.24, 0.86。IR: ν = 3384, 2916, 1635, 1380, 1150, 1074, 983 cm-1。
チオール修飾されたds−siRNAをDTTで脱保護して、センス鎖の5’末端に遊離チオールを与えた。次に、3つの異なるサイズのピリジルジスルフィドで末端官能基したトレハロースポリマーをジスルフィド交換によりsiRNAにコンジュゲートした(スキーム15)。これらの3種類のポリマーはポリ5、ポリ6、およびポリ7である。TBE PAGEゲル上で、還元条件と非還元条件の両方でsiRNAおよびコンジュゲートを分析した(データは示されていない)。還元条件下では、ポリマーのスルフィド結合は切断されるので、遊離siRNAを表すバンドのみが見られた。しかしながら、非還元条件では、コンジュゲートのより高分子量のスメアが見られた。コンジュゲートA、B、およびCを形成するためのポリマーとsiRNAとの反応のコンジュゲーション効率はそれぞれ85%、76%、および73%と計算された。
siRNAのピリジルジスルフィド末端官能基化トレハロースポリマーポリ5〜7へのコンジュゲーション。30μlの、二本鎖(ds)−siRNAの0.0383mM溶液を5μlの200mMジチオトレイトール(DTT)溶液と混合し、3時間24℃で維持した。未反応のDTTを除去するために、ds−siRNAを、エタノールを用いて沈殿させた。siRNAペレットを、30μLのポリ5、6、7溶液(pH8.5の100mM重炭酸ナトリウムバッファー中、50当量)中に完全に再懸濁させた。この反応混合物を23℃で20時間放置した。これらのコンジュゲートはまた、生理学的関連条件下でsiRNAとポリマーの共有結合的コンジュゲーションが逆転され得るどうかを確認するためにDTTでも処理した。水中、コンジュゲート反応混合物(0.03nmol siRNA、5μL)をDTT(10nmol、水中1μL)とともに23℃で1時間インキュベートした。その後、還元状態および非還元状態のコンジュゲートを、1倍TBEバッファー(pH8.0)を用い、200Vの一定電圧で40分間、15%トリスホウ酸EDTA(TBE)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により分析した。ds−siRNAは、このゲルを1倍SYBR−Safe核酸色素/TBEバッファー中でインキュベートすることにより染色した。コンジュゲーション効率は、Quanti−Oneプログラム(BioRad)を用いて定量した。
Claims (23)
- 生体分子を安定化するためのホモポリマーまたはコポリマーの作製に使用するためのモノマーであって、一般構造:
R1R2C=CR3R4
(式中、R1〜R4は、水素、または少なくとも1つの炭素原子を含んでなる側鎖から独立に選択され、かつ、R1〜R4の少なくとも1つは、−L−トレハロースまたは−L−ジベンジリデントレハロースであり、Lは、少なくとも1つのトレハロースまたはジベンジリデントレハロースのヒドロキシル基(−OH)を介してトレハロースまたはジベンジリデントレハロースをモノマーに連結するリンカーであって、Lが−アリール−(CH2)n−(n=0〜6)、−(COO)−(CH2)n−(n=1〜6)、−(CONH)−(CH2)n−(n=1〜5)、および−(CH2)n−(n=0〜6)からなる群から選択され、R1およびR2の両方がHである)
を有する、モノマー。 - 一般構造:
R5−[R1R2C−CR3R4]n−R6
(式中、R1〜R4は、水素、または少なくとも1つの炭素原子を含んでなる側鎖から独立に選択され、かつ、R1〜R4の少なくとも1つは、−L−トレハロースまたは−L−ジベンジリデントレハロースであり、Lは、少なくとも1つのトレハロースまたはジベンジリデントレハロースのヒドロキシル基(−OH)を介してトレハロースまたはジベンジリデントレハロースをモノマーに連結するリンカーであり、かつ
R5およびR6は、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−アリール、−C(CN)(アルキル)2、−S2C−S−アルキル、−C(CO)(アルキル)−(OCH2CH2)n−COO−CH2CH2−CO−アルキル(n=1〜10)、および生体分子からなる群から独立に選択され、Lは−アリール−(CH2)n−(n=0〜6)、−(COO)−(CH2)n−(n=0〜6)、−(CONH)−(CH2)n−(n=0〜5)、および−(CH2)n−(n=0〜6)からなる群から選択される)
を含んでなる、請求項1に記載の1以上のモノマーから作製されたホモポリマーまたはコポリマー。 - 前記生体分子がタンパク質、酵素、抗体、DNA、RNA、siRNA、および医薬組成物からなる群から選択される、請求項2に記載のホモポリマーまたはコポリマー。
- 側鎖−L−トレハロースが
- −L−トレハロースではないR1〜R4のいずれかは水素またはアルキル基のいずれかである、請求項2に記載のホモポリマーまたはコポリマー。
- 前記アルキル基がメチル基である、請求項5に記載のホモポリマーまたはコポリマー。
- R1〜R4の1つがアルキル基であり、R1〜R4の2つが水素である、請求項2に記載のホモポリマーまたはコポリマー。
- 前記アルキル基がメチル基である、請求項7に記載のホモポリマーまたはコポリマー。
-
からなる群から選択される構造を有する、請求項8に記載のホモポリマーまたはコポリマー。 - R1〜R4の3つが水素である、請求項2に記載のホモポリマーまたはコポリマー。
-
からなる群から選択される構造を有する、請求項10に記載のホモポリマーまたはコポリマー。 - 生体分子を安定化するためのホモポリマーまたはコポリマーを合成する方法であって、 (a)トレハロース分子を含んでなる側鎖を重合性モノマーに組み込む工程、および
(b)得られたモノマーを重合して請求項2に記載のポリマーを得る工程を含んでなる、方法。 - 前記ホモポリマーまたはコポリマーが化学合成により生成される、請求項12に記載の方法。
- 前記重合性モノマーがスチレンモノマー、アクリレートモノマー、メタクリレートモノマー、アクリルアミドモノマー、メタクリルアミドモノマー、ビニルモノマー、ノルボレニルモノマー、および環状アルケンモノマーからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 得られたモノマーを重合してホモポリマーまたはコポリマーを得る工程が、下記の技術:可逆的付加開裂(RAFT)重合、原子移動ラジカル重合(ATRP)、ニトロキシド媒介重合(NMP)、シアノキシル媒介フリーラジカル重合、従来のラジカル重合、または開環重合(ROMP)のいずれか1つによって実施される、請求項12に記載の方法。
- トレハロースの1以上のヒドロキシル基がアセタールまたはエーテルの形成により保護される、請求項13に記載の方法。
- 生体分子と請求項1に記載のモノマー由来のホモポリマーまたはコポリマーとをコンジュゲートする工程を含んでなる、生体分子を安定化する方法。
- 生体分子がホモポリマーまたはコポリマー主鎖と共有結合的にコンジュゲートされる、請求項17に記載の方法。
- 生体分子がホモポリマーまたはコポリマー主鎖に、前記ホモポリマーまたはコポリマー主鎖の一方または両方の末端に結合された生体分子反応性基を介してコンジュゲートされ、ここで、前記生体分子反応性基が、ピリジルジスルフィド、5−チオ−2−ニトロ安息香酸、もしくはジスルフィド還元物、または、マレイミド、ジハロマレイミド、もしくは、ビニルスルホンもしくはアクリロイルであるビニル基、ハロアセチルもしくは他のアルキルハリド、アジリジン、もしくはアリール化薬剤であるマイケル受容体を含んでなる、請求項18に記載の方法。
- 前記生体分子反応性基がチオール反応性基である、請求項19に記載の方法。
- 生体分子がタンパク質、酵素、抗体、DNA、RNA、siRNA、および医薬組成物からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 一般構造:
−[R1R2C−CR3R4]n−
(式中、R1〜R4は、水素、または少なくとも1つの炭素原子を含んでなる側鎖から独立に選択され、かつ、R1〜R4の少なくとも1つは、−L−トレハロースまたは−L−ジベンジリデントレハロースであり、Lは、少なくとも1つのトレハロースまたはジベンジリデントレハロースのヒドロキシル基(−OH)を介してトレハロースまたはジベンジリデントレハロースに連結するリンカーである)
を含んでなるホモポリマーまたはコポリマーにコンジュゲートされた生体分子を含んでなる組成物であって、
前記ホモポリマーまたはコポリマーが前記ホモポリマーまたはコポリマー主鎖の一方または両方の末端に結合された生体分子反応性連鎖移動剤をさらに含んでなり、Lが−アリール−(CH2)n−(n=0〜6)、−(COO)−(CH2)n−(n=0〜6)、−(CONH)−(CH2)n−(n=0〜5)、および−(CH2)n−(n=0〜6)からなる群から選択される、組成物。 - 生体分子がタンパク質、酵素、抗体、DNA、RNA、siRNA、および医薬組成物からなる群から選択される、請求項22に記載の組成物。
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