CN109134786A - 一种化学-酶法制备梳状糖基化聚合物刷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化学‑酶法制备梳状糖基化聚合物刷的方法,首先基于SAM在QCM金芯片表面构建ATRP引发剂Br‑单分子层,然后采用SI‑ATRP在QCM金表面构建多羟基聚合物刷POEGMA,并BF3‑Et2O的催化作用下将MOA接枝到POEGMA上构建麦芽糖‑糖基受体单分子层,最后进行酶催化多糖延伸得到支化葡聚糖刷。本发明不仅简单高效的生产出人造糖被,还通过加入酶催化的方法使得该制备方法相较于传统化学合成法更加绿色环保,相较于化学法制备出的糖基具有构型一定的优点。并且避免了传统方法无法形成三维结构的缺点,在酶的催化下多糖延伸成3D结构,产生了相较于2D结构更高密度的糖基。
Description
技术领域
本发明属于糖科学技术领域,具体涉及一种化学-酶制备梳状糖基化聚合物刷的方法。
背景技术
糖被是覆盖在许多细胞和细菌外部的富含碳水化合物的涂层。广泛的研究表明,糖被不仅可以屏蔽细胞壁直接暴露于侵略者,而且可以调控细胞与周围环境的分子识别。在这些实际功能中,碳水化合物与蛋白质之间的特异性相互作用被证明是细胞过程的一个必要的先决条件。
通过研究碳水化合物-蛋白质相互作用,在植入装置上构建仿生糖被以模拟自然界中的糖被被认为是最有效的工具。糖基化聚合物刷是结构上最接近糖被的仿生材料。糖基化聚合物刷是一类化学结构及功能上模拟“糖被”的仿生功能材料,其按化学微结构不同分为线型和梳状。其中梳状糖基化聚合物刷与细胞表面的聚糖在结构上更接近,其单位空间内糖基数目更多且构型更复杂,从而有利于实现糖基“集簇效应”,极大地增强“糖-蛋白质”间结合和识别专一性。因此,构建梳状糖基化聚合物刷进而研究其与蛋白质的识别作用,在更深层次揭示生命体中聚糖的生理功效,及开发新型糖基化仿生功能材料在医学检测、生物亲和分离、表面抗污染、组织工程等领域应用具有重要意义。
现有技术中单纯的化学催化法无位点/立构选择性、副反应多,糖苷构型混杂,与天然“糖被”整齐的糖基构型存在很大差距,不利于深层次揭示聚糖的生物学功能;此外,聚合过程中所用重金属催化剂易残留,不利于糖基化聚合物刷在生物医用领域的应用。
而酶法虽然绿色环保但通常只实用于特定的酶,所用的酶大多来源有限,价格昂贵;而酶催化底物供体通常为活性糖苷(核苷酸-糖苷或磷酸基-糖苷),合成步骤繁琐、提纯麻烦、价格昂贵,并且不稳定。传统的化学法和酶法都有各自的优缺点,但是简单的将他们组合在一起也并不能轻易实现。比如一般酶法选择的聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)能特异性吸附糖苷酶(来源于苦杏仁的p-葡萄糖苷酶(Glu, EC 3.2.1.21)和来源于米曲霉的p-半乳糖苷酶(Gal, EC 3.2.1.23)),并对酶活性造成抑制。
发明内容
为了克服上述缺陷,本发明提供一种化学-酶制备梳状糖基化聚合物刷的方法,结合两种聚合技术,即表面引发的原子转移自由基聚合(SI-ATRP)和多糖的酶催化延伸(ECE),用于在金表面上制备作为仿生糖被的稠密分支糖基聚合物刷,然后密集填充支化糖基聚合物刷作为人造糖被,并对所构建的仿生糖被进行特异性识别性能进行检测,本发明加入酶催化的方法使得该制备方法相较于传统化学合成法更加绿色环保,且相较于化学法制备出的糖基具有构型一定的优点。为进一步揭示聚糖生物学功能提供强有力的技术支持。独特的酶催化法还使得其制备的仿生糖被拥有高于2D结构的3D高密度糖基。
本发明采用的技术方案为:
一种化学-酶法制备梳状糖基化聚合物刷的方法,包括如下步骤:
1)将金芯片在氮气流下用乙醇冲洗,随后浸入氨水-过氧化氢-超纯水的混合物中,最后用超纯水和乙醇冲洗后,在稳定的氮气流下干燥,备用;
2)将步骤1)中金芯片浸入11-巯基-1-十一醇乙醇溶液中,随后放入含三乙胺的二氯甲烷中,加入溴代异丁基酰溴进行反应,反应结束后用二氯曱烷、乙醇、超纯水洗涤,高纯氮气吹干备用;
3)将步骤2)中金芯片加入甲基丙烯酸酯、CuCl、CuBr2、联吡啶和超纯水混合液中反应,反应结束后用流水冲洗过夜去除可能吸附的有机物,最后用高纯氮气吹干备用;
4)将步骤3)中金芯片浸入含八乙酰麦芽糖酯的无水二氯甲烷中,加入三氟化乙醚作为催化剂反应,反应完成后依次用二氯甲院、乙醇、超纯水洗涤金芯片,并用高纯氮气吹干,随后将芯片放入甲醇钠-乙醇溶液中进行脱乙酸基反应,反应结束后用大量超纯水洗涤芯片,并用高纯氮气吹干备用;
5)将步骤4)中金芯片放入含葡聚糖蔗糖酶的乙酸-乙酸钠溶液中进行反应,随后放入含蔗糖的乙酸-乙酸钠溶液中进行反应,反应结束后超纯水洗涤金芯片,并用超纯氮气吹干,真空储存。
步骤1)中氨水-过氧化氢-超纯水的混合物中三种物质体积比为1:1~2:5~10,浸入时间为10~15 min。
步骤2)中11-巯基-1-十一醇乙醇溶液浓度为1 mM,二氯甲烷中三乙胺浓度为0.06M~0.08M,反应时间为5~10 min。
步骤3)中甲基丙烯酸酯为10.0~20.0 mL, CuCl 0.30~0.60 mmol、CuBr2 0.05~0.10 mmol、BPY 0.50~0.80 mmol,反应时间为10~60 min。
步骤4)中八乙酰麦芽糖酯浓度为20 g/L,无水二氯甲烷加入量5~10 mL,催化剂BF3EtO2加入量为50~100 μL,前期冰水浴中反应2 h,随后室温下反应12~36 h。
步骤4)中甲醇钠-乙醇溶液浓度为5 mg/mL,脱乙酸基反应时间为60~120min。
步骤5)中蔗糖浓度为0~25 mM,在含DSase及含蔗糖的乙酸-乙酸钠溶液中在25℃下温育2~3 h。
氨水的质量浓度为28%,过氧化氢的质量浓度为30%。
本发明首先基于SAM在QCM金芯片表面构建ATRP引发剂Br-单分子层,然后采用SI-ATRP在QCM金表面构建多羟基聚合物刷POEGMA,并BF3-Et2O的催化作用下将MOA接枝到POEGMA上构建麦芽糖-糖基受体单分子层,最后进行酶催化多糖延伸得到支化葡聚糖刷,发明原理如图1所示。
本发明寻找到了合适的化学法和酶法来结合以达到互补的效果,聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯(POEGMA)与糖苷酶的相互作用较弱且不会对酶活性造成抑制,因此是糖苷酶表面催化用较优糖基受体。
本发明构建得到的梳状糖基化聚合物刷与细胞表面的聚糖在结构上更接近,其单位空间内糖基数目更多且构型更复杂,从而有利于实现糖基“集簇效应”,极大地增强“糖-蛋白质”间结合和识别专一性。因此,构建梳状糖基化聚合物刷进而研究其与蛋白质的识别作用,在更深层次揭示生命体中聚糖的生理功效,及开发新型糖基化仿生功能材料在医学检测、生物亲和分离、表面抗污染、组织工程等领域应用具有重要意义。多糖的酶催化延伸(ECE)是实现梳状结构的主要技术。
有益效果:通过SI-ATRP将密集包装的线性甲基丙烯酸聚乙二醇酯(POEGMA)链接枝在金表面上,然后通过糖苷键将麦芽糖锚定到POEGMA刷上,构建麦芽糖-糖基受体单分子层,随后在Dsase的作用下使蔗糖底物延伸有效形成支化糖共聚物刷。本发明不仅简单高效的生产出人造糖被,还通过加入酶催化的方法使得该制备方法相较于传统化学合成法更加绿色环保,相较于化学法制备出的糖基具有构型一定的优点。并且避免了传统方法无法形成三维结构的缺点,在酶的催化下多糖延伸成3D结构,产生了相较于2D结构更高密度的糖基。
附图说明
图1为实施例1的原理图。
图2为不同支化糖被共聚物刷的XPS图谱;(a)POEGMA刷,(b)MOA-a-POEGMA,(c)麦芽糖-α-POEGMA,(d)葡聚糖-α-POEGMA的测量XPS谱。
图3为实施例1的数据图;其中(a)POEGMA和麦芽糖固定的PEGMA刷上DSase催化伸长的典型QCM曲线;
(b)蔗糖浓度对麦芽糖锚定的POEGMA刷子的酶促伸长的影响;
(c)初始伸长率(ν0)对蔗糖浓度的依赖性;
(d)v0相对于蔗糖浓度的倒数图(先将DSase的0.78pmol∙cm-2限制在刷子上)。
图4为C1s的高分辨率XPS光谱;其中:(a)POEGMA刷,(b)MOA-a-POEGMA刷,(c)麦芽糖-α-POEGMA刷,(d)葡聚糖-α-POEGMA刷。
图5为Con A浓度对25℃下Con A吸附量的影响,□:麦芽糖-α-POEGMA刷,○:葡聚糖-α-POEGMA刷。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步描述,但不应视为对本发明保护范围的限制。
实施例1
一、表面处理
用乙醇冲洗QCM金芯片(QCM芯片为QSX 301金芯片,直径:1.4 cm,5 MHz,瑞典Q-sense公司)并在稳定的超纯氮气流下干燥,浸入60℃的氨水(质量浓度28%),过氧化氢(质量浓度30%)和超纯水体积比为1:1:5的混合液中10分钟,随后,用超纯水和乙醇彻底冲洗芯片,并干燥备用。
二、引发剂固定
表面引发剂层固定采用单分子层自组装技术(SAM),其中先将步骤一中处理过的金芯片浸入1mM 11-巯基-1-十一醇(MUD)乙醇溶液中并在室温下温育过夜,随后分别用乙醇和超纯水洗涤,并用高纯氮气吹干备用。将干燥后的金芯片放入10mL含TEA(0.06M)的二氯甲烷中,并加入0.67 mL溴代异丁基酰溴(BMPB),轻微振荡混合均匀,在室温下反应6 min,反应结束后取出金芯片分别用二氯曱烷、乙醇、超纯水洗涤,并用高纯氮气吹干备用。
三、甲基丙烯酸酯(OEGMA)聚合物刷构建
将10.0 mL单体OEGMA,0.30 mmol CuCl,0.06 mmol CuBr2,0.60 mmol BPY和10.0 mL超纯水加入50mL史莱克瓶中,混匀并通氮气去除溶解性的气体,将步骤二中获得的金芯片放置上述溶液中,氮气氛围下,室温反应0.5 h。反应结束后取出金芯片,用流水冲洗过夜去除可能吸附的有机物,最后用高纯氮气吹干备用。
四、麦芽糖-糖基受体单分子层构建
在氮气保护下将0.102 g八乙酰麦芽糖酯(MOA)溶于5 mL无水二氯甲烷中,并通氮气除去氧气,随后迅速将步骤三中处理过的金芯片浸入上述溶液中,并加入100 μL三氟化乙醚(BF3EtO2)作为催化剂。在冰浴中反应2h后挪至室温反应24 h。反应完成后依次用二氯甲院、乙醇、超纯水洗涤金芯片,并用高纯氮气吹干,随后将芯片放入甲醇钠-乙醇溶液(5 mg/mL)中常温下反应90 min,反应结束后用大量超纯水洗涤芯片,并用高纯氮气吹干备用。
五、酶催化多糖的延伸
将步骤四中构建的麦芽糖-糖基受体单分子层金芯片放入含80 nmol/L DSase的50.0mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH=5.2)中,在25℃振荡培养箱中温育2h。反应结束后超纯水洗涤金芯片,随后放入含10 mmol/L 蔗糖的 50.0 mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH=5.2)中,在25℃振荡培养箱中温育2h。反应结束后超纯水洗涤金芯片,并用超纯氮气吹干,真空储存。
实验流程原理见图1,实验结果如图2、3所示。其中图2中a-d为不同步骤中得到的金芯片表面XPS图谱,其O/C值逐渐增大,随着Dsase催化糖基化聚合的进行,表面引入糖基量增多;图3中可以发现随着蔗糖浓度的提高,酶催化初始速率(v0)逐渐增大,麦芽糖锚定的POEGMA刷子的酶促伸长也随之增长,表面支化葡聚糖固定的量也逐渐增大,并对v0与蔗糖浓度进行拟合,得到DSase在麦芽糖单分子层表面的kcat值为0.021s-1,km值为8.09 mM,表明麦芽糖受体聚合物刷表面DSase催化聚合反应速率较低,反应相比于麦芽糖单分子层表面不太容易进行。
实施例2
根据实施例一构造的糖聚合物刷进行厚度测试
相较于使用两步法制造金表面上仅具有1.74nm厚度的ATRP引发剂层(表1)。我们采用典型的SI-ATRP程序合成高密度聚合物刷(0.7链nm-2)。POEGMA刷子厚度固定在20nm,且只需要简单的控制ATRP时间。基于这些结果,我们最终制作了具有一定厚度(23.15nm,酶促延伸时间为72h)和高链密度(0.7链nm-2)的支化糖聚合物刷。
表1
Br-SAM,POEGMA,麦芽糖-β-八乙酰基锚定的POEGMA刷(MOA-a-POEGMA),麦芽糖锚定的POEGMA刷(麦芽糖-α-POEGMA)和多糖(葡聚糖)-锚定的POEGMA刷的厚度(葡聚糖-A-POEGMA)
实施例3
测试实施例一中所制备的梳状糖基化聚合物刷对不同蛋白的吸附比较
通过QCM实时监测POEGMA,麦芽糖-α-POEGMA和葡聚糖-α-POEGMA刷表面上的蛋白质吸附测量。本研究使用了三种蛋白质BSA,RCA120和Con A,并对吸附行为进行了详细比较(图4)。 POEGMA刷表面具有高度抗蛋白质,用PBS洗涤后残留的蛋白质低于3.0ng.cm-2。麦芽糖-α-POEGMA和葡聚糖-α-POEGMA刷表面显示出对Con A的特异性吸附,但具有对BSA和RCA120的高蛋白质抗性(非特异性吸附低于3.0ng.cm-2)。结果,在以下研究中选择Con A作为模型蛋白质。结果表明,约753.3和1441.3ng.cm-2的Con A分别吸附在麦芽糖-α-POEGMA和葡聚糖-α-POEGMA刷表面上。重要的是,用PBS洗涤后,超过50%的吸附的Con A保留在刷子表面上。 Con A(0.1 mg / mL)对麦芽糖-α-POEGMA和葡聚糖-α-POEGMA刷表面的吸附动力学研究如图5所示。Con A的吸附量在开始时急剧增加,然后趋于平稳。两个糖聚合物刷上的饱和值接近。 Con A对麦芽糖-α-POEGMA刷的结合能力约为1918.5ng.cm-2,而葡聚糖-α-POEGMA刷的结合能力增加至2826.8ng.cm-2。这种显着增强的Con A结合能力可归因于碳水化合物配体与蛋白质识别位点之间的良好匹配距离以及增加的糖聚合物侧链。
实施例4
实施例1的表征数据分析
AFM图像还显示表面上存在额外的材料。 POEGMA刷的峰—谷高度为12.569 nm。麦芽糖锚定导致峰—谷高度略微增加(13.432nm)。之后,酶促伸长使得峰—谷高度增加1.77倍,这些结果表明在金表面上形成了大量的支化糖聚合物。
Claims (8)
1.一种化学-酶法制备梳状糖基化聚合物刷的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)将金芯片在氮气流下用乙醇冲洗,随后浸入氨水-过氧化氢-超纯水的混合物中,最后用超纯水和乙醇冲洗后,在稳定的氮气流下干燥,备用;
2)将步骤1)中金芯片浸入11-巯基-1-十一醇乙醇溶液中,随后放入含三乙胺的二氯甲烷中,加入溴代异丁基酰溴进行反应,反应结束后用二氯曱烷、乙醇、超纯水洗涤,高纯氮气吹干备用;
3)将步骤2)中金芯片加入甲基丙烯酸酯、CuCl、CuBr2、联吡啶和超纯水混合液中反应,反应结束后用流水冲洗过夜去除可能吸附的有机物,最后用高纯氮气吹干备用;
4)将步骤3)中金芯片浸入含八乙酰麦芽糖酯的无水二氯甲烷中,加入三氟化乙醚作为催化剂反应,反应完成后依次用二氯甲院、乙醇、超纯水洗涤金芯片,并用高纯氮气吹干,随后将芯片放入甲醇钠-乙醇溶液中进行脱乙酸基反应,反应结束后用大量超纯水洗涤芯片,并用高纯氮气吹干备用;
5)将步骤4)中金芯片放入含葡聚糖蔗糖酶的乙酸-乙酸钠溶液中进行反应,随后放入含蔗糖的乙酸-乙酸钠溶液中进行反应,反应结束后超纯水洗涤金芯片,并用超纯氮气吹干,真空储存。
2.根据权利要求1所述的一种化学-酶制备梳状糖基化聚合物刷的方法,其特征在于,步骤1)中氨水-过氧化氢-超纯水的混合物中三种物质体积比为1:1~2:5~10,浸入时间为10~15 min。
3.根据权利要求1所述的一种化学-酶制备梳状糖基化聚合物刷的方法,其特征在于,步骤2)中11-巯基-1-十一醇乙醇溶液浓度为1 mM,二氯甲烷中三乙胺浓度为0.06 M~0.08M,反应时间为5~10 min。
4.根据权利要求1所述的一种化学-酶制备梳状糖基化聚合物刷的方法,其特征在于,步骤3)中甲基丙烯酸酯为10.0~20.0 mL, CuCl 0.30~0.60 mmol、CuBr2 0.05~0.10 mmol、BPY 0.50~0.80 mmol,反应时间为10~60 min。
5.根据权利要求1中所述的一种化学-酶制备梳状糖基化聚合物刷的方法,其特征在于,步骤4)中八乙酰麦芽糖酯浓度为20 g/L,无水二氯甲烷加入量5~10 mL,催化剂BF3EtO2加入量为50~100 μL,前期冰水浴中反应2 h,随后室温下反应12~36 h。
6.根据权利要求1中所述的一种化学-酶制备梳状糖基化聚合物刷的方法,其特征在于,步骤4)中甲醇钠-乙醇溶液浓度为5 mg/mL,脱乙酸基反应时间为60~120min。
7.根据权利要求1中所述的一种化学-酶制备梳状糖基化聚合物刷的方法,其特征在于,步骤5)中蔗糖浓度为0~25 mM,在含DSase及含蔗糖的乙酸-乙酸钠溶液中在25℃下温育2~3 h。
8.根据权利要求2中所述的一种化学-酶制备梳状糖基化聚合物刷的方法,其特征在于,氨水的质量浓度为28%,过氧化氢的质量浓度为30%。
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102030482A (zh) * | 2010-10-13 | 2011-04-27 | 中国科学院化学研究所 | 一种纳米级图案化的二元聚合物刷的制备方法 |
EP2807177A1 (en) * | 2012-01-27 | 2014-12-03 | The Regents of The University of California | Stabilization of biomolecules using sugar polymers |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102030482A (zh) * | 2010-10-13 | 2011-04-27 | 中国科学院化学研究所 | 一种纳米级图案化的二元聚合物刷的制备方法 |
EP2807177A1 (en) * | 2012-01-27 | 2014-12-03 | The Regents of The University of California | Stabilization of biomolecules using sugar polymers |
WO2014194244A1 (en) * | 2013-05-30 | 2014-12-04 | Duke University | Enzyme-catalyzed synthesis of site-specific and stoichiometric biomolecule-polymer conjugates |
Non-Patent Citations (1)
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方艳: "酶催化表面仿生"糖被"的构建及其应用基础研究", 《中国博士学位论文全文数据库工程科技I辑》 * |
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