JPH08510833A - ポリマー変態を基礎とするセンサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 電極のポリマー被膜のインピーダンス分析を基礎としたセンサ形態を提供する。ポリマー被覆電極に又のその極近くに反応性又は触媒種を作用させることにより、検出可能な信号を発生させる。前記反応性又は触媒種は直接又は間接的に前記ポリマー層の反応を起こさせ、その際該ポリマー層は多孔質になって、電極表面での電気的特性の測定可能な変化を惹起する。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリマー変態を基礎とするセンサ 発明の背景 生物学的成分、例えば酵素で検出される電気化学的トランスジューサを基礎と するセンサの構想は、簡単かつエレガントであり、かつ最少の試料調製で試薬不 要の臨床分析の見込み提供する。この医療用途のためのアプローチの大きな利点 は操作が簡単なことであり、従って測定を実施するために訓練した実験室操作員 の必要性を排除する。このことは分散した実験室にセンサの設置しかつ臨床医に 対する臨床情報の一層迅速な返報を可能にする。純益は適当な治療の一層迅速な 設定にある［Recent Advances in Clinical Chemistry，Vol．3，Alberti，KGMM and Price，CP（eds），Churchill Livingston 1985］。しかしながら、若干の 場合には、該構想は身近の患者の検査にとって好適な実地の作業装置に移行した 。電気化学的方法を基礎とする市販のバイオセンサは、電位差計法か又は電流滴 定法のいずれかであり、かつ特定の臨床学的に重要な分析のためのものであり、 これらの技術の両者ともバイオセンサ開発のための欠点を有する。このような問 題を回避しかつ分散した実験室に設置するために好適な特殊な高感度の技術を開 発するために、操作中にｐＨの変化 に基づき変性されかつ該被膜の下にある電極のインピーダンスにおける高感度の 変化を惹起するポリマー膜を基礎とするセンサを構成する可能性を見出した。 この類型の方法に関する技術は、例えば米国特許第４３５２８８４号明細書及 び欧州特許公開第０３１１７６８号明細書に開示されている。米国特許第４３５ ２８８４号明細書には、尿素の測定のために使用される生物活性材料を固定する ためにアクリレートコポリマー被覆を有するｐＨ電極が記載されている。 この方法は、抗原、抗体及び酵素のような生物活性物質の固定を行うためだけ っであって、測定プロセスには関与しない。ポリマー被膜をｐＨ電極で使用する ことは、運動範囲が小さくかつ感度が悪いという欠点を有する。 欧州特許公開第０３１１７５６８号明細書には、酵素抱合体を使用する均質免 疫検定の１つの結果として一層導電性になる電極上に被覆した半導体ポリマーの 変態が記載されている。この方法は、系に該系を撹乱することができる大きい電 圧（５００ｍＶ）を印加する抵抗の測定を基礎とする。この方法は１０の一乗ま での変化を惹起するに過ぎないとみなされ、従って本発明で記載する方法ほど高 感度でない。 本発明においては、電極上のポリマー被膜のインピーダンス分析を基礎とし、 簡単な製造及び測定技術が必要であるにすぎない新規のセンサ形態を提供する。 電極のインピーダンスは多数のファクターに対して感応する。電極インピーダ ンスの変化は、しばしば二重層キャパシタンスの変化により惹起される。二層層 キャパシタンス（Ｃ_d1）は、電極の表面での金属内の素電荷と、金属と接触した 溶液内の（移動性）イオン電荷との間の分離から生じる。塩化カリウムの水溶液 と接触した金属（例えば金）に関しては、この分離は金属表面上に水分子の層の 存在に基づく。この二重層キャパシタンスは、平板コンデンサに関しては以下の 標準方程式から計算することができる： Ｃ_d1＝^eｏ^eｒＡ／ｄ （１） ここで、 ^eｒは水相の有効誘電定数、 Ａは電極面積及び ｄは水分子の直径である。 水分子の代わりに金属と水溶液の間に絶縁ポリマー層が存在すれば、前記方程 式（１）はなお成り立つが、但しｄはポリマー層の厚さを表す。 ところで、このようなポリマーにおける微小な欠陥の発生は、容易に測定する ことができるキャパシタンスの急激な増大を惹起することが判明した。 電極のインピーダンスは、小さいピーク・ツー・ピーク振幅の正弦波電位（典 型的には＜１０ｍＶ）を電極に印加しかつ生じた正弦波電流を測定することによ り確認される。使用される周波数の範囲は１０⁵Ｈｚ 〜１０^-3Ｈｚである。一般に電位と電流の間には位相差（ｑ）が存在するので、 電位の電流に対する比は実質的に、大きさ（｜Ｚ｜）及び方向（ｑ）を有するベ クトル量である。インピーダンス測定値は、インピーダンスベクトルの２つの成 分（Ｚ′，Ｚ″）の２つの成分がそれぞれに対して１つのパラメータとしての周 波数でプロットされる複雑なインピーダンス面で表される。 電極インピーンスを十分に規定するためには、定常状態条件下で測定しなけら ばならない。電極状態が変化すれば、インピーンスは、変加速度に依存する周波 数の上の周波数で十分に規定されるにすぎない。原則として、インピーダンス測 定は、定常電流が溶液中の種（species）の酸化又は還元に基づき導通する場合 に行うことができる。 発明の概要 電極のインピーダンスは、多くの方法で変化させることができる。例えば電極 上へのタンパク質の吸着は電極インピーダンスを変化せしめる。しかしながら、 センサとして有用であるためには、インピーダンスの変化は、検出される物質に 対して高度に特異的でありかつ高い選択性を与えるべきである。 本発明は、電極表面からの絶縁ポリマー被膜の部分的又は完全な除去の結果と して電極のインピーダンスの変化を惹起する酵素反応の現象を頼みにする。ポリ マー変態の結果を測定する別の方法、例えば分極した電極での増大した電流の測 定をもくろむこともできる。酵素又は触媒は、ポリマーと反応することができる か、又は直接ポリマー膜を加水分解することができる生成物を産生する。 前記酵素又は触媒は、ポリマー内に又はポリマーに直接結合されていてもよく 、バルク（bulk）溶液中に存在するか、又は酵素標識抱合体との抗体−抗原交互 作用を介してポリマーに結合されているか、又はポリマー被覆電極に密接した多 孔性膜に結合されていてもよい。前記例はこの系の可能な形態を制限するもので はない。 もう１つの可能な実施態様は、ｐＨを変化させ、次いでポリマーを可溶性にし 、ポリマーの下にある電極への電解液の通過を可能にし、それによりインピーン スの大きな変化を惹起する酵素反応によりポリマー被膜を変態させることである 。 酵素とポリマー被膜との多くの適当な組み合わせの１つは、ウレアーゼと、錠 剤の腸溶皮で使用されるような材料との組み合わせである。これらの被膜は、胃 の低いｐＨでは不溶性であるが、腸内のｐＨ値（ｐＨ６以上）では可溶性である 。このような被膜材料の例は、セルロースアセテートヒドロゲンフタレート、メ チルビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマーエステル、メタクリル酸とメタ クリル酸のエステルとのア ニオン性重合生成物（Roehm Pharma，西ドイツ、ダルムシュタット在のEudragit^(R) ）である。 １つの特殊な反応においては、ウレアーゼは、以下の反応式： Ｈ₂Ｏ＋尿素→２ＮＨ₃＋ＣＯ₂ ＮＨ₃＋Ｈ₂Ｏ→ＮＨ₄ ⁺＋ＯＨ^- に基づき尿素のアンモニアと二酸化炭素への分解を触媒する。 生じるｐＨ値の増大が前記材料を可溶性にする。 もう１つの実施態様は、透過性が外部媒体中のｐＨ変化によって可逆的に制御 されるｐＨ感応性ポリマーを適用することである。この場合には、ポリマー、ポ リ４−ビニルピリジンが電極表面に被覆されており、かつｐＨが酸性になれば、 イオンに対する透過率が増大し、該透過率の増大を電極におけるインピーダンス の増大によって測定する。多くの酵素反応は、ｐＨ値を酸性にすることができる 。１つの特殊な反応においては、グルコースオキシダーゼが、以下の反応式に基 づきグルコースのグルコノラクトンとペルオキシドへの分解を触媒する： グルコース＋Ｏ₂→グルコノラクトン＋Ｈ₂Ｏ₂ 該ポリマーの透過性は可逆的でありかつ多数回再使用することができる。 抗体を前記感応性ポリマーに固定すれば、免疫検定においてウレアーゼ標識抱 合体を捕獲することができ る。その際、結合したウレアーゼ抱合体は、局所的ｐＨ変化を生じ、該変化は抱 合体捕獲地点におけるポリマーの可溶化を惹起する。極めて意想外にも、我々は 、バルク溶液の緩衝能力に基づき、溶液内の重要なｐＨ変化が起こらない溶液中 で局所的可溶化を起こし得ることを見出した。 また、この方法を、電極が電解液と接触するようになると、反応性成分を産生 することができる電位で作業電極を分極することにより強化することも可能であ る。電極を−６００ｍＶでＡｇ／ＡｇＣｌに対して分極すれば、反応は、ポリマ ー層がまさに分解を開始して、ある程度の少量の電解液が電極と接触するまで起 こらない。次いで、電極表面での酸素還元がＯＨ^-を生成し、該ＯＨ^-は局所的ｐ Ｈを更に上昇させかつポリマーの分解を促進する。このことは初期の信号のかな りの増幅を生じる。 別の態様においては、フェントン（Fenton）反応と関連したグルコースオキシ ダーゼのようなＨ₂Ｏ₂産生酵素を使用することを可能にする。この反応は、一般 にヒドロキシレート芳香族炭化水素のための合成有機化学で使用され、かつ極端 に反応性の基ＯＨ・を生成する、例えば： Ｈ₂Ｏ₂＋Ｆｅ²⁺→Ｆｅ³⁺＋ＯＨ^-＋ＨＯ・ 前記ヒドロキシル基は、有機種に遭遇するまで残存するに過ぎないほど反応性 である。この場合には、Ｈ Ｏ基と反応する構造要素を含有するポリマー被膜が選択される。ヒドロキシル基 の導入は、二重層キャパシタンスの著しい増大を惹起する被膜の可溶性を強化す る。 実施例 以下の実施例は、本発明を更に説明するものである。該実施例は説明の目的の ためであって、本発明の限界を規定しようとするものではない。 一般的機構 スクリーン印刷により形成した平面炭素電極（直径１ｍｍ）に、以下のように してセルロースアセテートフタレート（ＣＰＡ）（Kodak）を被覆した： ＣＰＡの試料７０ｍｇをジエチルフタレート可塑剤３０ｍｇと混合し、アセト ン４００ｍｇに加えて、粘性溶液を製造した。次いで、この溶液のアリコート５ μｌを作業電極に施しかつ空気中で室温で乾燥させた。 被覆した電極のキャパシタンスを周波数応答分析器（Schlumberger）を使用し て塩化ナトリウム１５０ミリモルｌ^-1（ｐＨ４）で測定し、炭素電極のキャパシ タンスと比較した。次いで、被覆した電極を塩化ナトリウム１５０ミリモルｌ^-1 （ｐＨ６．５）に１５分間曝し、キャパシタンスを再測定した。 被覆した電極を溶液にｐＨ６．５で曝した場合、電極のキャパシタンスの１６ ０倍の増大が生じた。 金棒電極（直径４ｍｍ）に以下のようにしてセルロースアセテートフタレート （ＣＰＡ）（Kodak）を被覆した。 電極を１：８ｗ／ｗＣＡＰ／３０％ジエチルフタレート可塑剤／アセトン混合 物を使用して１回浸漬被覆し、室温で３０分間乾燥させた。 被覆した電極のキャパシタンスを周波数応答分析器（Schlumberger）を使用し て塩化ナトリウム１４０ミリモルｌ^-1（ｐＨ４）で、銀／塩化銀基準及び金対電 極を使用した３電極配置で測定した。被覆した電極を５分後と１時間後に測定し た。ｐＨ４溶液をセルから除き、塩化ナトリウム１４０ミリモルｌ^-1（ｐＨ６． ５）と入れ替え、キャパシタンスを３０分間隔で測定した。 これらの結果は、第１図にグラフで示されている。 腸溶皮、ＣＰＡ及びEudragit S 100ポリマーのｐＫａ値を塩基に対する水溶液 中の固体の滴定により計算した。両者のポリマーのｐＨ感受性は酸エステル基の 脱プロトン化の直接的結果であるので、該ｐＫａ値はポリマーの分解ｐＨに相応 する。ＣＰＡのｐＫａはほぼ６．０及びEudragit S 100のｐＫａはほぼ７．０で あった。 ウレアーゼを使用したセルロースアセテートフタレート被膜の分解 棒状金電極（直径４ｍｍ）にＣＰＡを前記と同様に被覆しかつガラスセル内に 挿入した。緩衝溶液は、塩酸（０．１Ｍ）を使用してｐＨ４．８に調整したＥＤ ＴＭ（０．５ｍＭ）、塩化ナトリウム（１４０ｍＭ）、尿素（１６ｍＭ）であっ た。 ｐＨ４．８で３０分後と６０分後にキャパシタンスを測定し、次いでウレアー ゼ（１ｍｇｍｌ^-1溶液２０μｌ）を添加し、キャパシタンスを９０、１２０及び １５０分後に測定した。 これらの結果は図２にグラフで示されており、酵素ウレアーゼを使用すること によりＣＡＰポリマー被膜を分解し、ひいてはｐＨの変化を惹起しかつ電極キャ パシタンスの１０の四乗の多き変化を生じることが可能であることを確認される 。 ウレアーゼを使用したEudragit S 100ポリマーの分解 棒状金電極（直径４ｍｍ）を、ジブチルフタレート可塑剤２０％ｗ／ｗ及びTw een 80 ５％ｗ／ｗを含有するアセトン中のEudragit S 100（Roehm Pharma）２ ０％ｗ／ｗを使用して２回浸漬被覆し、かつアセトンで飽和した雰囲気内に１５ 分間置いた。次いで、電極を取り出しかつ室温で３０分間乾燥させた。 ＥＤＴＭ０．２ｍＭ、ＮａＣｌ０．１５Ｍ、ｐＨ５．８及び尿素範囲５〜５０ ｍＭからなる緩衝液１ｍｌを入れたガラスセルを使用した。初期とウレアーゼ添 加（０．１ｍｇｍｌ^-1）後のキャパシタンス値を求めた。時間の関数としてのイ ンピーダンスの変化率は尿素濃度に依存した。１０分後のキャパシタンスの初期 のキャパシタンスに対する比（Ｃｆ／Ｃｏ）は、第３図に尿素濃度の関数として 示されている。これは明白 に、尿素はこの方法により測定することができかつ信号の大きな変化が含まれる ことを示している。 尿素濃度に基づくEudragit S 100ポリマーの限界／時間分解 ステンレススチールディスク（直径１０ｍｍ）に、Eudragit S 100ポリマーを スプレーした。該ポリマー組成は、アセトン１．７ｇ中に溶解したEudragit S 1 00（Roehm Pharma）１．１ｇからなっていた。該混合物にジブチルフタレート０ ．２５ｇ及びTween 80 ０．３ｇを添加した。これを圧搾空気シリンダ（２０ｌ ｂｆ／ｉｎ²）に取り付けたスプレーノズルを使用してステンレススチール電極 の表面に塗布した。最適なスプレー条件は、塗布の間に３０分間の乾燥を伴うポ リマーの２回の塗布であることが立証された。 ０．３８ｃｍ²の免疫色素膜（Pall Biosupport）に、ＰＢＳ中のウレアーゼ５ ｍｇｍｌ^-1を、４℃で１６時間膜の表面に５０μｌを塗布することによりローデ ィングした。該膜をＮａＣｌ１４０ｍＭ，ＥＤＴＡ０．２ｍＭ溶液で洗浄した。 膜をポリマー電極の表面に置き、ガスケットを膜／電極の表面に被せ、かつ電 気化学セル内に入れた。該セルにＮａＣｌ１４０ｍＭ，ＥＤＴＡ０．２ｍＭ，ｐ Ｈ５．８溶液を充填した。 ポリマー被膜の保全性を試験するために、周波数範囲２０ｋＨｚ〜１０ｍＨｚ にわたってインピーダンス 測定を実施した。該被膜の試験の終了後に、適当な量の尿素を添加することによ り実験を開始した。キャパシタンスを、ポリマー被膜が分解するまで、２０ｋＨ ｚの周波数で時間と共に追跡した。 第４図及び第５図に示されている結果は、明らかに尿素の限界測定の基準を示 している。 有機金属電極上のポリ（４−ビニルピリジン）（ＰＶＰ）被膜 酸性ｐＨで分解すると見なされるポリマー被膜としてのＰＶＰの使用を試験す るために実験を実施した。 有機金属金電極に、ポリマー（Aldrich，Chem．Co．，UKからメタノール中で 提供）を浸漬被覆し、次いで該電極を乾燥のために１６時間放置した。 次いで電極の試験を以下のようにして実施した： インピーダンス測定を周波数範囲２０ｋＨｚ〜１６時間Ｈｚにわたり測定し、 かつキャパシタンス値を２０ｋＨｚで計算した。該電極を０．１Ｍ炭酸塩緩衝液 （ｐＨ９．６）を充填したセルに入れ、初期キャパシタンス測定を行った。次い で６０分後の値を測定した。引き続き、緩衝液を０．２ｍＭ ＥＤＴＡ／１４０ ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ５．８と入れ替えた。５分後と３０分後にキャパシ タンス測定を行った。最後に、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６を再導入し、更 にキャパシタンス測定を５分後と３０分後に行った。 第６図は明らかに、ポリマー被膜の絶縁特性のｐＨ 依存性及びこのｐＨの可逆性特性を示す。 ポリマー分解を基礎としたビオチン免疫検定 免疫検定原理を説明するためにモデル実験を実施した。 アビジン被覆膜を以下のようにして調製した：５×５試験片をＨ₂Ｏを使用し て湿潤し、次いでWhatman No.１フィルタ紙片の上に置き、ＰＢＳ，ｐＨ７．４ 中の５ｍｌ^-1アビジン溶液１４０ｍｌで飽和させた。１時間後、該膜をＰＢＳ中 で濯ぎかつＰＢＳ中の０．１％グルタルアルデヒド１０ｍｌを添加した。２時間 後、該膜を水及びＰＢＳ中で濯いだ。 次いで、膜ディスクをビオチンスタンダード（ＰＢＳ中０〜１００μｇｍｌ^-1 （ｐＨ７．４）２００μｌ）及びビオチンウレアーゼ（Biogenesis，ＵＫ）抱合 体（ＰＢＳ中１／５０希釈（ｐＨ７．４）２００μｌ）で室温で２時間インキュ ベートした。次いで、該膜を取り出し、水中で２回、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ／１ ４０ｍＭ ＮａＣｌ中で１回濯いだ。次いで、該膜を電気化学セル内の、Eudrag it S 100ポリマー被覆したステンレススチール・ディスクの上に置き、インピー ダンス分析を実施した。 セル中の９００μｌ ＮａＣｌ／ＥＤＴＡ溶液に１Ｍ尿素１００μｌを添加し かつピペットで混合することにより尿素濃度を調整した。尿素を添加した後イン ピーダンスを１時間モニターし、１５分毎にインピー ダンス値からキャパシタンス測定を行った。 本発明に基づく電気化学的検定は、当業者に公知の多くの異なった形態で使用 することができる。 例えば当業者に公知の任意の方法で、測定すべき分析物と分析物酵素抱合体又 は分析物類縁酵素抱合体が競合する電極に抗体を固定することが可能である。 サンドウィッチ形態のためには、分析物に対する第１の抗体を電極表面に固定 しかつ酵素で標識した第２の抗体を溶液中に存在させる。 競合形態のためには、捕獲抗体を固相に固定し、かつ次いで固相の抗体部位に 対して競合する標識抗体と非標識抗原を含有する試料を添加する。表示される標 識の量は、試料内の抗原の量に反比例する。 競合形態においては、該溶液はビオチン標識分析物又は分析物のビオチン標識 類似体を含有する。アビジンとの酵素抱合体も該溶液中に存在するか、又はビオ チン標識分析物又は分析物類似体と、固定した抗体で測定すべき分析物との捕獲 反応ごに加えることができ る。アビジン／ビオチンの代わりにほかの結合対、例えばＩｇＧ：抗ＩｇＧも同 様に使用することができる。 分析物と分析物の類似体が抗酵素抗体と抱合される競合検定も可能である。ま た溶液中には、測定される分析物及び遊離酵素も存在し、この場合発生信号は測 定される分析物濃度に反比例する。 また、サンドウィッチ形態又は競合形態のいずれかを、固相が被覆管又はマイ クロセルのいずれかの場合に使用することができる。この形態では、ポリマー被 覆電極を被覆管又はマイクロセルに浸漬し、そこでサブストレートとの酵素抱合 体反応がポリマーを変態させる。 もう１つの形態では、分析物と、分析物又は分析物の類似体と酵素の酵素抱合 体との間の競合は、分析物に対する抗体が表面に固定されたウィック（吸収性層 ）又は毛細管通路内で実施することができる。ウィック又は毛細管通路を通過し た後、結合しなかった分析物の酵素抱合体は、抗酵素抗体が固定された電極と接 触する。発生される信号は、存在する分析物の濃度に比例する。 図面の説明 本発明を第１〜６図により説明する。 第１図は、（ａ）非被覆金電極、（ｂ）ＣＡＰ被覆金電極（ｐＨ４．０）及び （ｃ）ｐＨ６．５の緩衝液 に浸漬した後のＣＡＰ被覆電極からのキャパシタンス結果を示す。 第２図は、時間の関数としてのＣＡＰ被覆金電極のキャパシタンス及びウレア ーゼ（100ｍｇ／ｍＬ２０μｌ）添加の効果を示す。 第３図は、異なった分析物（尿素）濃度に関するキャパシタンスを示す。 第４及び５図は、時間に関する分析物（尿素）濃度に基づくポリマー被覆電極 の分解を示す。 第６図は、時間の経過に伴うポリ（４−ビンイルピリジン）被覆電極に対する 溶液ｐＨの作用を示す。該電極はｔ＝０分で炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６内にあり、 （ａ）で、電極はＮａＣｌ／ＥＤＴＡｐＨ５．８（ｔ＝６０分）中にあり、その 後（ｂ）炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６中に戻した場合のキャパシタンスである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ // Ｃ０８Ｆ 220/04 ＭＬＲ 8619−4Ｊ Ｃ０８Ｆ 220/10 ＭＭＢ 220/10 ＭＭＢ 8619−4Ｊ 222/06 ＭＭＡ 222/06 ＭＭＡ 9362−4Ｊ Ｃ０８Ｈ 5/00 ＮＶＦ Ｃ０８Ｈ 5/00 ＮＶＦ 6807−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/26 Ｃ１２Ｑ 1/26 6807−4Ｂ 1/58 1/58 7363−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５３Ｚ 7363−2Ｊ ３５７ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 マクニール， カルム ジェイ イギリス国 エヌイー２ ３エヌエックス ニューキャスル―アポン―タイン ジェ スモンド イルフォード ロード 20 (72)発明者 アームストロング， ロナルド ディー. イギリス国 エヌイー２ ２エヌキュー ニューキャスル―アポン―タイン グロス ヴナー アヴェニュー 73 (72)発明者 マレン， ウィリアム ヘンリー アメリカ合衆国 イリノイ 60030 グレ イスレイク ディープ ウッド コート 833

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．分析物を含有すると見なされる試料内の分析物の存在を決定する確認する方 法であって、前記分析物は酵素又は触媒と反応し、その際検出可能な信号の量が 検定媒体中の分析物の量の関数であり、前記検出可能な信号を電極で測定する方 法において、 ａ）電極が、該電極を電解液から分離する電気絶縁ポリマーの薄膜で被覆さ れており、 ｂ）前記分析物との酵素又は触媒反応が直接又は間接的に前記電気絶縁ポリ マー層との反応を引き起こし、該反応の際にポリマー層は電解液に対して多孔質 又は一層多孔質になり、電極表面での電気的特性の変化を惹起する ことを特徴とする、試料中の分析物の存在を確認する方法。 ２．電気絶縁材料がｐＨ感応性ポリマーであり、かつ反応性又は触媒種が電極被 覆層の透過性を増大するために十分なｐＨ変化を惹起する、請求項１記載の方法 。 ３．反応性又は触媒種が、ｐＨ変化を惹起する反応を行う酵素である、請求項１ 記載の方法。 ４．反応性触媒成分がウレアーゼ又はグルコースオキシダーゼである、請求項２ 記載の方法。 ５．酵素−抗体又は酵素−抗原抱合体が特殊な免疫化 学反応を介してポリマー層に又はその極近くに結合され、該ポリマー層が電極を 被覆しておりかつ抱合体の酵素活性が電解液に対するポリマー層の透過性を増大 させ、該ポリマー層の下にある電極によりキャパシタンス又は通過電流の変化に 基づき測定する、免疫検定法。 ６．電極を、電極が電解液に曝されるようになって初めてポリマーの分解が促進 されるように、電解液の成分とレドックス反応を起こすことができる電位で分極 する、請求項１記載の方法。 ７．触媒種がヒドロキシル基の生成を惹起し、該ヒドロキシル基がポリマー層と 反応可能であり、それにより前記層の電解液に対する透過性を増大せしめる、請 求項１記載の方法。 ８．触媒種が過酸化水素産生オキシダーゼであり、かつ電解液がフェントン反応 を促進することのできる種を含有する、請求項７記載の方法。 ９．触媒種が、直接ポリマー層に作用して層の透過性を増大させるポリマー減成 酵素である、請求項１記載の方法。 10．触媒種がアミラーゼ又はアミログルコシダーゼでありかつ誘電体がポリサッ カリドからなるか又はポリサッカリドを含有する、請求項９記載の方法。 11．触媒種がエンドヌクレアーゼでありかつポリマーが核酸からなるか又は核酸 を含有する、請求項９記 載の方法。 12．触媒種がリパーゼでありかつポリマーが脂質からなるか又は脂質を含有する 、請求項９記載の方法。 13．酵素又は触媒がポリマー層内に存在する、請求項１記載の方法。 14．酵素又は触媒がポリマー層に結合されている、請求項１記載の方法。 15．酵素又は触媒が、ニトロセルロース膜のようなポリマー層又はその他の膜支 持体に密接した別の支持体に結合されている、請求項１記載の方法。 16．試料が水性の全血液、血清、血漿、尿又は唾液である、請求項１記載の方法 。