CN104391019B - 一种适配体电化学生物传感器，其制备方法以及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适配体电化学生物传感器，其制备方法以及用途，包括如下步骤：(1)将DNA序列分别溶解在PBS缓冲溶液中；(2)将金电极先进行抛光和清洗；(3)将含有探针S1和S2的缓冲溶液滴涂到金电极上，培养；(4)将PBS缓冲溶液滴涂在S2‑S1/GE电极上，培养；(5)将S2‑S1/GE放在PBS缓冲溶液中培养；清洗电极后得到Aptasensor；(6)将获得的Aptasensor在缓冲溶液中培养，通过DNA杂交连锁反应得到超夹心结构的修饰电极HP2‑HP1‑Aptasensor。(7)将HP2‑HP1‑Aptasensor培养在缓冲溶液中，得到银纳米簇修饰的电极AgNCs/HP2‑HP1‑Aptasensor。本发明生物传感器的制备方法，使用的纳米材料合成简单，耗能低，成本低，生物相容性好，探究并运用纳米材料的模拟酶催化活性作为电化学检测的信号，且运用DNA杂交连锁反应放大所制备的生物传感器检测的信号。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，具体涉及用DNA杂交连锁反应将具有模拟酶活性的银纳米簇组装到电化学生物传感器上并应用此传感器放大检测目标适配体溶菌素酶。
背景技术
近年来，对DNA的研究是生命科学研究中的一个极其重要的方面，DNA生物传感器的研究已成热点。有很多与此相关的研究致力于用DNA为模板的金属纳米材料(如：金纳米簇(AuNCs)、银纳米簇(AgNCs))作为DNA生物传感器的测定信号，但其中绝大多数的研究是运用金属纳米簇的光学性质，很少研究探究运用金属纳米簇的模拟酶活性。在放大DNA生物传感器检测信号的策略中，DNA杂交连锁反应，因其具有反应条件温和、背景信号小、无酶标记过程等内在优势，可以作为很好的信号放大策略而被广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适配体电化学生物传感器，其制备方法以及用途，尤其一种基于DNA杂交连锁反应和银纳米簇的模拟酶催化作用的适配体电化学生物传感器的制备及其放大检测适配体的应用，利用目标适配体与特定DNA的特异性结合作用，运用DNA杂交连锁反应在金电极的表面组装电化学生物传感器，应用于目标适配体分子的检测。具体技术方案如下：
一种适配体电化学生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)将DNA序列分别溶解在PBS缓冲溶液中；
(2)将金电极(GE)先进行抛光和清洗；
(3)将含有探针S1和S2的缓冲溶液滴涂到金电极上，培养得到S2-S1/GE；
(4)将含有一定浓度的适配体的PBS缓冲溶液滴涂在S2-S1/GE电极上，培养；清洗电极后得到Aptasensor；
(5)将获得的Aptasensor在含有HP1和HP2的缓冲溶液中培养，通过DNA杂交连锁反应得到超夹心结构的修饰电极HP2-HP1-Aptasensor。
(6)将HP2-HP1-Aptasensor培养在含有银离子和硼氢化钠缓冲溶液中，得到银纳米簇修饰的电极AgNCs/HP2-HP1-Aptasensor。
进一步地，步骤(1)中，DNA序列包括：巯基化DNA：S1、与适配体特异性结合DNA：S2、发夹DNA 1：HP1、发夹DNA 2：HP2；所述DNA分别溶解在pH 7.4的PBS缓冲溶液中，并在低温下下保存备用。
进一步地，步骤(2)中，包括如下步骤：
(2-1)将金电极用0.3μm的铝粉进行抛光处理；
(2-2)将金电极用0.5μm的铝粉进行抛光处理；
(2-3)放入HNO3:H2O(v/v)＝1:1溶液，进行超声波清洗，超声清洗的时间为3～5min；
(2-4)放入乙醇溶液，进行超声波清洗，超声清洗的时间为3～5min；
(2-5)放入超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间为3～5min。
进一步地，步骤(3)中，将含有探针S1和S2的缓冲溶液滴涂到表面处理干净的金电极上，培养6-10h,通过Au-S共价键作用自组装S1和S2修饰的金电极(S2-S1/GE)。
进一步地，步骤(4)中，将含有一定浓度的适配体的PBS缓冲溶液滴涂在S2-S1/GE电极上，培养约30～40min后得到Aptasensor；彻底清洗后的修饰电极用氮气干燥，保存备用。
进一步地，步骤(5)中，将获得的Aptasensor在含有HP1和HP2的缓冲溶液中培养约10h，通过DNA杂交连锁反应得到超夹心结构的修饰电极HP2-HP1-Aptasensor。
进一步地，步骤(6)中，在HP2的3’端是一段富胞嘧啶的序列，将HP2-HP1-Aptasensor培养在含有银离子和硼氢化钠的缓冲溶液中，得到银纳米簇修饰的电极(AgNCs/HP2-HP1-Aptasensor)。
一种适配体电化学生物传感器，采用如权利要求上述适配体电化学生物传感器的制备方法制得。
上述适配体电化学生物传感器的用途，由于适配体的浓度不同，形成的Aptasensor上的S1DNA链的量就会不同，进而通过通过DNA杂交连锁反应得到超夹心结构修饰电极上的AgNCs的量就会不同，随着适配体浓度的增加，组装到传感器上的AgNCs的量也会随之增加，因此此传感器可对不同浓度目标适配体进行定量检测。
与目前现有技术相比，本发明生物传感器的制备方法，使用的纳米材料合成简单，耗能低，成本低，生物相容性好，探究并运用纳米材料的模拟酶催化活性作为电化学检测的信号，且运用DNA杂交连锁反应放大所制备的生物传感器检测的信号。通过适配体与特定DNA之间的特异性结合作用，制备了一种无标记的、灵敏的、“turn-on”的检测适配体的电化学生物传感器。结果显示此生物传感器对目标适配体分子的检测结果令人满意，检测的线性范围较宽，约从10-10M到10-5M范围内有较灵敏的检测，且具有灵敏度高、检测限低、选择性好、稳定性好的特点。此外，鉴于本电化学生物传感器是利用适配体与特定DNA之间的特异性结合作用将S1和S2修饰的金电极(S2-S1/GE)组装成Aptasensor，我们也可以利用胞嘧啶-银离子-胞嘧啶等的碱基错配结合方法，得到Aptasensor，因此本生物传感器有望成为一种检测平台实现对适配体(比如三磷酸腺苷或者凝血酶等)的普适检测或者小分子分析物(比如银离子或者汞离子等)的灵敏检测。
附图说明
图1为基于DNA杂交连锁反应和银纳米簇的模拟酶催化作用的适配体电化学生物传感器制备的示意图；
图2为制备的AgNCs纳米材料的透射电镜图；
图3(A)为组装的电化学生物传感器中银纳米簇的循环伏安图；
图中：
a为裸的金电极的循环伏安图。
b为AgNCs与S3、HP1修饰的Aptasensor循环伏安图；
c为AgNCs与HP2、HP1修饰的Aptasensor循环伏安图；
图3(B)为每一步电极修饰过程电极的阻抗图；
图中：
a为裸的金电极的阻抗图。
b为S2和S1修饰的金电极的阻抗图。
c为S2-S1/GE在含适配体的缓冲液中培养后获得的Aptasensor的阻抗图。
d为HP2、HP1修饰的Aptasensor阻抗图；
e为AgNCs与HP2、HP1修饰的Aptasensor阻抗图；
图3(C)为不同修饰电极对双氧水催化的循环伏安图；
图中：
a为裸的金电极的循环伏安图；
b为S2和S1修饰的金电极的循环伏安图；
c为S2-S1/GE在含适配体的缓冲液中培养后获得的Aptasensor的循环伏安图；
d为AgNCs与HP2、HP1修饰的Aptasensor的循环伏安图；
e为AgNCs与S3、HP1修饰的Aptasensor的循环伏安图；
f为HP2、HP1修饰的Aptasensor的循环伏安图；
图4(A)为基于DNA杂交连锁反应和银纳米簇的模拟酶催化作用的适配体电化学生物传感器对不同浓度双氧水催化的循环伏安图；
图4(B)为此传感器对不同浓度双氧水催化的标准曲线。
图5(A)为基于DNA杂交连锁反应和银纳米簇的模拟酶催化作用的适配体电化学生物传感器对不同浓度目标适配体分子检测的循环伏安图；
图5(B)为基于DNA杂交连锁反应和银纳米簇的模拟酶催化作用的适配体电化学生物传感器对不同浓度目标适配体分子检测的计时电流图；
图5(C)为基于DNA杂交连锁反应和银纳米簇的模拟酶催化作用的适配体电化学生物传感器对不同浓度目标适配体分子检测的的标准曲线。
具体实施方式
下面根据附图对本发明进行详细描述，其为本发明多种实施方式中的一种优选实施例。
基于DNA杂交连锁反应和银纳米簇的模拟酶催化作用的适配体电化学生物传感器的制备及其放大检测适配体的应用包括如下步骤：
a、将购买的DNA序列(巯基化DNA：S1、与适配体特异性结合DNA：S2、发夹DNA 1：HP1、发夹DNA 2：HP2)分别溶解在PBS(pH 7.4)缓冲溶液中，并在低温下下保存备用。
b、将金电极先依次用0.3和0.5μm的铝粉进行抛光处理，再依次放入HNO3:H2O(v/v)＝1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。
c、将含有探针S1和S2的缓冲溶液滴涂到表面处理干净的金电极上，培养6-10h,通过Au-S共价键作用自组装S1和S2修饰的金电极(S2-S1/GE)。然后将含有巯基乙醇的PBS缓冲溶液滴涂在S2-S1/GE电极上，培养约30～40min。彻底清洗后的修饰电极用氮气干燥，保存备用。
d、将S2-S1/GE放在含有一定浓度的适配体的PBS缓冲溶液中培养约30～40min，清洗电极后得到Aptasensor。然后将获得的Aptasensor在含有HP1和HP2的缓冲溶液中培养约10h，通过DNA杂交连锁反应得到超夹心结构的修饰电极(HP2-HP1-Aptasensor)。由于HP2的特别设计，在HP2的3’端是一段富胞嘧啶的序列，将HP2-HP1-Aptasensor培养在含有阴离子和硼氢化钠的缓冲溶液中，可得到银纳米簇修饰的电极(AgNCs/HP2-HP1-Aptasensor)。基于DNA杂交连锁反应和银纳米簇的模拟酶催化作用的适配体电化学生物传感器制备成功。
e、由于适配体的浓度不同，形成的Aptasensor上的S1DNA链的量就会不同，进而通过通过DNA杂交连锁反应得到超夹心结构修饰电极上的AgNCs的量就会不同，随着适配体浓度的增加，组装到传感器上的AgNCs的量也会随之增加，因此此传感器可对不同浓度目标适配体进行定量检测。
上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种适配体电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将DNA序列分别溶解在PBS缓冲溶液中；
(2)将金电极(GE)先进行抛光和清洗；
(3)将含有探针S1和S2的缓冲溶液滴涂到金电极上，培养得到S2-S1/GE；
(4)将含有一定浓度的适配体的PBS缓冲溶液滴涂在S2-S1/GE电极上，培养；清洗电极后得到Aptasensor；
(5)将获得的Aptasensor在含有HP1和HP2的缓冲溶液中培养，通过DNA杂交连锁反应得到超夹心结构的修饰电极HP2-HP1-Aptasensor；
(6)将HP2-HP1-Aptasensor培养在含有银离子和硼氢化钠的缓冲溶液中，得到银纳米簇修饰的电极AgNCs/HP2-HP1-Aptasensor；
步骤(1)中，DNA序列包括：巯基化DNA：S1、与适配体特异性结合DNA：S2、发夹DNA 1：HP1、发夹DNA 2：HP2；所述DNA分别溶解在pH 7.4的PBS缓冲溶液中，并在低温下保存备用。
2.如权利要求1所述的适配体电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，包括如下步骤：
(2-1)将金电极用0.3μm的铝粉进行抛光处理；
(2-2)将金电极用0.5μm的铝粉进行抛光处理；
(2-3)放入HNO3:H2O体积比为1:1溶液，进行超声波清洗，超声清洗的时间为3～5min；
(2-4)放入乙醇溶液，进行超声波清洗，超声清洗的时间为3～5min；
(2-5)放入超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间为3～5min。
3.如权利要求1所述的适配体电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将含有探针S1和S2的缓冲溶液滴涂到表面处理干净的金电极上，培养6-10h,通过Au-S共价键作用自组装S1和S2修饰的金电极S2-S1/GE。
4.如权利要求1所述的适配体电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，将含有一定浓度的适配体的PBS缓冲溶液滴涂在S2-S1/GE电极上，培养30～40min后得到Aptasensor；彻底清洗后的修饰电极用氮气干燥，保存备用。
5.如权利要求1所述的适配体电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，将获得的Aptasensor在含有HP1和HP2的缓冲溶液中培养10h，通过DNA杂交连锁反应得到超夹心结构的修饰电极HP2-HP1-Aptasensor。
6.如权利要求1所述的适配体电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，在HP2的3’端是一段富胞嘧啶的序列，将HP2-HP1-Aptasensor培养在含有银离子和硼氢化钠的缓冲溶液中，得到银纳米簇修饰的电极AgNCs/HP2-HP1-Aptasensor。
7.一种适配体电化学生物传感器，其特征在于，采用如权利要求1-6所述适配体电化学生物传感器的制备方法制得。
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