CN100429512C - 一种毛细管电泳涂层柱 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种毛细管电泳柱，特别涉及一种采用新型聚合物涂层的毛细管电泳涂层柱，用对碱性蛋白质、有机碱性小分子、无机阳离子等的电泳分离。本发明的毛细管电泳涂层柱，是由树状支化大分子经过物理吸附和化学键合的方式制得毛细管电泳涂层柱，所述的树状支化大分子为超支化聚合物或树枝状大分子。本发明的有益效果是，具有涂层性能好，对碱性蛋白质、有机碱性小分子、无机阳离子等的分离效果好，有效抑制了对碱基及其衍生物的吸附。

Description

一种毛细管电泳涂层柱
(一)所属技术领域
本发明涉及一种毛细管电泳柱，特别涉及一种采用新型聚合物涂层的毛细管电泳涂层柱。
(二)背景技术
毛细管内表面由于Si-OH的电离，形成Si-O-，存在对碱性物质的吸附，吸附容易造成谱图拖尾，分离柱效下降，分离时间增长等缺陷。因此控制电渗流，降低吸附是提高碱性物质分离效果的一个非常有效的手段。利用电压减小的方法，可以降低电渗流，但是也降低了电泳的速度，碱性物质之间的淌度减小，增大了分离时间。利用极限pH值可以减缓吸附，控制电渗流，但是像碱性蛋白质、核苷等生物分子，在过高、过低pH值下均易发生水解，变性使分离失去意义。相比之下，毛细管涂层技术用于改变毛细管内壁的表面电荷是控制电渗流，减小吸附的有效途径。
传统的涂层材料多采用传统聚合物，而传统聚合物一般为线性聚合物，线性聚合物的粘度往往随着浓度的增加而增加，对毛细管进行涂敷时，涂敷浓度增大，会造成粘度急剧增加，很容易造成涂敷不均，甚至堵塞毛细管。而浓度太小的话，又很容易造成涂层太薄，不能完全将毛细管壁上的Si-OH覆盖；所以线性聚合物的涂敷浓度一般在5％左右，不能很好的覆盖硅羟基，抑制碱性物质的吸附。
树状支化大分子有着规整的树冠结构，空间结构呈现球形(如附录一)。很大程度上避免了传统聚合物的链与链之间交联，宏观上呈现出粘度较小，随着浓度的增加粘度变化很小的特点，比较适合涂敷毛细管；由于树状支化大分子树冠部分存在大量的官能团，比较容易跟毛细管壁的Si-OH结合，涂敷简单，涂层牢固。
(三)发明内容
为了克服以上技术的不足，本发明利用提供一种采用新型聚合物涂层的毛细管电泳涂层柱，克服了传统的涂层材料——线性聚合物涂敷浓度太低，涂层厚度不够，不能很好抑制硅羟基的电离的缺点。
本发明是通过以下措施来实现的：
本发明的毛细管电泳涂层柱，是由树状支化大分子经过物理吸附和化学键合的方式制得毛细管电泳涂层柱，所述的树状支化大分子为超支化聚合物或树枝状大分子。
本发明的毛细管电泳涂层柱，所述的超支化聚合物为超支化聚(胺-酯)或超支化聚酯。所述的物理吸附方式为直接将超支化聚(胺-酯)、超支化聚酯涂敷在毛细管内壁；所述的化学键合方式为利用硅烷化偶联剂γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷将合成的超支化聚(胺-酯)或超支化聚酯涂于毛细管内壁。
本发明的毛细管电泳涂层柱，所述的树枝状大分子为有机硅树枝状大分子。所述的物理吸附方式为直接将有机硅树枝状大分子涂敷到毛细管电泳柱内壁；所述的化学键合方式为利用硅烷化偶联剂γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(1KH-550)、双[γ-(三乙氧基硅基)丙基]胺(KH-402)将合成的硅氯键封端的有机硅树枝状大分子涂于毛细管内壁。或以乙烯基三乙氧基硅烷(Vinyl tirethoxysilane，A-151)为偶联剂将合成的以双键封端的有机硅树枝状大分子涂于毛细管内壁。
1.本发明的涂层柱的原理根据
树状支化大分子一个最突出的特点就是在同等的条件下，其比传统的聚合物的粘度低。因此如果将树状支化大分子作为毛细管柱涂层材料，就解决了传统聚合物高浓度必然伴随着高粘度的问题。由于其粘度较低，因而很容易的涂敷于毛细管柱内壁，形成稳定的薄层，而且更为重要的是，树状支化大分子分子外围有大量可供改性的活性端基，因而更易于键合于毛细管柱内表面，提高聚合物涂层的稳定性，这就为能够更好的抑制电渗流和减少对蛋白质、碱基等碱性物质的吸附，改善对碱性物质的分析分离效果提供了结构上的保障。
树状支化大分子同传统线性聚合物比较如表1。
表1
  内容   树状支化大分子   传统聚合物
  结构形式   立体状，无需外部交联，本身为立体状，较规则   线状或者平面状，加入交联剂后，有可能成为立体状，但极不规则
  高分子链   相对独立，不发生链缠绕，流动性好   链缠绕严重，没有规律
  高分子空腔   含大量空腔，空腔之间的空间规整，可人为控制支化臂的元素组成，长短大小等   几乎没有空腔，链缠绕形成的空腔无规律可循
  分子量和粘度   分子量大，但粘度低，流动性好，分子量可人为控制   分子量大，同时粘度增大，流动性变差，需要稀释至低浓度才可以流动，分子量控制困难
  活性基团位置与数目   活性基团位于最外层的树冠部位，与外界接触机会大，容易键合   活性基团位于分子链的旁侧，由于链缠绕等因素，被链埋藏，不容易与外界接触，不容易改性键合
  作为涂层材料发挥的作用   在毛细管内壁上，发挥立体式的作用，可以覆盖石英毛细管内壁的硅羟基，而且可以提供足够的空间位阻，阻碍碱性物质的吸附。   仅像一层薄膜覆盖在毛细管内壁上，无空腔结构发挥作用
树状支化大分子由于具有高度支化三维立体球状结构以及大量的表面官能团，因此显示出与线性分子截然不同的性质，如低粘度、无链缠绕和良好的溶解性。本发明的树状支化大分子涂层毛细管电泳柱在工业、农业、国防、医学、生命科学、环境保护等国民经济领域具有重要的应用前景，对人类社会的进步将产生一定的影响。
2.本发明的毛细管电泳涂层的制备：
2.1物理吸附毛细电泳涂层柱
2.1.1 Si-Cl封端有机硅树枝状大分子的物理吸附毛细管电泳涂层柱
将已经制得的各代以Si-Cl封端有机硅树枝状大分子分别溶于除水净化的二氯甲烷中，配置成15％的溶液，以1～2Mpa的氮气压将溶液压入毛细管柱内，在0.5MPa的氮气流下将涂渍液缓慢吹出，使涂渍液在毛细管内壁上形成一层均匀的液膜。
涂层柱的老化处理：将用有机硅树枝状大分子涂渍过的毛细管柱置于气相色谱炉内于1Mpa的氮气流下从50℃半小时程序升温至200℃，保持终点温度3h，冷却后用无水二氯甲烷冲洗掉未反应的树枝状大分子，然后无水甲醇冲洗柱子半小时，反应掉剩余的Si-Cl，即得物理吸附型涂层毛细管柱。反应方程式如下：
Figure C20061004455000061
2.1.2双键封端的有机硅树枝状大分子的物理吸附毛细管电泳涂层柱
将制得得各代以双键封端的有机硅树枝状大分子配置成20％得二氯甲烷溶液，以1～2Mpa的氮气压将溶液压入毛细管柱内，在0.5MPa的氮气流下将涂渍液缓慢吹出，使涂渍液在毛细管内壁上形成一层均匀的液膜即得双键封端的有机硅树枝状大分子的物理吸附毛细管电泳涂层柱
2.1.3超支化聚(胺-酯)的物理吸附毛细管电泳涂层柱
将超支化聚(胺-酯)配置成10％的甲醇溶液用于涂敷毛细管电泳柱，详细步骤同2.1.1
2.1.4超支化聚酯的物理吸附毛细管涂层柱
详细步骤同2.1.3
2.2化学键合毛细管电泳涂层柱
2.2.1-Si-Cl封端有机硅树枝状大分子的化学键合毛细管电泳柱涂层柱
毛细管柱的预处理：在一定的氮气压力下，先用氢氟酸侵蚀毛细管柱内壁约5min，接着用二次蒸馏水和甲醇顺序地清洗用氢氟酸预处理过的毛细管柱各10min，最后用氮气将毛细管柱吹干。
毛细管柱的硅烷化处理：将偶联剂KH-550压入经预处理过的毛细管柱内，并用氮气缓缓吹出剩余的涂渍液，然后将毛细管柱置于气相色谱炉内于一定的氮气流下从50℃半小时程序升温至150℃，保持终点温度3h进行老化处理，以使涂层固化。该反应为偶联剂γ-氨基丙基三乙氧基硅烷上的乙氧基与毛细管壁上的Si-OH反应，将活性端基胺基引入毛细管内壁上，具体反应方程式如下：
Figure C20061004455000071
有机硅树枝状大分子化学键合涂层柱的制备：将已经各代以Si-Cl封端有机硅树枝状大分子分别溶于除水净化的二氯甲烷中，配置成15％的溶液，以1～2 Mpa的氮气压将溶液压入毛细管柱内，在0.5MPa的氮气流下将涂渍液缓慢吹出，使涂渍液在毛细管内壁上形成一层均匀的液膜，然后将涂层毛细管柱置于气相色谱炉内于一定的氮气流下从50℃半小时程序升温至200℃，保持终点温度3h进行老化处理，以使有机硅有机硅树枝状大分子表面的端Si-Cl与硅烷化处理过毛细管壁上的-NH2反应，从而将有机硅有机硅树枝状大分子键合于毛细管内壁上。反应方程式如下：
Figure C20061004455000072
最后利用二氯甲烷冲洗掉未反应的树枝状大分子，用甲醇冲柱半小时来反应掉未键合的Si-Cl，用氮气吹干即得以KH-550为偶联剂的热交联化学键合涂层柱。
2.2.2双键封端的有机硅树枝状大分子的化学键合毛细管电泳涂层柱
毛细管预处理同2.2.1。
双键封端的有机硅树枝状大分子的化学键合毛细管电泳涂层柱的制备：将各代以双键封端的树枝状大分子、乙烯基三乙氧基硅烷和偶氮二异丁氰以质量比10∶20∶1的比例混合后，溶于二氯甲烷溶剂中，制得树枝状大分子含量为15％的混合溶液。将混合溶液在2MPa气压下，将混合溶液充入毛细管柱中，保持5分钟后用氮气吹干，从40℃开始半小时程序升温至120℃，使乙烯基三乙氧基硅烷与双键封端的树枝状大分子的聚合和键合同时进行。在终点保持温度1h，用二氯甲烷冲洗掉未反应的G3和乙烯基三乙氧基硅烷，用氮气吹干即得双键封端的有机硅树枝状大分子的化学键合涂层柱。
反应方程式如下：
Figure C20061004455000081
2.2.3超支化聚(胺-酯)的化学键合毛细管电泳涂层柱
毛细管预处理同2.2.1。
毛细管柱的硅烷化处理：将偶联剂γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷吸入经预处理过的毛细管柱内，并用氮气缓缓吹出剩余的涂渍液，然后将毛细管柱置于气相色谱炉内于一定的氮气流下从50℃至150℃程序升温，保持终点温度3h进行老化处理，以使涂层固化。该反应为偶联剂γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷上的甲氧基与毛细管壁上的硅羟基反应，将活性端基环氧基引入毛细管内壁上，具体反应方程式如下：
Figure C20061004455000091
超支化聚(胺-酯)化学键合涂层柱的制备：将合成的分别以三羟甲基丙烷和季戊四醇为核的超支化聚(胺-酯)的第五代、第六代、第七代产物吸入经硅烷化处理的毛细管柱内，在一定的氮气流下将剩余的涂渍液缓慢吹出，然后将化学键合涂层毛细管柱置于气相色谱炉内于一定的氮气流下从50℃至150℃程序升温，保持终点温度3h进行老化处理，以使超支化聚(胺-酯)的端羟基与毛细管壁上的环氧基反应，从而将超支化聚(胺-酯)键合于毛细管内壁上其具体反应如下：
Figure C20061004455000092
2.2.4超支化聚酯的化学键合毛细管电泳涂层柱
同2.2.3
3.本发明毛细管电泳涂层柱的性能测试
所制得的树状支化大分子毛细管电泳涂层柱，涂层性能良好，在pH＝5时，对碱性蛋白质的分离柱效普遍达到106，有效的抑制了硅羟基的电离对碱性蛋白质的吸附。适用碱性蛋白质等生物大分子的毛细管电泳分离所制得的有机硅树枝状大分子毛细管电泳涂层柱，涂层性能良好，在pH＝4.5时，对碱基及其衍生物的分离柱效普遍达到1.2×105，分离效果良好，有效的抑制了硅羟基的电离对碱基及其衍生物的吸附。适用于有机碱性小分子和无机阳离子的分离。
本发明的有益效果是，具有涂层性能好，对碱性蛋白质、有机碱性小分子、无机阳离子等的分离效果好，有效抑制了对碱基及其衍生物的吸附。
(四)附录说明
图1.为本发明的树状支化大分子聚合物的两种平面结构图
图2.为本发明的毛细管电泳涂层柱的分离谱图。
图中，a，g的电泳条件：pH＝5.0的磷酸盐缓冲溶液，分离电压15.8KV；内径75μm电泳柱，51cm×35.5cm；宾达1229毛细管电泳仪，UV-214检测；1.细胞色素C、2.溶菌酶、3.α胰凝乳蛋白酶原A。
h的电泳条件：pH＝5.0的磷酸盐缓冲溶液，分离电压16KV；内径75μ m电泳柱，55cm×50cm；宾达1229毛细管电泳仪，UV-214检测；1.细胞色素C、2.溶菌酶、3.α胰凝乳蛋白酶原A。
b，c，d，e，f的电泳条件：pH＝4.5的磷酸盐缓冲溶液，分离电压16KV；内径75μm电泳柱，55cm×50cm；宾达1229毛细管电泳仪，UV-254检测；1.腺嘌呤、2.腺苷和3.6-糠氨基嘌呤。
(五)具体实施方式
实例一
空白柱：pH＝5时对细胞色素C、溶菌酶、α胰凝乳蛋白酶原A三种碱性蛋白质的分离谱图如图2 a，无法分离；pH＝4.5时对腺嘌呤、腺苷和6-糠氨基嘌呤三种碱基及其衍生物如图2b，分离效果不好，柱效普遍为1.8×104，分离时间过长，近50分钟方能分离完全。
实例二
以四氯硅烷为中心起始核，以烯丙基溴化镁、甲基氢二氯硅烷为增长单体，反复进行Grignard反应和硅氢加成反应三次得3代以硅氯键封端的有机硅树枝状大分子。
3代以硅氯键封端的有机硅树枝状大分子物理吸附涂层柱：如2.1.1所述制得涂层毛细管电泳柱，测试其柱性能。得到谱图如图2c，分离柱效平均达到9×104，20分钟内即可将腺嘌呤、腺苷和6-糠氨基嘌呤三种碱基及其衍生物分离完全。
实例三
以四甲基四乙烯基环四硅氧烷为中心起始核，以甲基氢二氯硅烷，烯丙基溴化镁为增长单体，反复进行硅氢加成，Grignard反应3.5次得3.5代以硅氯键封端的有机硅树枝状大分子
3.5代以硅氯键封端的有机硅树枝状大分子化学键合涂层柱(KH-550为偶联剂)：如2.2.1所述制得涂层毛细管电泳柱，测试其柱性能。得到谱图如图2d，分离柱效平均达到12×104，18分钟内即可将三种物质分离完全。
实例四
如实例三制得3.5代以硅氯键封端的有机硅树枝状大分子。
3.5代以硅氯键封端的有机硅树枝状大分子化学键合涂层柱(KH-402为偶联剂)：如2.2.1所述以KH-402为偶联剂制得涂层毛细管电泳柱。反应方程如下：
得到谱图如图2e，分离柱效平均达到5×104，23分钟内即可将三种物质分离完全。
实例五
如实例三反复进行反应三次得3代以双键封端的有机硅树枝状大分子。
3代以双键封端的有机硅树枝状大分子化学键合涂层柱(A-151为偶联剂)：如2.2.2制得化学键合涂层柱，测定其柱性能得到谱图如图2f，分离柱效平均达到10×104，17分钟内即可将三种物质分离完全。
实例6
其中1为对甲苯磺酸。
一步法合成三羟甲基丙烷7代为核的超支化聚(胺-酯)：在95.5g N，N-二羟乙基-3-胺基丙酸甲酯单体中，加入505.9mg对甲苯磺酸和723.0mg三羟甲基丙烷，升温至回流温度保持不变，反应4小时，再抽真空除去反应中生成的甲醇和未反应的小分子化合物，即得超支化聚(胺-酯)第五代产物(G5)。改变单体的比例，在同样条件下聚合，分别得到超支化聚(胺-酯)第六代(G6)和第七代(G7)产物
以三羟甲基丙烷7代为核的超支化聚(胺-酯)的化学涂层毛细管电泳柱：同2.2.3制得化学涂层毛细管电泳柱。
将制得的毛细管电泳柱用于分离细胞色素C、溶菌酶、α胰凝乳蛋白酶原A三种碱性蛋白质，得到如图2 g的谱图，分离柱效达到73×104。分离效果良好，完全抑制了碱性蛋白质的吸附。
实例7
准一步法合成超支化聚酯：在四颈瓶中加入2.0g三羟甲基丙烷、30mg对甲苯磺酸和6.0g 2，2-二羟甲基丙酸，升温至140℃保持不变，反应2小时，在此温度下真空抽滤1小时即得超支化聚酯的第一代产物(G1)；在此反应体系内加入12.0g 2，2-二羟甲基丙酸和60mg对甲苯磺酸，在同样的反应条件下进行反应，即得超支化聚酯的第二代产物(G2)；依次按不同比例加入2，2-二羟甲基丙酸和对甲苯磺酸，在同样条件下进行反应，分别得到以三羟甲基丙烷为核的超支化聚酯的第三代产物(G3)、第四代产物(G4)、第五代产物(G5)和第六代产物(G6)。
准一步法合成的以三羟甲基丙烷5代为核的超支化聚酯的化学涂层毛细管电泳柱：按照2.1.4所示制得物理吸附涂层柱，用于分离细胞色素C、溶菌酶、α胰凝乳蛋白酶原A三种碱性蛋白质。测得其柱性能，得到如图2.h的谱图，分离柱效平均为3×104。

Claims (3)

1.一种毛细管电泳涂层柱，其特征在于：由树状支化大分子经过物理吸附或化学键合的方式粘合在电泳毛细管的内壁制成，所述的树状支化大分子为有机硅树枝状大分子。
2.根据权利要求1所述的毛细管电泳涂层柱，其特征在于：所述的化学键合方式的偶联剂为γ-氨基丙基三乙氧基硅烷或双[γ-(三乙氧基硅基)丙基]胺，所述的有机硅树枝状大分子为硅氯键封端的有机硅树枝状大分子。
3.根据权利要求1所述的毛细管电泳涂层柱，其特征在于：所述的化学键合方式的偶联剂为乙烯基三乙氧基硅烷，所述的有机硅树枝状大分子为双键封端的有机硅树枝状大分子。
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