KR20020059255A - 저온 저장을 개선하기 위한 ＰＥＧ-Ｈｂ를 사용하는 연속심장 관류 보존 - Google Patents

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KR20020059255A
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대니 엘.쥬니어 서나
제프리 씨. 밀리켄
랄프 이. 퍼디
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린다 에스. 스티븐슨
더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 발명의 제안된 용도는 기증자로부터 기관을 이식받을 수용자로 이식하는 동안 인간 및 동물 기증 기관 동종 이식편의 생체외 보존을 위함이다. 생체외 심근 보존에 대한 용도 이외에, PEG-Hb 용액은 개심술 동안 생체내 심근 보존에서 중대한 잠재적 유용성이 있을 뿐만 아니라, 개심술을 포함하여 여러 유형의 수술 동안 또는 이후의 혈액 대용물 또는 혈액 대치물로서 중대한 잠재적 유용성이 있다. 본 발명은 생체외 기증 기관 보존을 위한 폴리에틸렌 글리콜 코팅 소 헤모글리빈 기재 용액 및 그의 용도를 포함한다. 용액의 기본 원리는 기증 기관이 이식 후 허용가능한 기능을 회복하도록 생체외 저장될 기증 기관의 조직에 산소, 영양 및 전해질 환경을 제공하는 것이다. 용액은 등장성 정상칼륨혈의 저칼슘혈 용액으로 산소, 탄수화물 에너지원, 신진물질 연속 세척 및 연속 관류을 제공하며, 일반 치료에 관련된 현재 기법에서 심근 보존을 상당히 향상시킨다. 이식용 기증 기관 보존은 산소 운반 헤모글로빈 용액으로 저온 관류 보존을 이용하여 식염수 중의 허혈성 저온 침지 저장을 사용하여 수행된다. 용액은 PEG-Hb, 인간 알부민, 덱스트로스, 헤파린 용액, 리도카인 HCl, MgSO4, KCl, CaCl2, THAM, NaCl, NaHCO3, Na3PO4를 함유하며, 이와 같이 않을 경우 PEG-Hb는 심근에 치명적이며 효과적인 기관 저장을 위해 사용될 수 없다.

Description

저온 저장을 개선하기 위한 ＰＥＧ-Ｈｂ를 사용하는 연속 심장 관류 보존{Continuous Cardiac Perfusion Preservation with PEG-Hb for Improved Hypothermic Storage}
본 발명자들 (미국 국적의 Danny L. Serna Jr., Jeffrey C. Milliken 및 Ralph E. Purdy)은 알려진 바와 같이, 저온 저장을 개선하기 위해 PEG-Hb를 사용하여 연속 심장 관류 보존의 신규하고 유용한 방법 및 장치를 연구해 왔다 (이하, 본 명세서에 기재됨).
이식을 위한 기증자의 기관은 식염수 중의 허혈성 저온 침지 저장법을 사용하여 보존한다. 기증자의 심장 동종이식편에 대한 보존 시간은 상기 기술을 사용하면 최대 4 내지 6 시간으로 제한된다. 산소 운반 헤모글로빈 용액을 사용한 저온 관류 보존은 보존 시간이 연장되고, 이식가능한 기관의 허혈성 손상을 경감시킨다. 본 발명의 방법을 사용한 관류 보존은 복잡한 조직 형 분류에 충분한 시간을 제공하여, 기증자-수용자를 보다 양호하게 짝지을 수 있고, 보다 원거리에 있는 기증자의 기관을 이식할 수 있다.
PEG-Hb을 포함하는 본 발명과 관련된 선행기술로는 미국 특허 제5,312,808호 (Enzon, Inc)가 있다. 본 발명은 용액의 조성면에서 선행기술과 다르다. 본 발명은 수많은 성분들 중 하나로 PEG-Hb를 함유한다. 본 발명은 PEG-Hb 외에 인간 알부민, 덱스트로스, 헤파린 나트륨, 리도카인 HCl, MgSO4, KCl, CaCl2, THAM, NaCl, NaHCO3, Na3PO4를 함유하는데, 이들이 없으면 PEG-Hb는 심근에 치명적이고, 효과적인 기관 보존을 목적으로 사용될 수 없다.
과거에, 심장 동종이식편의 보존 문제는 식염수 중에서 심근수축정지 상태에 있는 동종이식편을 저온 침지 저장하여 해결하였다. 이 기술의 단점은 산소, 영양분 및 전해질이 기증자의 기관 동종이식편에 부족하게 전달되는 것이었다. PEG-Hb를 단독 사용하면 심근에 치명적이어서 효과적인 기관 보존 목적에 사용될 수 없다. PEG-Hb를 포함하는 전해질 및 영양 배합물이 개발되었으며, 이는 심근 보존을 표준 기술에 의해 달성되는 보존보다 더욱 개선 및 연장시키는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 기증자 기관의 생체외 보존을 목적으로 하는 물질의 조성물, 즉 폴리에틸렌 글리콜 코팅 소 헤모글로빈 기재 용액, 및 이의 용도를 포함한다. 이 용액의 목적은 이식 전에 생체외에서 기관을 제공하는 인간 및 동물의 기관을 보존하는 것이다. 이 용액의 기본 원리는 기증자의 기관이 이식후에 허용가능한 기능을 회복하도록 산소, 영양 및 전해질 환경을 생체외 보존에 사용되는 기증자 기관의 조직에 제공하는 것이다.
본 발명은 본 명세서내의 첨부자료 1 내지 4 (첨부자료 3에 수록된 내용이 본 발명을 가장 최근에 실시한 것임)에서 보다 상세하게 명시되어 있는 생성물, 조성물 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
본 발명의 이점은 산소, 탄수화물 에너지원, 연속 대사산물 세척, 및 등장성정상칼륨혈의 저칼슘혈 용액을 제공하여 심장근육 보존성을 표준 요법으로 간주되는 현행 기술보다 크게 향상시킴을 포함한다. 본 발명의 방법을 사용하여 토끼 심장을 8 시간 동안 저온 관류 보존시키면, 표준 요법으로 여겨지는 식염수 중의 저온 침지 저장을 4 시간 수행한 것에 비해 심근 보존 및 좌심실 기능이 개선된 것으로 나타났다.
PEG-Hb 기재 보존액 조성물의 예로는 3％ PEG-Hb, KCl (4.7 mEq/L), NaCl (148.7 mmol/L), NaPO4(2.5 mmol/L), NaHCO3(2.5 mmol/L), MgSO4(5.0 mEq/L), CaCl2(1.0 mEq/L), 리도카인 HCl (12.5 mg/L), 헤파린 나트륨 (1250 단위/L), 덱스트로스 (6.1 mOsm/L), 인간 알부민 (1.5 gm/L), 인간 인슐린 (30.6 단위/L), 트로메타민 (THAM) 용액 (7.3 cc/L)이 있다.
크리스탈로이드 보존 용액의 조성물로는 KCl (4.7 mEq/L), NaCl (150.7 mEq/L), MgSO4(5.0 mEq/L), CaCl2(1.0 mEq/L), 리도카인 HCl (12.5 mg/L), 헤파린 나트륨 (1250 단위/L), 덱스트로스 (6.1 mOsm/L), 인간 알부민 (1.5 gm/L), 인간 인슐린 (30.6 단위/L) 및 트로메타민 (THAM) 용액 (7.3 cc/L)이 있다.
생체외 심장 보존 동안, 본 발명의 pH는 37 ℃에서 측정될 때 7.1로, 20 ℃에서 측정될 때 7.4로 유지된다. pO2는 600 mmHg을 초과하게 유지된다. 뉴질랜드 백색 토끼을 사용하여 이러한 개시내용을 지지하는 데이터를 얻었다.
본 발명의 제안된 용도는 인간 및 동물 기증자로부터 이식을 원하는 수용자에게 이식하는 동안 기관 동종이식편을 생체외 보존하기 위함이다. PEG-Hb 용액을생체외 심근 보존에 사용하는 용도 외에, 이 용액은 개심술 동안의 생체내 심근 보존에서 뿐만 아니라, 및 개심술을 비롯한 임의의 수술 과정 또는 그 후의 혈액 대체물 또는 혈액 대치물로서 상당한 유용성을 갖는다.
세포내 수준을 반영하는 상기 용액의 칼륨 농도를 증가시킴으로써 개심술 동안 심근 보존 뿐만 아니라 심근수축정지 또는 저온 심장정지의 목적으로 매우 유용할 수 있을 것이다. 심정지를 수행 및 유지하고 개심술 동안의 심근 보존을 개선하기 위해 상기 용액을 투여할 수 있다.
본 발명의 PEG-Hb 용액의 배합물은 개심술을 비롯한 임의의 수술 및 외상에 기인한 혈액 손실 동안 또는 그 후의 혈관내 용적 대체, 혈액 대체 및 수혈 대체의 목적으로 매우 효과적일 것이다.
통상의 당업자라면 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않으면서 여러가지 변경 및 변형을 행할 수 있다. 따라서, 예시된 실시양태는 얘시를 목적으로 개시되었을 뿐이며, 이에 하기 청구의 범위에 의해 보다 넓어지거나 좁아질 수 있는 본 발명이 제한되는 것으로 간주해서는 안된다는 것을 이해해야 한다.
본 발명을 설명하기 위해 본 명세서에 사용된 용어 및 그의 다양한 실시양태는 일반 정의된 의미 뿐 아니라 일반 정의된 의미의 범위를 벗어나지만 본 명세서의 구조, 물질 또는 기능에서 특정된 것을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 따라서, 본 명세서의 문맥에서 한가지 이상의 의미를 포함하는 하나의 요소로 이해될 수 있다면, 하기 청구의 범위에 개시된 의미는 명세서 및 단어 자체에 의해 지지되는 모든 가능한 의미를 포괄하는 것으로 이해해야 한다.
따라서, 본 명세서에서 정의된, 하기 청구의 범위의 단어 또는 요소의 정의는 문자상 개시된 요소들의 조합 뿐만 아니라, 실질적으로 동일한 결과를 얻기위해 실질적으로 동일한 방식으로, 실질적으로 동일한 기능을 수행하기 위한 모든 등가 구조, 물질 또는 기능을 포함한다. 이러한 맥락에서, 둘 이상의 요소의 등가 치환물이 하기 정의된 청구의 범위의 요소 중 하나로 여겨지거나, 또는 단일 요소가 하기 정의되는 청구의 범위의 둘 이상의 요소로 치환될 수 있는 것으로 여겨진다.
현재 공지되어 있거나 추후 고안되는, 통상의 당업자가 보는 관점에서 특허청구되는 사안으로부터의 비현실적인 변화도 본 발명의 범위 내에서 등가인 것으로 여겨진다. 따라서, 당업자에게 현재 또는 추후에 공지되는 명백한 대체물은 정의된 요소의 범위 내에서 한정되어야 한다.
따라서, 본 발명은 구용량으로 설명되고 상술한 것, 개념상의 등가물인 것, 명백하게 치환될 수 있는 것 및 본 발명의 주요 아이디어를 본질적으로 통합하는 것을 포함하는 것으로 이해해야 한다.
첨부자료 1
PEG-헤모글로빈 및 크리스탈로이드 관류 용액 각각을 이용한 8 시간 저장 후 심장 기능 비교
이식술 동안 크리스탈로이드 관류에 의한 심근 보존 기간을 연장시키려는 노력은 부종 및 기능 저하로 인해 한계가 있었다. 본 발명자들은 산소 운반 헤모글로빈 용액을 사용한 저온 관류 보존으로 보존 시간을 연장할 수 있을 것이라 가정했다. 이러한 연구의 목적은 PEG-헤모글로빈 (Hb) 및 생리학적 크리스탈로이드 관류액 각각으로 연속 관류시킨 후 심장 기능을 비교하는 것이었다. 마취시키고 인공호흡시킨 NZW 토끼 9 마리를 냉간 심근수축정지시킨 후, 심장을 수거했다. I 군 (n = 4)의 심장을 PEG-Hb (엔존 인크. (Enzon Inc.), 미국 뉴저지주 소재)로 20 ℃ 및 30 mmHg에서 8 시간 동안 연속 관류시켰다. II 군 (n=5)의 심장은 크리스탈로이드 관류액으로 20℃에서 8시간 동안 연속 관류시켰다. 표준 크리스탈로이드 랑겐도르프 (Langendorff) 회로에 옮겨 0, 1 및 2시간 후에 좌심실 풍선으로 심장 기능을 측정했다.
시험 기간 동안 심박수는 I 군과 II 군에서 동일했다 (89.6 vs. 91.1, p=0.57). 0.6 cc 좌심실 (LV) 용량에서 발생 좌심실압(developed left ventricular pressure) (수축압과 이완압의 차이)에 있어서, I 군 (76.17 ±19.2 mmHg)이 II 군 (52.0 ±25.21, p=0.021)보다 컸다. 0.6 cc 좌심실 (LV) 용량에서 최대 +dP/dT에 있어, I 군 (854.47 ±381.8 mmHg/sec)이 II 군 (485.10 ±284.14 mmHg/sec, p=0.025)보다 더 컸다. 전체 심실 중량의 물 백분률은 I 군의 경우 82.0％이었고 II 군의 경우 81.6％이었다. 토끼 심장을 PEG-Hb로 30 mmHg 및 20 ℃에서 8 시간동안 연속 관류 보존하여 8시간 동안 크리스탈로이드 관류하였을 때와 비교하였을 때, 심근 부종은 유사했지만 좌심실 기능은 우수하였다. PEG-Hb을사용한 심장 관류 보존 기간의 연장은 이식에 유용하다는 것을 입증할 수 있다.
연구자 [DL Serna, LL Powell, WC Wallace, J West, C Kahwaji, G Cogert, P Smulowitz, E Steward, R Purdy, JC Milliken. UC Irvine]
신규 PEG-헤모글로빈 용액을 이용한 24시간 심장 관류 보존
연구자 [Dan L. Serna, Ledford L. Powell, Peter Smulowitz, Gerry Beckham, Chadi Kahwaji, Blanding U Jones, Peter Connolly, Vini Shrivastata, Yannelly Perez, Adam Farber, Justin West, Earl Steward, Ralph Purdy, Jeffrey C. Milliken]
이식술 동안의 심장 보존은 4 내지 6시간의 허혈성 저온 저장에 의해 제한 된다. 신규 산소 운반 헤모글로빈 용액을 사용한 저온 관류 보존은 보존 시간을 연장시키고 허혈성 손상을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 목적은 PEG-헤모글로빈 (Hb)을 이용한 24시간 저온 연속 관류 후와 저온 허혈성 보존의 임상 표준과의 심장 기능을 비교하는 것이었다.
방법: 마취시켜 삽관한 NZW 토끼 25 마리를 냉간 심근수축정지시킨 후, 심장을 수거했다. I 군 (n = 7)의 심장은 PEG-Hb 용액으로 20 ℃ 및 30 mmHg에서 24 시간 동안 연속 관류시켰다. II 군 (n=10)의 심장은 4℃에서 4시간 동안 저온 허혈성 저장 보관하고, III 군 (n=8)은 수거 직후에 시험하였다. LV 기능을 표준 크리스탈로이드 랑겐도르프 회로로 옮긴 직후 및 2시간 후에 비작동 상태로 측정하였다.
결과: 0.5 cc 좌심실 (LV) 용량에서 발생 좌심실압에 있어 I 군 (54.2 ±2.6mmHg)과 II 군 (49.1 ±5.4 mmHg, p=0.5)은 비슷하였지만 III 군 (69.4 ±5.1 mmHg, p=0.02)은 더 컸다. 0.5 cc 좌심실 (LV) 용량에서 최대 -dp/dT는 I 군 (-398.1 ±19.0 mmHg/sec), II 군 (-354.8 ±49.1 mmHg/sec, p=0.2) 및 III 군 (-456.2 ±44.1 mmHg/sec, p=0.7)이 비슷하였다. 0.5 cc 좌심실 (LV) 용량에서 최대 +dp/dT는 또한 I 군 (660.3 ±49.5 mmHg/sec), II 군 (428.4 ±54.9 mmHg/sec, p=0.3) 및 III 군 (514.6 ±48.9 mmHg/sec, p=0.6)이 비슷하였다.
결론: 토끼 심장을 신규 PEG-Hb 용액으로 30 mmHg 및 20 ℃에서 8 시간 동안 관류 보존시켰을 때, 좌심실 기능은 4시간 저온 허혈성 저온 저장시 및 신선한 대조군과 비슷하였다. 상기 PEG-Hb 용액을 사용한 심장 보존 기간의 연장은 많은 동물 이식 모델에서 더 조사해볼 가치가 있다.
첨부자료 2
심근수축정지시킨 토끼 심장을 신규 PEG-Hb 용액을 사용하여 관류 보존하면, 기증 토끼의 심장 동종이식편의 기능 회복이 가능함
연구자[Blanding U. Jones, MD, Dan L. Serna, MD, Gerry Beckham, BS, Peter Smulowitz, BS, Adam Farber, BS, Chad Kahwaji, BS, Earl Steward, BS, Ralph E. Purdy, Ph.D., and Jeffrey C. Milliken, MD]
서론:심장 동종이식편의 저온 저장 보존에 대한 임상적 표준 방법은 동종이식편에 허혈성 손상을 초래하고, 동종이식편의 보존 기간을 4 내지 6 시간으로 제한한다. 신규한 산소 운반 PEG-헤모글로빈 (Hb) 용액을 사용한 연속 저온 관류 보존은 임상적 표준 방법을 수행할 때보다 심장의 허혈성 상해를 감소시키고, 심장기능의 보존에 더 좋으며, 이러한 보존 기간을 연장시킬 수 있다. 본 연구의 목적은 신규 PEG-Hb 용액을 사용하였을 때, 8 시간 동안의 연속 저온 관류 이후의 심장 기능과 4 시간 동안의 저온 허혈성 저장 보존 이후의 심장 기능을 비교하는 것이다.
방법:마취시켜 삽관한 NZW 토끼 28 마리를 냉간 심근수축정지시킨 후, 심장을 수거했다. I 군 (n = 10)의 심장에는 20 ℃ 및 30 mmHg에서 신규 PEG-Hb 용액을 대동맥근을 통해 연속 관류했다. 보존 기간 동안의 PO2는 500 mmHg보다 높게 유지되었다. II 군 (n=10)의 심장은 4 ℃에서 4 시간 동안 저온 허혈성 저장법으로 보존했다. III 군 (n=8)의 심장은 수거 직후 시험했다. 비작동 상태의 좌심실 기능을 37 ℃에서 측정하고, 15 분 후에 표준 크리스탈로이드 랑겐도르프 회로로 이동시켰다.
결과:0.5cc 좌심실 (LV) 용량에서의 발생 LV 압력을 측정한 결과, I 군에서의 압력 (75.7 ±10.3 mmHg)은 II 군에서의 압력 (49.1 ±5.4 mmHg) 보다 높았으며 (p=0.04), III 군에서의 압력 (69.4 ±5.1 mmHg)과는 유사했다 (p=0.6). 0.5cc 좌심실 (LV) 용량에서의 최대 -dp/dT 값은 I 군 (-610.6 ±68.4 mmHg/sec)이 II 군 (-354.8 ±49.1 mmHg/sec)보다 높았으며 (p=0.O1), III 군 (-456.2 ±44.1 mmHg/sec) 보다 우수한 경향이 있었다 (p=0.09). O.5 cc 좌심실 (LV) 용량에서의 최대 + dp/dT 값은 I 군 (964.9 ±156.6 mmHg/sec)이 II 군 (428.4 ±54.9 mmHg/sec, p=0.004) 및 II 군 (514.6 ±48.9 mmHg/sec, p=0.02) 모두 보다 더 높았다.
결론:30 mmHg 및 20 ℃에서 토끼의 심장을 8 시간 동안 이 PEG-Hb로 연속 관류 보존시켰을 때의 좌심실 기능은 4 시간 허혈성 저온 저장한 경우보다 우수하다. 또한, 이 PEG-Hb 용액을 사용한 관류 보존 후 회복된 심장 기능은 심정지 직후의 심장 기능보다 우수할 수 있다. 이러한 데이터는 심근수축정지된 심장을 허혈성 손상 후에 이 PEG-Hb 용액을 사용하여 관류 보존하는 동안, 심장의 심근 기능이 어느 정도 회복될 수 있음을 암시한다. 또한, 이 PEG-헤모글로빈 용액을 사용한 관류 보존은 제공된 박동 정지 심장의 재생에 있어서 저온 허혈성 저장보다 유용할 수 있다. 이 PEG-Hb 용액을 사용한 연속 관류 보존은 대형 동물 이식 모델에서 더 조사해 볼 가치가 있다.
첨부자료 3
8 시간 동안의 심장 보관 용액이 PEG-헤모글로빈일 경우 및 크리스탈로이드 관류 용액일 경우의 심장 기능 비교
(Dan L. Serna, MD, Ledford L. Powell, MD, Chadi Kahwaji, BS, William C. Wallace, MD, Justin West, BA, Greg Cogert, BS, Peter Smulowitz, BS, Earl Steward, MD, Ralph E. Purdy, Ph.D., Jeffrey C. Milliken, MD, 미국 캘리포니아주 오렌지 소재의 UC 이르빈 메디칼 센타 내 약리학과 및 흉부외과 교실)
학회 집필자:
Jeffrey C. Milliken, MD
미국 92868 캘리포니아주 오렌지
101 더 시티 드라이브 빌딩 53, 117호
UC 이르빈 메디칼 센타
흉부외과 교실 (Division of Cardiothoracic Surgery)
사무실 전화번호: (714) 456-3634
팩스번호: (714) 456-8870
이메일: jcmillik@uci.edu
난외(欄外) 표제: PEG-헤모글로빈 용액을 사용한 생체외 심장 보존
미국 인공 장기 협회 (American Society for Artificial Internal Organs)가 1999년 6월 2일 - 6월 5일에 개최한 제45회 정기 학회에서 발표됨.
<초록>
서론:크리스탈로이드 관류에 의한 이식술 동안의 심근 보존 기간을 연장시키려는 노력은 부종 및 기능 저하로 인해 한계가 있었다. 본 발명자들은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 회합 헤모글로빈 용액을 사용한 저온 관류 보존으로 보존 시간을 연장할 수 있을 것이라 가정했다. 본 연구의 목적은 PEG-헤모글로빈 (Hb)을 첨가한 저칼슘혈의 정상칼륨혈 크리스탈로이드 관류액 및 이를 첨가하지 않은 저칼슘 정상칼륨혈의 크리스탈로이드 관류액을 사용한 연속 관류 후, 두 경우의 심장 기능을 비교하는 것이다.
방법:마취 및 인공호흡시킨 NZW 토끼 20 마리를 냉간 심근수축정지시킨 후, 심장을 수거했다. I 군 (n = 10)의 심장은 20 ℃ 및 30 mmHg에서 저칼슘혈의 정상칼륨혈 3％ 소 PEG-Hb 용액을 사용하여 8 시간 동안 연속 관류시켰다. II 군 (n=10)의 심장은 I 군의 심장과 같은 조건 하에서 PEG-Hb가 없는 동일한 크리스탈로이드 용액을 사용하여 8 시간 동안 연속 관류시켰다. 37 ℃ 및 대동맥근압 59 mmHg에서 표준 크리스탈로이드 랑겐도르프 회로로 이동시킨 후, 좌심실력 변환기를 사용하여 심장 기능을 측정했다.
결과:8 시간 동안의 관류 보존 후, 심장 박동은 I 군과 II 군에서 유사했다 (p=NS). 보존 이후 및 보존 동안의 관상 혈류는 PEG-Hb 용액에서 보존된 심장과 PEG-Hb가 없는 크리스탈로이드 용액에서 보존된 심장에서 유사했다 (p=NS). 발생 좌심실압, 피크 dP/dt 및 피크 -dP/dt는 PEG-Hb와 함께 보존된 심장의 경우에서 더 우수했다. 심실 총 중량 중 물의 백분률은 I 군의 경우에는 82.0％였고, II 군의 경우에는 81.6％였다 (p=NS).
결론:30 mmHg 및 20 ℃에서 토끼의 심장을 8 시간 동안 연속 관류시켰을 때, 심근 부종 및 관상 혈류는 저칼슘 정상칼륨혈의 PEG-Hb 기재 용액을 사용한 경우와 PEG-Hb이 없는 유사한 크리스탈로이드 용액을 사용한 경우가 유사했지만, 좌심실 기능은 저칼슘 정상칼륨혈의 PEG-Hb 기재 용액을 사용한 경우가 더 우수했다. 이 PEG-Hb 기재 용액을 사용하여 심장 관류 보존 기간을 연장시키는 것은 통상의 심장 보존 용액을 사용하는 경우와 비교하는 등, 더욱 연구해 볼 가치가 있다.
<서론>
임상 이식을 위한 기증자의 현재 심장 보존법은 냉간 심근수축정지 및 동결 온도에서의 저장을 포함한다. 계속되는 허혈 때문에, 이 보존 기술로는 기증자 기관의 연장된 저장, 개선된 조직 형 분류 방법의 이용, 및 기증자 심장의 장거리 전달을 달성할 수 없다. 또한, 현재 보존 기술은 비가역적인 이식 손상을 초래할 수 있다. 연속적인 관상 동맥 관류에 의한 보존은 저온 허혈성 보존보다 더 긴 보존 시간을 허용한다 (1). 연속 관상 동맥 관류는 기질의 연속적인 공급 뿐만 아니라 대사 노폐물의 제거를 허용한다. 일반적인 3가지 유형의 용액을 심장 보존제로서의 그들의 효능에 대해 조사한 바 있다. 크리스탈로이드 심근수축정지 용액으로의 관류는 제한된 장래성을 보인다 (2-6). 이들 용액을 이용한 관류 보존은 부종 및 손상된 심장 기능에 의해 제한된다 (2-6). 유사하게, 기증자의 심장을 위한 관류 보존 매질인 과불화탄소 에멀젼을 조사한 연구는 각양 각색의 결과를 보인 바 있다 (1, 7-10). 또한, 과불화화합물은 비싸고 전신 사용될 때 의심스러운 안정성 프로필을 갖는다 (7-9).
헤모글로빈-기재의 혈액 대용물은 외상 및 수술에 있어서 혈액 대신에 사용하기 위해 최근에 더욱 더 개발되고 있다. 기관 보존액으로서의 이들 용액의 용도는 허혈을 감소시키는 동시에 생체외 심장 보존의 시간대를 늘릴 수 있다. 본 발명자들은 폴리에틸렌 글리콜 회합 헤모글로빈 (PEG-Hb) 기재의 저칼슘혈의 정상칼륨혈 용액으로 8시간에 걸쳐 저온 관류 보존하면 PEG-Hb가 없는 화학적으로 동일한 크리스탈로이드 용액으로 얻은 상기 좌심실 기능을 보존할 수 있을 것이라고 가정하였다. 본 발명자들은 이 PEG-Hb 용액이 그의 보존 기간동안 기증자의 심장을 최적화할 수 있을 것으로 생각한다.
본 연구의 목적은 저칼슘혈의 정상칼륨혈 PEG-Hb 용액, 및 PEG-Hb를 함유하지 않는 동일한 저칼슘혈의 정상칼륨혈 크리스탈로이드 용액 각각을 이용한 연속 관상 동맥 관류 후 성숙 토끼 심장의 생체외 보존을 상기 두 용액에 대해 비교하는 것이다. 이 연구는 종래의 심근수축정지 용액 뿐만 아니라 심근 보존의 특정한 강화제가 함유된 PEG-Hb 용액을 이용한 저온 허혈성 저장 보존과 PEG-Hb 기재의 용액으로의 관류 보존을 비교하는 미래 연구를 위한 기초가 될 것이다.
<방법>
모든 동물은 국립보건원에 의해 간행된 문헌 ("Guide for the Care and Use of Laboratory Animals"; NIH publication 86-23)에 따른 인간의 보호를 받았다. 캘리포니아 대학(Irvine)의 연구 동물 보호 및 사용 위원회는 동물 실험 절차를 승인하였다
실험 계획
마취되고 인공호흡시킨 20 마리의 NZW 토끼의 심장을 냉간 심근수축정지 후 적출하였다. 군 I (n = 10)의 심장을 20℃ 및 30 mmHg의 대동맥근압 하에 8시간 동안 정상칼륨혈의 저칼슘혈 소 PEG-Hb 기재 용액으로 연속 관류하였다. 군 II (n = 10)의 심장을 군 I의 용액과 조성면에서는 동일하지만 PEG-Hb가 첨가되지 않은 크리스탈로이드 용액으로 동일하게 보존하였다.
<심장 조달>
kg당 50 mg의 케타민 및 5 mg의 크실라진의 근육내 주사를 이용하여 20 마리의 성숙한 수컷 뉴질랜드 백색 토끼 (3 내지 3.5 kg)를 마취하였다. IV 카테터를 통해 락테이트 링거 용액을 5 내지 15 cc/시간의 속도로 연변귀정맥에 관주하였다. 서보 (Servo) 동물 인공호흡기 (모델 #900C, Siemens Elema, Sweden)를 이용하여 상기 토끼를 기계적으로 인공호흡시켰다. 1 : 1 비율의 정맥내 케타민/크실라진으로 마취를 유지하였다. 정중흉골절개술 후 세로축 심낭 절개를 수행하여 심장 및 종격혈관을 노출시켰다. 모든 토끼에게 1,000 U의 헤파린 나트륨/kg IV을 투여하였다. 무명동맥, 상완두동맥간과 좌경동맥 사이의 대동맥궁, 및 하대정맥과 상대정맥을 확인하고 단리하였다. 하대정맥 및 상대정맥의 결합시, 18 Ga 혈관카테터를 이용하여 무명동맥에 캐뉼라를 형성하였다. 무명동맥을 통해 60 cc의 저온 심근수축정지 용액 (2-4℃)을 3분에 걸쳐 관상동맥에 투여하였다. 폐동맥의 동맥절개술을 수행하여 우심실을 감압하였다. 보통의 저온 생리수 (2-4℃)를 사용하여 심근수축정지 관주 동안 심장을 냉각시켰다. 심장을 신속히 절제하고 추가 해부를 위해 저온 생리수 (4℃)에 두었다. 폐, 기도 및 흉선을 비롯한 과량의 연조직을 심장으로부터 제거하였다. 오름대동맥에 캐뉼라를 형성하여 모든 심장을 보존 회로 상에 배치하였다. 심장절개술을 수행한지 5분내에 관상 관류를 시작하였다. 모든 심장을 연속 관상 동맥 관류에 의해 8시간 동안 보존하였다. 대동맥근압을 30 mmHg로 유지하였다. 관류액의 온도를 20℃로 유지하였다. 모든 심장을 관류하고 전체 8시간의 보존 기간 동안 각 보존 용액에 담구었다. 보존 회로에 심장을전달한지 15분 후 막형 산소 공급기를 이용하여 95％ 02/5％ CO2를 투여하기 시작하였다. p02를 600 mmHg로 또는 그보다 높은 수준으로 유지하였다. 보존 회로는 원심분리 펌프 (Medtronic Bio-Medicus pumphead, Model #9154R, Medtronic Blood Systems, Inc., Anaheim, CA) 및 바이오콘솔 (Medtronic Bio-Medicus Inc., Eden Prairie, MN), 성인 산소 공급기 (Sarns/3M Health Care, Inc., Ann Arbor, MI), C-플렉스 통합 중합체 튜빙 (Fischer, Largo, FL), 40 ㎛의 혈액 필터 (Pall Biomedical, Inc, Fajardo, PR), 및 2개의 유리 저장기로 구성되었다. 관류액의 온도는 가열기/냉각기 (Fisher Scientific Inc., Pittsburgh, PA)로 유지하고 막형 산소 공급기를 통해 순환하였다 (도 1).
보존 용액
PEG-Hb 기재 보존 용액의 조성물은 하기와 같다. 3％ 소 PEG-Hb, KCl(4.7 mEq/L), NaCl(148.7 mmol/L), NaH2PO4(2.5 mmol/L), NaHC03(2.5 mmol/L), MgS04(5.0 mEq/L), CaCl2(1.0 mEq/L), 리도카인 HCl(12.5 mg/L), 헤파린 나트륨(1250 단위/L), 덱스트로스(6.1 mOsm/L), 인간 알부민(1.5 gm/L), 인간 인슐린(30.6 단위/L) 및 트로메타민(THAM) 용액(7.3 cc/L). 3％ PEG-Hb 용액의 삼투몰농도는 324 mOsm/kg이다.
크리스탈로이드 보존 용액의 조성물은 하기와 같다. KCl(4.7 mEq/L), NaCl(150.7 mEq/L), MgSO4(5.0 mEq/L), CaCl2(1.0 mEq/L), 리도카인 HCl(12.5mg/L), 헤파린 나트륨(1250 단위/L), 덱스트로스(6.1 mOsm/L), 인간 알부민(1.5 gm/L), 인간 인슐린(30.6 단위/L) 및 트로메타민(THAM) 용액(7.3 cc/L). 크리스탈로이드 보존 용액의 삼투몰농도는 324 mOsm/kg이다.
보존 이후의 심장 기능의 평가
보존 8시간 이후 기간의 끝에서, 모든 심장은 단리된 심장 관류 기구로 데이터 수집을 위해 옮겼다. 대동맥근을 통한 관상 관류를 37℃ 및 59 mmHg의 대동맥근압에서 즉시 시작하였다. 95％ O2/5％ CO2투여는 심장을 이 회로로 옮긴지 15분 후, 막형 산소 공급기를 사용하여 시작하였다. p02를 600 mmHg보다 높거나 동일하게 유지하였다. 이 위치에서 관상 관류 15분 후에, 관상류, 심박수, 발생 좌심실압 (LVP), 피크 dP/dt및 피크-dP/dt를 측정하였다. 관상류와 심박수를 2시간 동안 15분 마다 측정하였다. LVP, 피크 dP/dt및 피크-dP/dt를 제 2 회로로 옮긴지 75분과 135분 후에 다시 측정하였다. 심박수를 1분 동안 좌심실 수축 횟수를 집계하여 측정하였다. 관상류를 1분 동안 폐동맥으로부터 나오는 방출물을 수거하여 측정하였다. LVP, 피크 dP/dt및 피크-dP/dt를 연속적인 관상 동맥 관류 동안 박동하고 작동하지 않는 위치에서 측정하였다. 좌심실압 (수축압과 이완압의 차이), 및 좌심실압 확장(dP/dt max)과 이완(-dP/dt max)의 피크 속도를 좌심실력 변환기(Biopac Systems, Inc., Santa Barbara, CA)를 사용하여 측정하였다. LV력 변환기로부터의 데이터를 아날로그-투-디지탈 전환기(Biopac Systems, Inc., Santa Barbara, CA)를 사용하여 디지탈화하고, 인식 소프트웨어(Acknowledge software,Version 3.2.6, Biopac Systems, Inc., Santa Barbara, CA)와 데스크탑 컴퓨터(Nexstar, Fremont, CA)를 사용하여 분석하였다. 시험 회로는 원심분리 펌프(Medtronic Bio-Medicus pumphead, Model #9154R, Medtronic Blood Systems, Inc., Anaheim, CA)와 바이오-콘솔(Bio-Console, Medtronic Bio-Medicus Inc., Eden Prairie, MN), 성인 막형 산소 공급기(Sarns/3M Health Care, Inc., Ann Arbor, MI), C-Flex 통합 중합체 튜빙(Fisher, Largo, FL), 40 ㎛ 혈액 필터(Pall Biomedical, Inc, Fajardo, PR) 및 2개의 유리 저장기로 구성되었다. 관류액의 온도는 가열기/냉각기(Fisher Scientific Inc., Pittsburgh, PA)로 유지하고 막형 산소 공급기를 통해 순환하였다.
시험 용액: 좌심실 기능을 표준 생리학적 크리스탈로이드 용액을 사용하여 두 군의 모든 심장에서 평가하였다. 조성물은 하기와 같다. KCl(4.7 mEq/L), NaCl(151.5 mEq/L), MgSO4(5.0 mEq/L), CaCl2(2.0 mEq/L), 리도카인 HCl(12.5 mg/L), 헤파린 나트륨(1250 단위/L), 덱스트로스(6.1 mOsm/L), 인간 인슐린(30.7 단위/L) 및 트로메타민(THAM) 용액(6.1 cc/L)
심실 물 함량의 측정: 시험 회로에서 역행성 대동맥 관류 135분 후, 각각의 군에서 초기 5개의 심장의 심근을 심방과 다른 연질 조직에서 절개하였다. 좌심실 심근을 110℃에서 건조 이전과 이후에 칭량하였다.
데이터 분석
데이터는 평균 ±SE로 기록한다. 통계적 분석을 시스탈 7.0.1 소프터웨어팩키지(Systal 7.0.1 software package, SPSS, Inc., Chicago, IL)를 사용하여 수행하였다. 스튜던츠 t-테스트(Student's t-test)를 군들 사이의 유의성에 대해 시험하기 위해 사용하였다. 0.05 미만의 p 값은 유의하다고 고려하였다.
물질
6％ PEG-Hb, 5 mM NaH2PO4, 5 mM NaHC03및 150 mM NaCl을 함유한 용액 중의 소 PEG-Hb를 엔존사(Enzon, Inc., Piscataway, NJ)로부터 수득하였다. 폴리에틸렌 글리콜 회합 소 Hb (PEG-Hb)을 인접한 소 집단으로부터 수득한 소 적혈구로부터 헤모글로빈을 단리하여 제조하였다. 재료를 정제하고 각각의 Hb 분자를 약 12 숙시니미딜 카르보네이트 폴리에틸렌 글리콜 스트랜드 (5000 달톤)로 개질하여, 전체 헤모글로빈의 5％ 미만의 메테모글로빈(methemoglobin), 0.5 EU/mL 미만의 엔도톡신이 있고 37℃에서 점도가 3.1 cP인 6％(g/dL) Hb 용액을 수득하였다. 보통의 생리 식염수 (0.9％ NaCl)를 박스터 헬스 케어사(Baxter Health Care, Irvine, CA)로부터 획득하였다. 용액을 혈액 가스 분석기(288 Blood Gas System, Ciba-Corning Diagnostics Corp., Medfield, MA), 자동화 응고 타이머(Medtronic Hemotec, Inc., Englewood, CO) 및 혈액 글루코스 미터(Lifescan, Inc., Milpitas, CA)를 사용하여 모니터하였다. 막형 산소 공급기를 사른스/3M 헬스 케어사(Ann Arbor, MI)로부터 수득하였다.
결과
발생 좌심실압: 0.5 cc LV 용량에서 발생 좌심실압은 보존 종료 후15분(p=0.46)에서 PEG Hb와 크리스탈로이드 보존 심장 사이에 유사하였다(도 2). 그러나, 0.5 cc LV 용량에서 발생 좌심실압은 보존 종료 후 75분(p=0.006) 및 135분(p=0.002)에서 크리스탈로이드 보존 심장과 비교하여 PEG-Hb 보존 심장에서 우세하였다.
좌심실 수축의 최대 속도: 0.5 cc LV 용량에서 피크 dP/dt max는 보존 종료 후 15 분(p=0.10)에서 크리스탈로이드 보존 심장과 비교하여 PEG-Hb 용액을 사용하여 보존되는 심장들이 우세하였다(도 3). 그러나, 0.5 cc LV 용량에서 피크 dP/dt max는 크리스탈로이드 보존 심장과 비교하여 PEG-Hb 보존 심장에서 보존 종료 후 75분(p=0.01) 및 135분(p=0.001)에서 우세하였다.
좌심실 이완의 최대 속도: 0.5 cc LV 용량에서 피크-dP/dt max는 PEG Hb 및 크리스탈로이드 보존 심장 사이에 보존 종료 후 15분(p=0.27)에서 유사하고, 보존 종료 후 75분(p=0.07)에서 우세하였다(도4). 0.5 cc LV 용량에서 피크 -dP/dt max는 크리스탈로이드 보존 심장과 비교하여 PEG-Hb 보존 심장에서 보존 종료 후 135분(p=0.006)에서 우세하였다.
심실 물 함량: 전체 심실 중량 중 물 백분률은 I 군에 대해 82.0％이고, II 군에 대하여 81.6％이었다(p=NS).
관상류: 보존 이후의 관상류는 PEG-Hb 및 크리스탈로이드 보존 심장 사이에서 유사하였다.
심박수: 심박수는 시험 기간 동안 I과 II군에 대해 동일하였다(p=NS, 표 1).
<결론>
이식을 위한 생체외 심장 보존을 위한 두가지 일반적인 기술이 있다. 주목받고 있으며 통상적으로 사용되는 표준 기술은 기증자 심장의 동종이식편의 저온 허혈성 침지 저장법이다. 심장 보존의 제2 방법은 관상 관류 보존법이다. 이들 두 방법은 병용할 수 있으며, 그렇게 하여 개선된 결과를 얻었다. 관류 보존법은 대사 노폐물을 지속적으로 세척하여 제거할 수 있을 뿐 아니라 영양분, 대사성 기질 및 산소를 심근으로 전달할 수 있기 때문에 침지 보존법에 비해 우수하다(1). 여러가지 이유로 인해, 관류 보존법은 이식을 위한 생체외 심장 보존에 임상적으로 적용되지 않아 왔다. 첫째, 사용자 친화적이고 실용적이며 휴대가능한 관류 보존 장치는 현재로서는 이용할 수 없다. 둘째, 관류 보존에 대한 최근까지의 연구의 대부분은 크리스탈로이드 심근수축정지 용액 및 과불소화탄소를 사용하여 수행되었다. 크리스탈로이드 심근수축정지 용액에는 유감스럽게도 매우 적은 산소가 포함되어 있기 때문에, 이 용액을 사용하면 기증자 기관에 상당한 허혈성 손상이 있게 된다(2-6). 과불소화탄소 기재 용액은 심장 보존을 위해 혼합된 결과를 설명하며, 매우 고가이다(1,7-10).
기질 무함유 헤모글로빈 기재 용액을 사용하는 관류 보존은 생체외 심장 보존에 대한 혁신적인 방법이다. 기질 무함유 헤모글로빈은 초기에는 외상에 따른 생명을 위협하는 출혈의 치료에 사용되는 혈액 대용물로서 개발되었다. 이식을 연구하는 과학자들에게 기관 보존 용액으로서의 이러한 용액의 가능성은 강한 관심의 대상이 된다. 본 연구의 목적은 정상칼륨혈의 저칼슘혈 폴리에틸렌 글리콜 코팅소 헤모글로빈 기재 용액을 사용하여 관류 보존의 유용성을 평가하기 위한 것이다.
본 연구에서 PEG-Hb 보존된 심장의 우수한 기관 보존 결과는 아마도 PEG-Hb의 종양성 효과와 산소 운반 효과 둘다의 조합된 결과일 수 있다. PEG-Hb의 산소 운반 효과를 뒷받침하는 데이터는 달리는 래트 모델에서 교환 수혈을 이용하여 얻을 수 있다(11). 교환 수혈받은 래트는 PEG-Hb, PEG-mHb(50％-메테모글로빈), PEG-탄소 모노옥사이드 헤모글로빈(PEG-COHb), 또는 PEG-인간 혈청 알부민(PEG-HSA)의 적혈구용적율이 85％까지 감소되었다. 수혈 24시간 후의 생존율은 PEG-Hb 군에서는 79％, PEG-mHb 군에서는 30％이었고, PEG-COHb 및 PEG-HSA 군 둘다에 대하여는 0％이었다. 네(4) 용액의 혈장 확장 특성이 유사하기는 하지만, 산소 운반능이 최대인 용액은 생존율이 최대이었다.
그램 당 기준으로, PEG-Hb의 산소 운반능은 개질되지 않은 사량체 소 Hb에서 나타나는 운반능과 동일하다. Hb의 PEG화는 폴리에틸렌 글리콜을 기질 무함유 Hb 사량체에 부착하는 것이 포함된다. PEG화는 Hb의 총 산소 운반능을 변화시키는 것으로 보이지는 않지만, PEG화는 산소 운반 특성을 바꾸는 것으로 보인다(12). 예를 들어, 더 큰 입자 크기로 인해, PEG-Hb는 개질되지 않은 Hb보다 더 오랫동안 혈관 공간 내에 남아 있다(13). 또한, PEG화는 소 헤모글로빈의 산소 친화성을 바꾼다. 소 PEG-Hb의 P50은 37 ℃에서 15 torr이다(14). 분명히, 이는 비교적 낮은 P50이다. 이러한 높은 산소 친화성으로 인해 PEG-Hb가 보통온도 조건 및 저온 조건하에 산소를 효과적으로 운반하는 능력에 대한 의문점이 해소된다. 래트 모델을 사용하여 소 PEG-Hb가 기질 무함유 소 Hb(P50-26 torr) 또는 가교 소 Hb(P50-48 torr) 보다 조직에 산소를 더 잘 공급함을 보여주었으며, 이들 둘다는 PEG-Hb 보다 산소에 대한 친화성이 더 낮았으며, 따라서 이론적으로는 조직에 대한 더 좋은 산소공급자이다(14). 또한, 본 발명자들은 소 Hb가 그의 산소 친화도를 낮추기 위해 2,3-디포스포글리세레이트를 필요로 하기 보다는 단지 PEG-Hb 보존 용액 중에 존재하는 염소 이온만을 필요로 한다는 점에서 인간 Hb와는 다르다는 사실을 알아내었다. 마지막으로, 보어(Bohr) 효과는 인간 Hb보다는 소 Hb에서 더 잘 나타나며, 이는 이론적으로는 낮은 pH 및 온도에서 산소를 더 잘 운반할 수 있게 만든다.
PEG-Hb의 종양성 압력은 Hb 표면의 아미노산기에 PEG가 결합함으로써 크게 증대된다. 본 연구에서 사용되는 3 gm/dL 용액은 약 39 mmHg의 콜로이드 삼투압을 갖는다(17). 대조적으로, 비슷한 농도의 인간 혈청 알부민 및 정제된 인간 헤모글로빈 A0는 각각 9 mmHg 및 9 mmHg의 콜로이드 삼투압을 갖는다(17). 본 연구의 두 보존 용액에 사용된 인간 혈청 알부민의 양은 0.15 gm/dL이며, 약 1 mmHg의 종양성 압력을 갖는다(17). 개질되지 않고 분자내 가교된 인간 사량체의 계산된 평균 분자량은 소 PEG-Hb의 117,000에 비해 65,300 ±3,500이다. 브레트슈나이더(Bretschneider's) HTK 심근수축정지 용액에 가하게 되면, PEG에 의해 좌심실 기능의 회복이 증대될 뿐 아니라 심근 부종이 더 줄어들며(18), PEG 용액의 종양성이 중요한 역할을 하게될 가능성이 있다. PEG 작용 메카니즘은 지질 과산화의 억제를 포함할 수도 있다(18).
허혈 및 재관류 동안 칼슘의 세포내 축적이 세포의 손상과 관련이 있을 수 있고(19-23) 저산소 스트레스를 받은 심장은 저칼슘혈성 용액에 의해 보호될 수 있기 때문에(19), 보존 용액을 저칼슘혈성으로 만들었다. 박동하는 심장은 부종에 대해 덜 민감할 수 있기 때문에, 심장 박동을 유지하기 위해 이 용액은 정상칼슘혈이었다. 마지막으로, 마그네슘이 막을 통한 칼슘의 운반을 억제함으로 인해 칼슘의 세포내 축적이 방지되므로, 이는 칼슘의 유해한 효과를 방지하는 것을 보조하므로(24-27), 보존 용액은 약간 과마그네슘혈성이었다. 마그네슘은 성숙한 돼지 심장보다 칼슘의 유해한 효과에 대해 더 민감한 새끼 돼지 허혈 심장에서 칼슘의 유해한 효과를 감소시키는 것으로 알려져 있다(28).
심장 보존 기간을 연장시키는 것은 큰 가치가 있다. 첫째, 기증자 기관의 허혈이 적은 것은 이식후 이식편의 기능 및 수용자의 생존율을 향상시킬 수 있을 것이다. 둘째, 심장 보존 기간을 연장시키는 것은 기대되는 HLA 매치뿐만 아니라 더 잘 매치된 수용자에 대해 더 긴 거리의 심장 운반을 가능케할 것이다.
PEG-Hb를 사용하여 토끼 심장을 30 mmHg 및 20 ℃에서 8시간 동안 지속적으로 관류 보존한 결과, 유사한 심근 부종이 나타났음에도 불구하고, PEG-Hb를 가하지 않은 화학적으로 유사한 크리스탈로이드 용액을 사용하여 8시간 동안 관류한 것보다 우수한 좌심실 기능이 나타났다. 본 연구는 PEG-헤모글로빈에 의한 산소 운반의 유무하에 관류 후의 심근 기능을 설명하며, 대조군은 실제로 다른 심근 보존 기구를 나타내지 않는다. 마찬가지로, 이러한 PEG-Hb 용액을 사용한 보존 메카니즘은 증대된 산소 전달을 포함할 수도, 포함하지 않을 수도 있다. 이러한 PEG-Hb기재 용액을 사용한 심장 관류 보존의 연장은 통상의 심근수축정지 보존 용액에 대한 비교를 포함하여 추가로 연구할만하다. PEG-Hb는 향후의 임상적 보존 용액의 유용한 성분이 될 수 있을 것이다.
참고문헌
<범례>
도 1. 단리된 심장 관류 보존 회로.
도 2. 보존 후 15분, 75분 및 135분에서의 발생 좌심실압. 스튜던츠 t-시험을 이용하여 군 사이의 유의성을 시험하였다. 0.05 미만의 p 수치는 유의한 것으로 간주하였음(*).
도 3. 보존 후 15분, 75분 및 135분에서의 LV 수축의 최대 속도. 스튜던츠 t-시험을 이용하여 군 사이의 유의성을 시험하였다. 0.05 미만의 p 수치는 유의한 것으로 간주하였음(*).
도 4. 보존 후 15분, 75분 및 135분에서의 LV 이완의 최대 속도. 스튜던츠t-시험을 이용하여 군 사이의 유의성을 시험하였다. 0.05 미만의 p 수치는 유의한 것으로 간주하였음(*).
관류 보존 8시간 후의 심박수
심박수
시간 (분) PEG-Hb 크리스탈로이드 p 수치
15 117±8.4 100.8±8.4 0.19
30 104.9±7.9 98.4±4.9 0.48
45 98.8±6.6 95.2±4.6 0.66
60 94.1±6.6 97.6±5.7 0.70
75 90.9±6.8 96.2±5.5 0.55
90 99.2±6.6 97.0±3.5 0.77
105 97.8±6.3 89.1±4.8 0.30
120 95.0±6.4 75.8±11.5 0.14
135 100.5±6.3 73.9±13.7 0.07
첨부자료 4
PEG-헤모글로빈을 이용한 8시간의 관류 보존 후의 심장 기능
서론: 이식을 위하여 크리스탈로이드 관류에 의한 심근 보존을 연장시키는 노력은 부종 및 기능 저하에 의해 제한받아 왔다. 본 발명자들은 산소 운반 헤모글로빈 용액에 의한 저온 관류 보존으로 보존 시간을 연장시킬 수 있다고 가정하였다.
전임상 연구 1:
이 연구의 목적은 PEG-헤모글로빈(Hb)에 의한 연속적 관류 후와 크리스탈로이드 생리 관류액에 의한 연속적 관류 후와의 심장 기능을 비교하는 것이었다.
방법: 마취시키고 인공호흡시킨 NZW 토끼 9 마리의 심장을 냉간 심근수축정지후 적출하였다. I 군 (n=4) 심장을 PEG-Hb (Enzon Inc., N.J.)로 20℃ 및 30 ㎜Hg에서 8시간 동안 연속적으로 관류시켰다. II 군 (n=5) 심장을 크리스탈로이드 관류액으로 20℃ 및 30 ㎜Hg에서 8시간 동안 연속적으로 관류시켰다. 상기 두 용액 모두에 KCl (4 m㏖/L), Na+(145 m㏖/L), MgSO4(5.1 m㏖/L), CaCl2(0.4 m㏖/L), 12.5 ㎎/L 리도카인, 헤파린 (1250 단위/L), 덱스트로스 (1.25 gm/L), 인간 알부민 (1.6 gm/L), 인간 인슐린 (3.1 단위/L)을 가하였다. 500 ㎜Hg 이상으로 pO2를 유지시키고, pH는 7.1 (37℃)로 유지시켰다. 표준 크리스탈로이드 랑겐도르프 회로로 이동시킨 후 0, 1 및 2시간에서 좌심실 풍선으로 심장 기능을 측정하였다.
결과: 시험 기간 동안 I 군과 II 군의 심박수는 동일하였다 (89.6 대 91.1, p=0.57). 0.6 cc LV 용량에서의 발생 좌심실압 (수축압 - 이완압)은 II 군 (52.0±25.21 ㎜Hg, p=0.021) 보다 I 군 (76.17±19.2 ㎜Hg)이 더 컸다. 0.6 cc LV 용량에서의 최대 +dP/dT는 II 군 (485.10±284.14 mmHg/sec, p=0.025) 보다 I 군 (854.47±381.8 mmHg/sec)이 더 컸다. 총 심실 중량의 물 백분률은 I 군 82.0％, II 군 81.6％였다.
결론: 30 ㎜Hg 및 20℃에서 8시간 동안 연속적 관류에 의해 PEG-Hb로 토끼 심장을 보존한 결과, 8시간 동안 크리스탈로이드 관류에 의한 보존과 비교시 심근 부종은 유사하였으나 좌심실 기능은 더 우세하였다. PEG-Hb에 의한 연장된 심장 관류 보존은 이식술에 유용하다고 입증될 수 있다.
전임상 연구 2:
방법: 마취시키고 삽관처치한 NZW 토끼 14 마리의 심장을 냉간 심근수축정지후 적출하였다. I 군 (n=4) 심장을 PEG-Hb (Enzon Inc., N.J.)로 20℃ 및 30 ㎜Hg에서 8시간 동안 관류시켰다. II 군 (n=5) 심장을 관류 없이 4시간 동안 4℃에서 보존하고, III 군 (n=5)은 적출시 즉시 시험하였다. PEG-Hb 용액에 KCl (4 m㏖/L), Na+(145 m㏖/L), MgSO4(5.1 m㏖/L), CaCl2(0.4 m㏖/L), 12.5 ㎎/L 리도카인, 헤파린 (1250 단위/L), 덱스트로스 (1.25 gm/L), 인간 알부민 (1.6 gm/L), 인간 인슐린 (3.1 단위/L)을 가하였다. 500 ㎜Hg 이상으로 PO2를 유지시키고, pH는 7.1 (37℃)로 유지시켰다. 표준 크리스탈로이드 랑겐도르프 회로로 이동시킨 후 2시에 비작업 상태에서 심장 기능을 측정하였다.
결과: 0.5 cc LV 용량에서의 발생 좌심실압은 I 군 (57.94±4.69 ㎜Hg)과 III 군 (61.45±14.45 ㎜Hg, p=0.71)이 유사하였으나, II 군 (39.72±6.98 ㎜Hg, p=0.32)에 비교하여 우세하였다. 0.5 cc LV 용량에서의 최대 -dp/dT는 I 군 (-376.58±33.78 mmHg/sec), II 군 (426.32±139.15 mmHg/sec, p=0.77) 및 III 군 (-326.73±47.75 mmHg/sec, p=0.23)이 모두 유사하였다. 총 심실 중량의 물 백분률은 I 군 82.0％, II 군 82.3％ 및 III 군 81.5％였다.
결론: 30 ㎜Hg 및 20℃에서 8시간 동안 연속적 관류에 의해 PEG-Hb로 토끼 심장을 보존한 결과, 4시간의 저온 저장보다 우세할 수 있는, 비허혈성 대조군 심장과 유사한 좌심실 기능을 얻었다. PEG-Hb에 의한 연장된 심장 관류 보존은 이식술에 유용하다고 입증될 수 있다.
PEG-Hb에 의한 연속적 심장 관류 보존은 표준 허혈 저온 저장보다 심장 기능을 개선시킴
연구자 [Dan L. Serna, Ledford L. Powell, Chadi I. Kahwaji, William C. Wallace, Peter Smulowitz, Justin West, Peter Connolly, Gerry Beckham, Earl Steward, Ralph Purdy, Jeffrey C. Milliken]
이식을 위한 심장 보존은 일반적으로 4 내지 6시간 동안의 허혈성 저온 저장으로 제한되어 있다. 산소 운반 헤모글로빈 용액에 의한 저온 관류 보존은 보존 시간을 연장시키고 허혈성 손상을 감소시킬 수 있다. 이 연구의 목적은 PEG-헤모글로빈(Hb) 용액에 의한 8시간 동안의 연속적 저온 관류한 후와 저온 허혈 보존의 임상 표준과 비교하는 것이었다.
방법: 마취시키고 삽관처치한 NZW 토끼 28 마리의 심장을 냉간 심근수축정지후 적출하였다. I 군 (n=10) 심장을 PEG-Hb (Enzon Inc., Piscataway, NJ) 용액으로 20℃ 및 30 ㎜Hg에서 8시간 동안 관류시켰다. II 군 (n=10) 심장을 4시간 동안 4℃에서 냉간 허혈 저장에 의해 보존하고, III 군 (n=8)은 적출시 즉시 시험하였다. 표준 크리스탈로이드 랑겐도르프 회로로 이동시킨 후 15분에 비작업 상태에서 LV 기능을 측정하였다.
결과: 0.5 cc LV 용량에서의 발생 좌심실압은 I 군 (75.7±10.3 ㎜Hg)이 II 군 (49.1±5.4 ㎜Hg, p=0.04)보다 컸으나, III 군 (69.41±5.1 ㎜Hg, p=0.6)과 유사하였다. 0.5 cc LV 용량에서의 최대 -dp/dT는 I 군 (-610.6±68.4 mmHg/sec)이 II 군 (-354.8±49.1 mmHg/sec, p=0.01)보다 컸으며, III 군 (-456.2±44.1 mmHg/sec, p=0.09)보다 우세하였다. 0.5 cc LV 용량에서의 최대 +dp/dT는 I 군 (964.9±156.6 mmHg/sec)이 II 군 (428.4±54.9 mmHg/sec, p=0.004) 및 III 군 (514.6±48.9 mmHg/sec, p=0.02)보다 컸다.
결론: 30 ㎜Hg 및 20℃에서 8시간 동안 연속적 관류에 의해 PEG-Hb 용액으로 토끼 심장을 보존한 결과, 4시간의 허혈 저온 저장보다는 우세하고 새로운 대조군 심장과는 유사한 좌심실 기능을 얻었다. PEG-Hb에 의한 연장된 심장 관류 보존은 큰 동물 이식 모델에서 더 연구될 가치가 있다.
PEG-헤모글로빈 대 크리스탈로이드 관류액을 이용한 8시간의 저장 후의 심장기능
이식을 위하여 크리스탈로이드 관류에 의한 심근 보존을 연장시키는 노력은 부종 및 기능 저하에 의해 제한받아 왔다. 본 발명자들은 산소 운반 헤모글로빈 용액에 의한 저온 관류 보존으로 보존 시간을 연장시킬 수 있다고 가정하였다. 이 연구의 목적은 PEG-헤모글로빈(Hb)에 의한 연속적 관류 후와 크리스탈로이드 생리 관류액에 의한 연속적 관류 후와의 심장 기능을 비교하는 것이었다. 마취시키고 인공호흡시킨 NZW 토끼 9 마리의 심장을 냉간 심근수축정지후 적출하였다. I 군 (n=4) 심장을 PEG-Hb (Enzon Inc., N.J.)로 20℃ 및 30 ㎜Hg에서 8시간 동안 연속적으로 관류시켰다. II 군 (n=5) 심장을 크리스탈로이드 관류액으로 20℃ 및 30 ㎜Hg에서 8시간 동안 연속적으로 관류시켰다. 표준 크리스탈로이드 랑겐도르프 회로로 이동시킨 후 0, 1 및 2시에 좌심실 풍선으로 심장 기능을 측정하였다. 시험 기간 동안 I 군과 II 군의 심박수는 동일하였다 (89.6 대 91.1, p=0.57). 0.6 cc LV 용량에서의 좌심실압 (수축압 - 이완압)은 II 군 (52.0±25.21 ㎜Hg, p=0.021) 보다 I 군 (76.17±19.2 ㎜Hg)이 더 컸다. 0.6 cc LV 용량에서의 최대 +dP/dT는 II 군 (485.10±284.14 mmHg/sec, p=0.025) 보다 I 군 (854.47±381.8 mmHg/sec)이 더 컸다. 총 심실 중량의 물 백분률은 I 군 82.0％, II 군 81.6％였다.
30 ㎜Hg 및 20℃에서 8시간 동안 연속적 관류에 의해 PEG-Hb로 토끼 심장을보존한 결과, 8시간 동안 크리스탈로이드 관류에 의한 보존과 비교시 심근 부종은 유사하였으나 좌심실 기능은 더 우세하였다. PEG-Hb에 의한 연장된 심장 관류 보존은 이식술에 유용하다고 입증될 수 있다.
DL Serna. LL Powell, WC Wallace, J West, C Kahwaji, G Cogert Smulowitz, E Steward, R Purdy, JC Milliken, UC Irvine.
PEG-헤모글로빈 대 크리스탈로이드 관류를 이용한 8 시간 저장 후 심장 기능
미국 캘리포니아주 오렌지 소재 UC 이르빈 메디칼 센터, 디엘 세르나(DL Serna), 알이 퍼디(RE Purdy), 제이시 밀리켄(JC Milliken)
학회 집필자:
단 엘 세르나(Dan L. Serna), MD
미국 92868 캘리포니아주 오렌지
101 더 시티 드라이브 빌딩 53, 117호
UC 이르빈 메디칼 센타
흉부외과 교실
사무실 전화번호: (714) 456-3634
팩스번호: (714) 456-8870
e-메일: dlserna@uci.edu
미국 인공 장기 협회가 1999년 6월 2일-6월 5일에 개최한 제45회 정기 학회에서 발표됨.
<초록>
서론: 크리스탈로이드 관류에 의한 이식술 동안의 심근 보존 기간을 연장하려는 노력은 부종 및 기능 저하로 인해 한계가 있었다. 본 연구자들은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 회합 헤모글로빈 용액을 사용한 저온 관류 보존으로 보존 시간을 연장할 수 있을 것이라고 가정하였다. 본 연구의 목적은 PEG-헤모글로빈(Hb)을 첨가한 저칼슘혈의 정상칼륨혈 크리스탈로이드 관류액 및 이를 첨가하지 않은 저칼슘혈증성 정상칼륨혈의 크리스탈로이드 관류액을 사용하여 연속 관류시킨 후, 심장 기능을 비교하는 것이다.
방법: 마취 및 인공호흡시킨 NZW 토끼 20 마리를 저온에서 심근수축정지시킨 후, 심장을 수거하였다. I 군 (n=10)의 심장은 20 ℃ 및 30 mmHg에서 저칼슘혈의 정상칼륨혈 3％ PEG-Hb 용액으로 8 시간 동안 연속하여 관류시켰다. II 군 (n=10)의 심장은 I 군의 심장과 동일한 조건하에 PEG-Hb이 없는 화학적으로 동일한 크리스탈로이드 용액으로 8 시간 동안 연속해서 관류시켰다. 37 ℃ 및 59 mmHg의 대동맥근압에서 표준 크리스탈로이드 랑겐도르프 회로로 이동시킨 후, 좌심실력 변환기를 사용하여 심장 기능을 측정하였다.
결과: 8 시간 동안 관류 보존시킨 후, 심장 박동은 I 군과 II 군 (p=NS)에서 유사하였다. 보존 이후 및 보존 동안의 관상 혈류는 PEG-Hb 용액에서 보존된 심장과 PEG-Hb가 없는 크리스탈로이드 보존된 심장(p=NS)에서 유사하였다. 발생 좌심실압, 피크 dP/dt 및 피크 -dP/dt는 PEG-Hb 용액에서 보존된 심장에서 더 컸다. 심실 총 중량 중 물의 백분률은 I 군에서 82.0％이고, II 군에서 81.6％였다 (p=NS).
결론: 30 mmHg 및 20 ℃에서 토끼의 심장을 8 시간 동안 저칼슘혈의 정상칼륨혈 PEG-Hb 기재 용액으로 연속하여 관류 보존시켰을 때, 심근 부종 및 관상 혈류는 PEG-Hb이 없는 크리스탈로이드 용액을 사용한 경우와 유사하였지만, 좌심실 기능은 PEG-Hb이 없는 크리스탈로이드 용액을 사용한 경우의 관류보다 우수하였다. 이 PEG-Hb 기재 용액을 사용하여 심장 관류 보존 기간을 연장시키는 것은 더 연구해 볼 가치가 있다.
<서론>
미국에서만 3 백만명 이상의 심부전 환자가 있다 (1). 이 환자들 중 약 1/3은 종종 계속적인 악화 및 잦은 병원 입원을 특징으로 하는 뉴욕 심장 협회 기능 분류 III 또는 IV의 심부전을 갖고 있다. 심부전으로 인한 연간 지출액은 380억불 정도로 추정되며, 이중 230억불이 입원중 및 이식전 비수술 처치에 해당한다 (1). 최근 들어, 기증자의 지리적 범위외에 있는 수용자와 기증자의 기관을 짝짓는 분배를 허용하는 연방 법률이 통과되었다. 그러나, 기존의 보존 기술 및 기증자의 기관 분배는 여전히 그대로 남아 있다. 기증자의 심장 조달, 보존 및 분배에 관한 혁신적인 기술을 발달시키고자 하는 인도주의적 요구 및 경제적 요구가 있다.
최근의 기증자 심장 보존 방법은 저온에서의 심근수축정지 및 동결 온도 부근에서의 저장을 포함한다. 허혈의 진행으로 인하여, 이러한 보존 기술은 기증자의 기관의 저장 연장, 조직 형태의 보다 진보된 방법 사용 및 원거리의 기증자의 심장의 운송을 방해한다. 또한, 최근의 보존 기술은 돌이킬 수 없는 이식편 손상을 일으킨다. 연속 관상 동맥 관류에 의한 보존은 저온 허혈 보존보다 몇 배 이상의 보존을 가능케 한다 (2). 연속 관상 동맥 관류는 기질의 계속적인 공급및 대사 노폐물의 제거를 가능케 한다. 3종의 일반적인 용액이 심장 보존제로서 그 효능이 조사되었다. 크리스탈로이드, 심근수축정지 용액을 사용한 관류는 앞으로의 전망이 제한적이다 (3-7). 이 용액들을 사용한 관류 보존은 부종 및 저하된 심장 기능으로 인해 제한되었다 (3-7). 유사하게, 기증자의 심장용 관류 보존 매질로서 퍼플루오로카본 에멀젼을 시험하는 연구들은 혼합된 결과를 제공하였다 (2, 8-11). 또한, 퍼플루오로화학제는 매우 고가이며 안정 프로필이 의문시된다 (8-10).
본 연구에 이르러 헤모글로빈 기재 혈액 대용물이 외상 및 수술시 혈액 대체물로서의 용도로 개발되었다. 기관 보존 용액으로서 이들 용액을 사용하는 것은 허혈의 감소에 부수적으로 생체외 심장 보존의 기간을 연장시킬 수 있다. 본 연구자들은 저칼슘혈의 정상칼륨혈 폴리에틸렌 글리콜 회합 헤모글로빈(PEG-Hb) 기재 용액을 사용하여 8 시간 동안 저온 관류 보존시킬 때, PEG-Hb가 없는 화학적으로 동일한 크리스탈로이드 용액을 사용한 경우의 상기 좌심실 기능을 유지한다고 가정하였다. 본 연구자들은 이 PEG-Hb 용액이 그의 보존 기간 동안 기증자의 심장을 최적화시킬 수 있다고 생각한다. 게다가, 이 용액을 사용한 관류 보존의 최적화는 생체외 심장 보존의 기간을 상당히 연장시킬 수 있고, 원거리의 기증자의 기관의 수송을 가능케 하며, 보다 철저한 조직 형 분류와 매칭을 가능케 하며, 삽입후 이식편의 기능 및 생존률을 개선시킬 수 있다.
본 연구의 목적은 PEG-Hb를 함유하지 않는 동일한 크리스탈로이드 용액에 대한 저칼슘형의 정상칼륨혈 PEG-Hb 용액을 사용한 연속적인 관상 동맥 관류후 생체외 성숙한 토끼의 심장 보존을 비교하는 것이다. 이 작업은 저온 허혈 저장 보존에 대한 PEG-Hb 기재 용액 뿐만 아니라 심근 보존의 특정한 증진제를 함유하는 PEG-Hb 용액을 사용한 관류 보존을 비교하는 향후 조사를 위한 기초가 될 것이다.
<방법>
모든 동물은 문헌(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, the National Institutes of Health 발행, NIH 출판 86-23)에 따라 사람의 보살핌을 받았다. 캘리포니아 대학(Irvine)의 동물 보호 및 사용 위원회은 동물의 실험 절차를 승인하였다.
실험 계획
20마리의 마취되어 인공호흡시킨 NZW 토끼의 심장을 냉간 심근수축정지후 수집하였다. 군 I(n=10)의 심장을 20℃ 및 30 mmHg의 대동맥근압에서 8시간 동안 연속적으로 정상칼륨혈의 저칼슘혈 PEG-Hb 기재 용액으로 관류시켰다. 군 II(n=10)의 심장을 군 I의 심장과 조성이 동일하나 PEG-Hb를 첨가하지 않은 크리스탈로이드 용액으로 동일하게 보존하였다.
심장 조달
20마리의 성숙한 수컷 뉴질랜드 백색 토끼(3 내지 3.5 kg)를 킬로그램 당 50 mg 케타민 및 5 mg 크실라진의 근육내 주사를 이용하여 마취시켰다. 락테이트 링거 용액을 5 내지 15 cc/hr의 속도로 연변 귀 정맥에서 IV 카테터를 통해 주입하였다. 토끼를 서보 동물 인공호흡기 (모델 번호 900C, Siemens-Elema, Sweden)를 사용하여 기계적으로 인공호흡시켰다. 마취를 1:1 비율의 정맥내 케타민/크실라진으로 유지하였다. 정중흉골절개에 이어서 세로축 심낭 절개를 수행하고 심장 및 종격 혈관을 노출시켰다. 모든 토끼에게 1,000 U 헤파린 나트륨/kg IV를 투여하였다. 무명 동맥, 상완두동맥간과 좌경동맥 사이의 대동맥궁 뿐만 아니라 하대 정맥 및 상대 정맥을 확인하고 단리하였다. 하대 정맥 및 상대 정맥의 결찰시, 18 Ga 혈관 카테터를 사용하여 무명 동맥을 캐뉼라를 형성하였다. 저온 심근수축정지 용액(2 내지 4℃) 60 cc를 3분에 걸쳐 무명 동맥을 통해 관상 동맥에 투여하였다. 폐동맥 줄기에서 동맥절개를 하여 우심실을 감압시켰다. 일반 저온 식염수(2 내지 4℃)를 사용하여 심근수축정지 주입시 심장을 냉각시켰다. 심장을 신속히 절제하고, 추가 절개를 위해 저온 식염수(4℃)에 두었다. 심장에서 폐, 기도 및 흉선을 비롯하여 과량의 연조직을 잘라내었다. 모든 심장을 오름대동맥에서 캐뉼라를 형성하여 보존 회로상으로 위치시켰다. 심장절제를 한지 5분 이내에 관상 관류를 시작하였다. 모든 심장을 연속적인 관상 동맥 관류에 의해 8시간 동안 보존하였다. 대동맥근압을 30 mmHg로 유지하였다. 관류액의 온도를 20℃에서 유지하였다. 모든 심장을 관류시키고 각각의 보존 용액중에 전체 8시간 보존 시간동안 침지시켰다. 심장을 보존 회로에 전달한지 15분 후에 막형 산소 공급기를 사용하여 95％ O2/5％ CO2투여를 시작하였다. pO2를 600 mmHg보다 크거나 동일한 수준으로 유지하였다. 보존 회로는 원심분리 펌프(Medtronic Bio-Medicus pumphead, Model #9154R, Medtronic Blood Systems, Inc., Anaheim, CA) 및 바이오-콘솔(Bio-Console, Medtronic Bio-Medicus Inc., Eden Prairie, MN), 성인 막형 산소공급기(Sarns/3M Health Care, Inc., Ann Arbor, MI), C-Flex 통합 중합체 튜빙(C-Flex Consolidated Polymer tubing, Fisher, Largo, FL), 40 ㎛ 혈액 필터(Pall Biomedical, Inc, Fajardo, PR) 및 2개의 유리 저장기로 구성되었다. 관류액의 온도는 가열기/냉각기(Fisher Scientific Inc., Pittsburgh, PA)에 의해 유지하고 막형 산소 공급기를 통해 순환된다(도 1).
보존 용액
PEG-Hb 기재 보존 유체의 조성은 하기와 같다: 3％ PEG-Hb, KCl(4.7 mEq/L), NaCl(148.7 mmol/L), NaPO4(2.5 mmol/L), NaHCO3(2.5 mmol/L), MgSO4(5.0 mEq/L), CaCl2(1.0 mEq/L), 리도카인 HCl(12.5 mg/L), 헵파린 나트륨(1250 단위/L), 덱스트로스(6.1 mOsm/L), 인간 알부민(1.5 gm/L), 인간 인슐린(30.6 단위/L), 트로메타민(THAM) 용액(7.3 cc/L).
크리스탈로이드 보존 용액의 조성은 하기와 같다: KCl(4.7 mEq/L), NaCl(150.7 mEq/L), MgSO4(5.0 mEq/L), CaCl2(1.0 mEq/L), 리도카인 HCl(12.5 mg/L), 헵파린 나트륨(1250 단위/L), 덱스트로스(6.1 mOsm/L), 인간 알부민(1.5 gm/L), 인간 인슐린(30.6 단위/L) 및 트로메타민(THAM) 용액(7.3 cc/L).
보존 이후의 심장 기능 평가
8시간의 보존 시간의 끝에서, 모든 심장을 데이터 수집의 목적을 위해 단리된 심장 관류 기구에 전달시켰다. 대동맥근을 통한 관상 관류를 37℃ 및 59 mmHg 대동맥근압에서 즉시 시작하였다. 심장을 이 회로에 전달한 지 15분후에 막형 산소 공급기를 사용하여 95％ O2/5％ CO2투여를 시작하였다. pO2를 600 mmHg보다 크거나 동일한 수준에서 유지하였다. 이 위치에서 관상 관류 15분후, 관상류, 심박수, 발생 좌심실압 (LVP), 피크 dP/dt 및 피크 -dP/dt를 측정하였다. 관상류 및 심박수를 2시간 동안 매 15분 마다 측정하였다. 제2 회로에 전달시킨 후 다시 LVP, 피크 dP/dt 및 피크 -dP/dt를 75분 및 135분에서 측정하였다. 1분에 걸쳐 좌심실 수축수를 계수함으로써 심박수를 측정하였다. 1분에 걸쳐 폐동맥으로부터 방출물을 수집함으로써 관상류를 측정하였다. LVP, 피크 dP/dt 및 피크 -dP/dt를 연속적인 관상 동맥 관류 동안 박동하고 비작동 위치에서 측정하였다. 좌심실력 변환기(Biopac Systems, Inc., Santa Barbara, CA)를 사용하여 좌심실압 (수축압과 확장압의 차이) 및 좌심실압 확장 (dP/dtmax) 및 이완 (-dP/dtmax)의 피크 속도를 측정하였다. LV력 변환기로부터의 데이터를 아날로그-투-디지탈 전환기(Biopac Systems Inc., Santa Barbara, CA)를 사용하여 디지탈화하고, 인식 소프트웨어(Version 3.2.6, Biopac Systems Inc., Santa Barbara, CA) 및 데스크탑 컴퓨터(Nexstar, Fremont, CA)를 사용하여 분석하였다. 시험 회로는 원심분리 펌프(Medtronic Bio-Medicus pumphead, Model #9154R, Medtronic Blood Systems, Inc., Anaheim, CA)와 바이오-콘솔(Medtronic Bio-Medicus Inc., Eden Prairie, MN), 성인 막형 산소 공급기(Sarns/3M Health Care, Inc., Ann Arbor, MI), C-Flex 통합 중합체 튜빙(Fisher, Largo, FL), 40 ㎛ 혈액 필터(Pall Biomedical, Inc, Fajardo, PR) 및 2개의 유리 저장기로 구성되었다. 관류액의 온도는 가열기/냉각기(Fisher Scientific Inc., Pittsburgh, PA)에 의해 유지하고 막형 산소 공급기를 통해 순환된다
시험 용액
좌심실 기능을 표준 생리학적 크리스탈로이드 용액을 사용하여 두 군에서의 모든 심장에서 평가하였다. 조성은 하기와 같았다: KCl(4.7 mEq/L), NaCl(151.5 mEq/L), MgSO4(5.0 mEq/L), CaCl2(2.0 mEq/L), 리도카인 HCl(12.5 mg/L), 헵파린 나트륨(1250 단위/L), 덱스트로스(6.1 mOsm/L), 인간 인슐린(30.7 단위/L) 및 트로메타민(THAM) 용액(6.1 cc/L).
심실의 물 함량의 측정
시험 회로상에서 역행성 대동맥 관류 135분후, 각각의 군에서 초기 5개의 심장의 심실 심근에서 심방 및 다른 연조직을 제거하였다. 좌심실 심근을 110℃에서의 건조 전 및 후에 칭량하였다.
테이터 분석
테이터를 평균±SE로서 기록하였다. 시스탈 7.0.1 소프트웨어 패키지(SPSS, Inc., 일리노이주 시카고 소재)를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 0.05 미만의 p 값은 유의한 것으로 고려하였다.
물질
6％ PEG-Hb, 5mM NaPO4, 5mM NaHCO3및 150 mM NaCl을 함유하는 용액 중의 소 PEG-Hb를 엔존사 (Piscataway, NJ)로부터 얻었다. 일반 식염수(0.9％ NaCl)를 박스터 헬스 케어(Irvine, CA)로부터 얻었다. 혈액 가스 분석기(288 Blood Gas System, Ciba-Corning Diagnostics Corp., Medfield, MA) 및 자동화 응고 타이머(Medtronic Hemotec, Inc., Englewood, CO) 및 혈액 글루코스 미터(Lifescan, Inc., Milpitas, CA)를 이용하여 용액을 모니터링하였다. 막형 산소 공급기는 사른스/3M 헬스 케어사(Ann Arbor, MI)에서 수득하였다.
<결과>
발생 좌심실압
0.5 cc LV 용량에서 발생 LV 압력은 보존의 종료 후 15분에서 PEG-Hb와 크리스탈로이드 보존 심장 사이에서 유사하였다(p=0.46, 도 2). 그러나, 0.5 cc LV 용량에서의 LV 압력은 보존의 종료 후 75분(p=0.006) 및 135분(p=0.002)에서 크리스탈로이드 보존 심장과 비교하여 PEG-Hb 보존 심장에서 월등하였다.
LV 수축의 최대 속도
0.5 cc LV 용량에서의 피크 dP/dtmax는 보존의 종료 후 15분(p=0.10, 도 3)에서 크리스탈로이드 보존 심장과 비교하여 PEG-Hb 용액을 사용하여 보존된 심장중에서 월등한 경향으로 흘렀다. 그러나, 0.5 cc LV 용량에서의 피크 dP/dtmax는 보존의 종료 후 75분(p=0.01) 및 135분(p=0.001)에서 크리스탈로이드 보존 심장과 비교하여 PEG-Hb 보존 심장에서 월등하였다.
LV 이완의 최대 속도
0.5 cc LV 용량에서의 피크 -dP/dtmax는 보존의 종료 후 15분(p=0.27)에서PEG-Hb와 크리스탈로이드 보존된 심장들 사이에서 유사하였고, 보존의 종료 후 75분(p=0.07, 도 4)에서 월등한 경향으로 흘렀다. 0.5 cc LV 용량에서의 피크 -dP/dtmax는 보존의 종료 후 135분(p=0.006)에서 크리스탈로이드 보존된 심장과 비교하여 PEG-Hb 보존 심장에서 월등하였다.
심실 물 함량
총 심실 중량의 물 백분률은 군 I에 대해 82.0％, 군 II에 대해 81.6％이었다(p=NS).
관상류
보존후 관상류는 PEG-Hb 및 크리스탈로이드 보존 심장 사이에서 유사하였다(도 5).
심박수
심박수는 시험 시간을 통해 군 I 및 II에 대해 동일하였다(p=NS, 표 1).
<결론>
이식용 심장을 생체외 보존하는 2가지의 일반적인 기술이 있다. 주목받고 있으며 현재 사용중인 표준 기술은 기증자 심장의 동종이식편의 저온 허혈성 침지 저장법이다. 2번째 심장 보존 방법은 관상 관류 보존법이다. 이러한 2가지 방법은 병용할 수 있으며, 그렇게 하여 개선된 결과를 얻고 있다. 관류 보존법은, 대사 노폐물의 연속 세척, 및 심근으로의 영양분, 대사성 기질 및 산소의 전달이 가능하므로 침지 보존법보다 우수하다 (2). 여러 이유로 인해, 관류 보존법은 이식용 심장을 생체외 보존하는데 임상적으로 사용되지 않았다. 첫째로, 사용자 친화적이고, 실용적이고 휴대가능한 관류 보존 장치가 현재로선 사용불가능하다. 두번째로, 최근 관류 보존에 대한 대부분의 연구가 식염수 기재 심근수축정지 용액 및 과불소화탄소를 사용하여 수행되어 왔다. 식염수 기재 심근수축정지 용액은 불행하게도 매우 소량의 산소를 운반하므로 이들을 사용할 경우 기증자의 기관에 상당한 허혈 손상이 있게 된다 (3-7). 심장 보존에 대한 다양한 결과를 보여온 과불소화탄소 기재 용액은 매우 고가이고 독성을 나타낼 수도 있다 (2, 8-11).
기질 무함유 헤모글로빈 기재 용액을 사용하는 관류 보존법은 생체외 심장 보존에 대한 혁신적인 수단이다. 기질 무함유 헤모글로빈은 초기에는 외상에 따른 생명을 위협하는 출혈의 치료에 사용하기 위한 혈액 대용물로서 개발되었다. 이식학자 사이에서는 기관 보존 용액으로서 이러한 용액의 잠재성에 대한 관심이 높다. 이러한 연구의 목적은 정상칼륨혈의 저칼슘혈 폴리에틸렌 글리콜 코팅 소 헤모글로빈 기재 용액을 사용하는 관류 보존법의 유용성을 평가하는 것이었다.
Hb로의 PEG의 공유 부착은 Hb 본체의 입도가 보다 커지게 하고, 이는 헤모글로빈이 과도하게 커져서 간질 공간으로 용이하게 이동하지 못하게 함으로써 혈관 공간내에 헤모글로빈을 유지시키는데 도움을 줄 수 있다. 제기되는 질문 중 하나는 이 연구에 있어서 어떠한 유리한 메카니즘이 PEG 또는 헤모글로빈 또는 PEG와 헤모글로빈의 조합에 후속되는가이다. 각각 단독으로 사용될 경우 PEG 및 헤모글로빈 모두에 의해 유리한 작용에 대한 이론적 기초는 존재한다. 브렛슈나이더 (Bretschneider)의 HTK 심근수축정지 용액에 첨가될 때, PEG는 좌심실 기능 및 심근육 부종의 개선된 회복과 관련된다 (12). PEG 작용의 메카니즘은 불확실하지만, 아마도 삼투 팽창의 방지 및 지질 과산화의 억제가 포함된다 (12). 한편, 헤모글로빈은 산소를 심근으로 운반 및 전달할 수 있다. 유사하게, 헤모글로빈은 용액의 종창 효과에 기여하고 조직 부종을 감소시키는 작용을 하는 것으로 보인다.
본 발명자들은 허혈 및 재관류 중에 칼슘의 세포내 축적 저칼슘혈의 축적이 세포 손상과 관련되고 (13-17), 저산소증으로 압박받는 심장을 저칼슘혈 용액에 의해 보호될 수 있기 때문에 (13), 보존 용액을 저칼슘혈로 제조하였다. 본 발명자들은 박동하는 심장이 적절한 산소의 전달이 이루어질 시에는 부종에 대해 덜 민감할 수 있다는 것을 알아내고 용액을 정상칼륨혈로 제조하였다. 마지막으로, 본 발명자들은 마그네슘이 칼슘의 막형 수송을 억제하므로 칼슘의 세포내 축적을 억제하고, 이는 칼슘의 유해한 효과의 방지를 도울 수 있기 때문에 (18-21) 약간 과마그네슘혈 보존 용액을 제조하였다. 마그네슘은 성숙한 돼지 심장 보다 칼슘의 유독 효과에 민감한 새끼 돼지의 허혈성 심장에서 칼슘의 유해한 효과를 감소시킴을 나타냈다 (22).
본 연구에서는 인간 헤모글로빈과 구조는 유사하나 여러 중요한 차이점을 갖는 소 헤모글로빈을 사용하였다. 첫번째로, 산소-헤모글로빈 해리 곡선은 소의 헤모글로빈이 조직 수준에서 산소를 보다 용이하게 방출하는 것으로 약간 이동된다. 두번째로, 2,3-디포스포글리세레이트는 산소에 대한 인간의 헤모글로빈의 친화도를 감소시키는 반면, 염소 음이온은 유사하게 결합하고 산소에 대한 소의 헤모글로빈의 친화도에 영향을 미쳐 조직 수준에서 소의 헤모글로빈으로부터 산소의 해리를증가시킨다. 본 문헌에 기재된 것과 상이한 제형물 중의 PEG 개질 Hb는 현재 암 환자의 방사선 치료에 대한 강화제로서의 사용을 위한 2단계 임상 시험 조사중이다.
심장 보존 기간을 연장시키는 것은 대단한 가치가 있다. 첫번째로, 기증자의 기관에 대한 허혈을 감소시켜 이식후 이식편 기능 및 기관 수용자의 생존을 개선한다. 두번째로, 심장 보존 기간을 연장시키므로써 장래의 HLA 매칭 및 보다 양호하게 매칭되는 기관 수용자에게로의 보다 장거리에 걸친 심장의 수송을 가능하게 한다. HLA 비매칭은 초기의 높은 거부 위험성이 증가된다. 이는 재입원 및 자원 사용의 증가를 야기한다. 관상동맥 맥관장애 (CAV)는 HLA 비매칭 정도와 관련된다. 보다 많은 거부 에피소드를 나타내는 환자들 사이에서는 CAV가 증가한다 (23). HLA-DR 비매칭은 최대 10년 동안 조사할 경우, 이식 생존자에 대해 강한 부작용 효과를 나타냈다 (24-25).
이 용액은 다른 기관의 보존에 대해서도 마찬가지로 시험되어야 한다. 심장은 가장 대사 활성적이고 통상적으로 이식된 고형 기관의 허혈에 대해 가장 민감하다. 이러한 데이터는 PEG-Hb 기재 용액이 다른 고형의 이식가능한 기관의 관류 보존에 유용함을 제시하고 있다. 이러한 사실은 제어된 동물 실험으로 조상되어야 한다. 또한, 이후 조사는 이러한 Hb 기재 용액의 최적화에 유용할 것이다. 남아있는 몇몇 의문점에는 최적 보존 온도, Hb 농도 및 최적 칼륨 농도가 포함된다.
30 mmHg 및 20℃에서 PEG-Hb를 사용한 토끼 심장의 8시간 동안의 연속 관류 보존은 유사한 심근 부종에도 불구하고 PEG-Hb의 첨가 없는 화학적으로 유사한 크리스탈로이드 용액을 사용한 8시간 관류보다 우수한 좌심실 기능을 나타낸다. PEG-Hb를 사용하는 연장된 심장 관류 보존은 이식에 유용한 것으로 증명될 수 있다. 다음 조사 방향은 막 정지시킨 심장을 사용한 관류 보존과 주목받는 표준과 유사한 기술을 사용하여 보존된 심장을 비교하는 것이다. 또한, 보존된 심장은 혈액 관류 후에 좌심실 기능을 평가하기 위해 이식되어야 한다.
참고문헌
<범례>
도 1. 단리된 심장 관류 보존 회로.
도 2. 보존 후 15분, 75분 및 135분에서의 발생 좌심실압.
도 3. 보존 후 15분, 75분 및 135분에서의 LV 수축의 최대 속도.
도 4. 보존 후 보존 후 15분, 75분 및 135분에서의 LV 이완의 최대 속도.
도 5. 관류 보존 8시간 후 관상 혈류.
<표 1>
관류 보존 8시간 후의 심박수
심박수
시간 (분) PEG-Hb 크리스탈로이드 p 수치
15 117±8.4 100.8±8.4 0.19
30 104.9±7.9 98.4±4.9 0.48
45 98.8±6.6 95.2±4.6 0.66
60 94.1±6.6 97.6±5.7 0.70
75 90.9±6.8 96.2±5.5 0.55
90 99.2±6.6 97.0±3.5 0.77
105 97.8±6.3 89.1±4.8 0.30
120 95.0±6.4 75.8±11.5 0.14
135 100.5±6.3 73.9±13.7 0.07

Claims (30)

  1. PEG-Hb, 생리학적 필수 전해질 1종 이상, 가용성 단백질 1종 이상, 영양 배합물 1종 이상, 및 심혈관계에 작용하는 제제 1종 이상을 포함한 구성성분의 크리스탈로이드 기재 용액을 포함함을 특징으로 하는 이식을 위한 기증자의 기관 보존용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 전해질이 MgSO4, KCl, CaCl2, NaCl, NaHCO3및 Na2HPO4, NaH2PO4또는 둘다를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 1종 이상의 가용성 단백질이 인간 알부민을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 1종 이상의 가용성 단백질이 인간 인슐린을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 1종 이상의 영양 배합물이 단순 당류를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단순 당류가 덱스트로스를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 1종 이상의 영양 배합물이 탄수화물 및 그의 대사산물을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 1종 이상의 영양 배합물이 산화방지제를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 산화방지제가 글루타티온, 리포산, N-아세틸 시스테인, 토코페롤, 아스코르브산, L-티아졸리딘-2-온-4-카르복실산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 심혈관계에 작용하는 상기 1종 이상의 제제가 헤파린 나트륨을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 심장 혈관계에 작용하는 상기 1종 이상의 제제가 리도카인 HCl를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 크리스탈로이드 기재 용액이 약 3 부피％의 PEG-Hb를포함함을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 1종 이상의 구성성분이 KCl (4.7 mEq/L), NaCl (148.7 mmol/L), Na2HPO4/NaH2PO4(2.5 mmol/L), NaHCO3(2.5 mmol/L), MgSO4(5.0 mEq/L), CaCl2(1.0 mEq/L), 리도카인 HCl (12.5 mg/L), 헤파린 나트륨 (1250 단위/L), 덱스트로스 (6.1 mOsm/L), 인간 알부민 (1.5 gm/L), 인간 인슐린 (30.6 단위/L), 0.3M 트로메타민 (THAM) 용액 (7.3 cc/L)의 군으로부터 선택된 것을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 크리스탈로이드 기재 용액의 pH가 37℃에서 측정하였을 때 7.1로 유지되는 것인 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 크리스탈로이드 기재 용액의 pH가 20℃에서 측정하였을 때 7.4인 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 크리스탈로이드 기재 용액이 이식을 위하여 운송 동안 기증자의 기관 동종 이식편의 생체외 보존을 위해 사용되는 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 크리스탈로이드 기재 용액이 개심술 동안 생체내 심근보존을 위해 사용되는 것인 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 상기 크리스탈로이드 기재 용액이 혈액 대용물 또는 혈액 대치물로서 사용되는 것인 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 심근수축정지 또는 저온 심정지를 달성하기 위하여 칼륨 농도를 증가시켜 세포내 수준을 반영하도록 상기 크리스탈로이드 기재 용액을 조절한 조성물.
  20. 이식 전 생체외에서 기증자 인간 및 동물 기관을 보존하기 위하여 기증자 기관의 생체외 보존을 목적으로 폴리에틸렌 글리콜 치환 소 헤모글로빈 기재 용액을 포함함을 특징으로 하는 이식을 위한 기증자 기관 보존용 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 치환 소 헤모글로빈 기재 용액이 PEG-Hb, 및 인간 알부민, 덱스트로스, 헤파린 나트륨, 리도카인 HCl, MgSO4, KCl, CaCl2, 0.3M 트로메타민 (THAM) 용액, NaCl, NaHCO3및 Na2HPO4/NaH2PO4의 군으로부터 선택된 1종 이상의 구성성분을 포함함을 특징으로 하는 기증자 기관 보존용 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 치환 소 헤모글로빈 기재 용액이 약 3 부피％의 PEG-Hb를 포함함을 특징으로 하는 기증 기관 보존용 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 1종 이상의 구성성분이 KCl (4.7 mEq/L), NaCl (148.7 mmol/L), NaH2PO4/Na2HPO4(2.5 mmol/L), NaHCO3(2.5 mmol/L), MgSO4(5.0 mEq/L), CaCl2(1.0 mEq/L), 리도카인 HCl (12.5 mg/L), 헤파린 나트륨 (1250 단위/L), 덱스트로스 (6.1 mOsm/L), 인간 알부민 (1.5 gm/L), 인간 인슐린 (30.6 단위/L), 0.3M 트로메타민 (THAM) 용액 (7.3 cc/L)의 군으로부터 선택된 것을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  24. 이식 후 기증자 기관이 허용가능한 기능을 회복하도록 생체외 보존을 제공하기 위해 상기 기증자 기관의 조직을 위한 산소, 영양 및 전해질 환경 요소를 포함함을 특징으로 하는 기증자 기관의 이식을 위한 기증자 기관 보존용 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 산소, 영양 및 전해질 환경 요소가 PEG-Hb, 및 인간 알부민, 덱스트로스, 헤파린 나트륨, 리도카인 HCl, MgSO4, KCl, CaCl2, 0.3M 트로메타민 (THAM) 용액, NaCl, NaHCO3및 Na2HPO4/NaH2PO4의 군으로부터 선택된 1종 이상의 구성성분을 포함함을 특징으로 하는 기증자 기관 보존용 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 상기 산소, 영양 및 전해질 환경 요소가 약 3 부피％의 PEG-Hb를 포함함을 특징으로 하는 기증자 기관 보존용 조성물.
  27. 제24항에 있어서, 1종 이상의 구성성분이 KCl (4.7 mEq/L), NaCl (148.7 mmol/L), Na2HPO4/NaH2PO4(2.5 mmol/L), NaHCO3(2.5 mmol/L), MgSO4(5.0 mEq/L), CaCl2(1.0 mEq/L), 리도카인 HCl (12.5 mg/L), 헤파린 나트륨 (1250 단위/L), 덱스트로스 (6.1 mOsm/L), 인간 알부민 (1.5 gm/L), 인간 인슐린 (30.6 단위/L), 0.3M 트로메타민 (THAM) 용액 (7.3 cc/L)의 군으로부터 선택된 것을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  28. 기증자 기관을 절제하고;
    정상칼륨혈의 저칼슘혈 소 PEG-Hb 기재 용액으로 상기 기증 기관을 관류하고;
    산소 공급 환경에서 상기 정상칼륨혈의 저칼슘혈 소 PEG-Hb 기재 용액으로 연속 관류하면서 예정된 시간 동안 일정 온도에서 상기 기증자 기관을 보존하는 것을 포함함을 특징으로 하는 기증자 기관의 수확 방법.
  29. 제28항에 있어서, 95％ O2/5％ CO2로 상기 정상칼륨혈의 저칼슘혈 소 PEG-Hb 기재 용액에 산소 공급하는 것을 포함함을 특징으로 하여 산소 공급 환경에서 상기기증자 기관을 보존하는 것을 포함하는 방법
  30. 제28항에 있어서, PEG-Hb, 및 인간 알부민, 덱스트로스, 헤파린 나트륨, 리도카인 HCl, MgSO4, KCl, CaCl2, 트로메타민 (THAM) 용액, NaCl, NaHCO3, 및 Na2HPO4/NaH2PO4의 군으로부터 선택된 1종 이상의 구성성분을 연속 관류하는 것을 포함함을 특징으로 하여 정상칼륨혈의 저칼슘혈 소 PEG-Hb 기재 용액으로 상기 기증자 기관을 관류하는 것을 포함하는 방법.
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