FI95042B - Varastointimenetelmä kasvialkioita varten - Google Patents

Description

, 95042

Varastointimenetelmä kasvialkioita varten - Lagringsförfarande för växtgroddar Tämän keksinnön kohteena on menetelmä somaattisten tai tsygoot-tisten kasvialkioiden varastoimiseksi.

Useita lajeja voidaan varastoida alhaisissa lämpötiloissa so-lususpensioiden, kovettumien tai jopa meristeemien muodossa.

Alkioiden matalalämpötilainen varastointi on monissa tapauksissa oikeutettua, esimerkiksi taimien tuotannon säätelemiseksi kausiluonteisesti tai kloonilinjan säilyttämiseksi.

Alkioiden matalalämpötilavarastoinnilla saavutetaan mahdollisuus pysäyttää hetkellisesti alkioiden kehitys, saavutetaan aika niiden kuljettamiseksi siemenpenkkiin tai niiden varastoimiseksi sekä mahdollisuus muodostaa genotyyppipankkeja geneettisen perinnön progressiivisen huononemisen välttämiseksi.

Somaattisilla alkioilla on tiettyjä etuja kasvien moninkertaistamiseksi. Ne saavat periaatteessa alkunsa yksittäisestä solusta ja muodostavat geneettisesti yhtenäisiä kasveja. Muodostumisensa alkuvaiheesta lähtien somaattisilla alkioilla on dipolaarinen rakenne: niillä on kaksivartiset- ja juuriset meristeemit, jotka ovat välttämättömät kasvin muodostamiseksi. Tästä syystä somaat-. tinen alkiosynty näyttää mielenkiintoiselta vaihtoehdolta kasvi en lisäämiseksi: sitä voidaan käyttää tuotantokustannuksiltaan kalliiden lajien tai in vitro viljelmistä muodostuvien suurteho-yksilöiden tai esimerkiksi vaikeasti suvullisesti käsiteltävien transformoitujen kasvien nopeaksi moninkertaistamiseksi.

Alkioiden varastointiin liittyy monimutkaisia ongelmia. Erityisesti on tärkeätä pitää elossa ne kaksi meristeemistä napaa, jotka varmistavat juuren ja varren kasvun ja organogeneesin jatkumisen.

2 95042

On olemassa erilaisia tunnettuja menetelmiä alkioiden varastoimiseksi alhaisessa lämpötilassa.

Eräässä tällaisessa menetelmässä suoritetaan alkioiden esivilje-ly sorbitolilla, proliinilla tai mannitolilla rikastetussa väliaineessa, impregnaatio 0°C:ssa kasvualustassa, joka sisältää· lisättyä dimetyylisulfoksidia ja/tai glyserolia, indusoitu hidas jäädytys -40°C:een ja sen jälkeen nopea jäädytys nestemäisessä typessä. Alkiogeneesin jatkuminen sulatuksen jälkeen edellyttää 2.4- dikloorifenoksietikkahapon lisäämistä kasvualustaan.

Erääseen toiseen agar-väliaineeseen viljeltyihin somaattisiin alkioihin sovellettavassa menetelmässä suoritetaan vaiheet, joissa alkioita esiviljellään yhden viikon ajan sukroosirikas-tetussa väliaineessa ja kryoputkeen nestemäiseen typpeen kuivina sijoitettujen alkioiden välitön jäädytys.

Vielä eräässä tunnetussa menetelmässä somaattisia alkioita esivil jellään väliaineessa, johon asteittain lisätään ainakin 2,5 % dimetyylisulfoksidia ja sen jälkeen ne jäädytetään hitaasti -100°C:een ja sen jälkeen nopeasti nestemäisessä typessä. Alkiogeneesin uudelleenkäynnistymistä helpottaa viljely väliaineessa, joka sisältää 0,1 mg 1_1 2,4-dikloorifenoksietikkahappoa.

Esimerkiksi dimetyylisulfoksidin tai glyserolin tapaisten kryo-suojäävien aineiden tehtävänä on estää jään muodostuminen pakastamisen aikana. Tämän tyyppisten aineiden käyttöön liittyy kuitenkin tiettyjä haittapuolia. Yhtäältä ne eivät yleensä ole helposti sublimoituvia eivätkä tästä syystä voi osallistua myöhemmin seuraavan lyofilisointikäsittelyyn; toisaalta ne voivat . olla sytotoksisia.

2.4- dikloorifenoksietikkahapon tapaisten auksiinien tehtävänä on pitää solut neutraalissa tilassa kallogeneesin aikana ja edistää solujen lisääntymisen uudelleensyntymistä alkioiden sulatuksen jälkeen. Voidaan todeta, että alkioiden kehittymisen pysäyttäminen pakastamalla aiheuttaa usein niiden epänormaalia uudelleen- 3 95042 kasvua. Auksiinit kykenevät edistämään jälkikasvuisten alkioiden muodostumista solujakautumisen avulla alkiogeneesin uusiutumisen aikana sekä lisäämään toisen alkiogeneesin riskejä.

Tunnetun tekniikan haittapuolten välttämiseksi esillä olevan keksinnön tarkoituksena on saada aikaan menetelmä somaattisten tai tsygoottisten kasvialkioiden varastoimiseksi siten, että alkioiden kehitys saadaan pysäytetyksi jäädyttämällä ja sen jälkeen aloitetuksi uudelleen ilman morfogeneesin muiden muotojen, kuten toisen alkiogeneesin tai kallogeneesin ilmenemistä.

Tätä tarkoitusta varten keksinnön mukainen menetelmä on tunnettu siitä, että alkiot esikäsitellään 30 sek. - 36 tuntia kasvuväliainees-sa, joka sisältää sakkaroosia osmoottista painetta kehittävänä aineena, minkä jälkeen esikäsitellyt alkiot jäähdytetään ja pakastetaan lämpötilaan -15 - -40°C.

Lämpötilaan -15 - -40°C pakastetut alkiot voidaan varastoida tässä lämpötilassa tai ne voidaan myöhemmin upottaa nestemäiseen jäähdytysaineeseen ja varastoida alhaisemmassa lämpötilassa.

Eräs tämän menetelmän etu on siinä, että ei tarvitse käyttää toksisia ja/tai ei-sublimoituvia kryosuojaavia aineita. Toinen etu on se, että kasvualustoissa ei tarvitse käyttää auksiineja enne pakastusta ja sulatuksen jälkeen uuden kasvun aikana. Menetelmällä on se lisäetu, että se mahdollistaa varastoinnin helposti saavutettavassa alhaisessa (-14/40°C) lämpötilassa (esimerkiksi kotipakastimessa) tarvitsematta käyttää kalliita laitteita.

Edelleen keksinnön etuna on se, että saadaan aikaan varastointi-menetelmä, joka voidaan suorittaa nopeasti ja helposti.

Lisäksi etuna on se, että saadaan aikaan alkioiden myöhempi lyofilisointi.

4 95042

Keksinnön mukainen varastointimenetelmä mahdollistaa sellaisten alkioiden saamisen, joilla on normaali kasvun jatkuminen tarvitsematta käyttää kasvunedistäjiä ja joilla ei ole mitään satunnaista lisääntymistä, jolloin tuloksena saadaan parempilaatuisia siemeniä siitä syystä, että toinen alkiogeneesi on haitallinen tuotteen teolliselle jakelulle johtuen siitä, että tällöin voi tuloksena olla ei-haluttuja moni-ituisia siemeniä.

Esillä olevassa keksinnössä käytetyt alkiot voivat olla mitä tahansa lajia ja alkuperältään erilaisia. Alkiot voivat olla esimerkiksi porkkananalkioita.

Alkiot voivat olla somaattisia alkioita tai tsygoottisia alkioita .

Somaattisia alkioita voidaan saada indifferentioiduista solu-suspensioista. Tässä tapauksessa voidaan esimerkiksi hybridistä alkuperää olevat siemenet idättää aseptisesti. Alkiolehdet voidaan leikata ja sijoittaa kasvualustaan, joka sisältää auk-siineja. Saadut haavasolukot voidaan sitten dissosioida nestemäisessä kasvualustassa. Tämä antaa differentioimattoman solu-suspension, jonka solut useiden alaviljelyiden jälkeen voidaan siirtää kasvualustaan. Noin 10 päivän jälkeen solususpensio voidaan suodattaa siten, että jäljelle jää ainoastaan halutun kokoisia soluaggregaatteja. Näitä aggregaatteja voidaan viljellä muutamia päiviä auksiinittomassa kasvualustassa alkioiden muodostumisen aloittamiseksi.

Tsygoottiset alkiot voidaan aikaansaada ottamalla näytteitä leikkaamalla siemenet kypsässä tai lievästi epäkypsässä vaiheessa.

Saadut somaattiset ja tsygoottiset alkiot voidaan luokitella kehitysvaiheensa mukaisesti. Edulliset alkiot ovat kehityksensä alkuvaiheissa niiden koon ollessa välillä 150 - 600 /xm, koska tässä vaiheessa ne kestävät paremmin pakastusta. Nämä koot 95042 5 vastaavat somaattisten alkioiden kehityksen sydänvaiheita (150 -300 μπι) tai torpedovaiheita (300 - 600 μπι) .

Saadut alkiot esikäsitellään sen jälkeen kasvualustassa, jota kutsutaan esikäsittelyaineeksi. Tämä aine voi olla alkioviljelyn alalla tyypillinen väliaine, kuten esimerkiksi Murashige- ja Skoog-väliaine, johon lisätään osmoottista paineainetta ja johon voidaan myös lisätä tiettyjä orgaanisia aineita, kuten Bl-vita-miinia, nikotiinihappoa tai adeniinia.

Pienilämpötilaisissa varastointimenetelmissä on välttämätöntä estää solujen välisen jään muodostuminen, sillä vaikka tämä ei suoranaisesti vahingoita alkioita pakastamisen aikana, se voi kuitenkin aiheuttaa tuhoavaa uudelleenkiteytymistä sulatuksen aikana. Keksinnön mukaisessa menetelmässä alkiot dehydratoidaan osittain esikäsittelemällä väliaineessa, joka sisältää osmoottista paineainetta niiden mahdollisesti kärsimien vaurioiden vähentämiseksi.

Asiantuntija voi valita tämän aineen sellaisista aineista, jotka kykenevät tunkeutumaan kudoksiin ja muodostamaan hyvän osmoottisen paineen solun oikean dehydraation aikaansaamiseksi vaikuttamatta kalvoläpäisevyyteen. Lisäksi tämä aine ei saa olla millään tavalla myrkyllinen alkioille. Tämä aine voi olla sakkaroosin tai trealoosin tapainen sokeri tai joku muu tunnettu aine, • joka kykenee suorittamaan samat tehtävät. Osmoottisen paineai- neen pitoisuuden esikäsittelyn väliaineessa ei tulisi olla liian alhainen solun oikean dehydraation varmistamiseksi. Pitoisuuden ei tulisi olla myöskään liian suuri alkioiden vahingoittumisen välttämiseksi tai niiden uudelleenkasvun estämiseksi sulatuksen jälkeen.

Keksinnön mukaisen varastointimenetelmän erässä edullisessa suoritusmuodossa esikäsittelyväliaine sisältää sakkaroosia pitoisuuden ollessa 75 - 190 gl-1 ja edullisesti 100 - 150 gl-1.

» 6 95042

On havaittu, että pelkästään tämä esikäsittely ja sen jälkeen suoritettu pakastusvaihe esitettyyn lämpötilaan mahdollistaa halutun päämäärän saavuttamisen yksinkertaisella, tehokkaalla ja luotettavalla tavalla.

Esikäsittely voi kestää 30 sekunnista 36 tuntiin. Esikäsittely ei saisi olla liian lyhyt osmoottisen paineaineen saattamiseksi osittain dehydratoimaan solut ja lisäämään niiden pakastussta-biilisuutta. Toisaalta esikäsittelyn ei tulisi kestää liian kauaa, koska muussa tapauksessa alkioiden pakastuskestävyys voi huonontua, josta osoituksena on se, että vielä elossa olevien alkioiden määrä vähenee sulatuksen jälkeen silloin, kun esikäsittely ylittää 36 tuntia. Käytettäessä pidennettyä esikäsittelyä alkiolle saattaa mahdollisesti tapahtua morfologisia muutoksia, jotka saattavat heikentää sen pakastuskestävyyttä johtuen siitä, että alkion kasvu jatkuu ja se saavuttaa vaiheen, jossa se ei yhtä hyvin sovellu pakastukseen. Toisaalta osmoottisen paineaineen suojausvaikutuksen väheneminen pitkien esikäsittelyjen aikana voidaan selittää myös alkion mukautumisella esikäsit-telyväliaineeseen, joka aiheuttaisi osmoottisen paineen vaikutuksen vähenemisen.

Esikäsittely suoritetaan edullisesti ympäröivässä lämpötilassa, eli noin 18 - 24°C:ssa ja keskimääräisessä valaistuksessa, joka on esimerkiksi 150 - 250 lux.

Esikäsitellyt alkiot jäähdytetään ja sen jälkeen pakastetaan lämpötilaan -15 - -40°C. Edullisesti ne pakastetaan noin -20°C lämpötilaan. Pakastusvaihe voidaan suorittaa siirtämällä alkiot yhdessä esikäsittelyväliaineen kanssa kryoputkiin ja sijoitta-, maila kryoputket esimerkiksi kotipakastimeen. Pakastuksen aikana käytetty jäähdytysnopeus vaikuttaa jään muodostumisnopeuteen ja alkioiden dehydraatioasteeseen jään muodostumishetkellä. Jäähdy-tysnopeus on edullisesti varsin kohtuullinen ja suuruusluokkaa 0,1 - 1°C minuutissa lämpötila-alueella -6 - -40°C alkioiden myöhemmän uudelleenkasvun edistämiseksi. Ympäröivästä lämpöti- 7 95042 lasta -6°C lämpötilaan tapahtuvassa jäähdytyksessä jäähdytysno-peus voi olla suurempi, esimerkiksi 1 - 5°C minuutissa.

Lämpötila-alueella -15 - 40°C pakastetut alkiot voidaan varastoida sellaisenaan ainakin yhdeksi kuukaudeksi. Pidempiä varas-tointiaikoja varten alkiot varastoidaan edullisesti alhaisemmassa lämpötilassa, esimerkiksi nestemäisessä jäähdytysaineessa. Tämä johtuu siitä, että pitkäaikainen varastointi -15/-40°C:ssa näyttää sopimattomalta kasvun uusiutumisen kannalta ja siis alkioiden käyttökelpoisuuden kannalta sulatuksen jälkeen. Näyttää siltä, että lämpötila -15/-40°C on liian korkea alkion metabolismin täydellisen pysähtymisen varmistamiseksi. Mikäli vielä pidempää varastointia tarvitaan, voidaan pakastusta -15/-40°C:een pitää ensimmäisenä vaiheena ja sen jälkeen voidaan suorittaa pakastus nestemäisessä jäähdytysaineessa alhaisemmassa lämpötilassa.

Tässä tapauksessa alkiot pidetään edullisesti lämpötilassa -15/-40°C tietyn jakson, joka on suuruusluokkaa 18 - 24 tuntia täydellisen jäätymisen aikaansaamiseksi.

Sen jälkeen alkiot voidaan upottaa suoraan nestemäiseen jäädy-tysaineeseen, esimerkiksi metanolikylpyyn lämpötilassa -70°C tai nestemäiseen typpikylpyyn lämpötilassa -196°C tai ne voidaan jäähdyttää hyvin alhaiseen lämpötilaan jollakin muulla tavalla.

Jäätyneet tai pakastetut alkiot voidaan sen jälkeen varastoida jopa useita vuosia kestäviksi pitkiksi ajanjaksoiksi. Jäätyneet alkiot voidaan sitten kapseloida esimerkiksi alginaattityyppi-sillä keino- tai luonnonpolymeereillä keinotekoisten siementen , . muodostamiseksi.

Alkiot voidaan sulattaa esimerkiksi upottamalla kryoputket 40°C vesikylpyyn 2 minuutiksi. Putket voidaan poistaa vesikylvystä ennen jään täydellistä sulamista lämpötilan liian nopean nousun välttämiseksi. Täydellisen sulatuksen jälkeen alkioista voidaan .. poistaa esikäsittelyväliaine yksinkertaisella pesulla, pestyt 8 95042 alkiot voidaan sijoittaa alkioviljelyssä tyypilliseen kasvualustaan, jollainen on esimerkiksi Murashige- tai Skoog-väliaine.

Tämä väliaine voi sisältää assimiloituvaa hiilipitoista substraattia, esimerkiksi sakkaroosia, jonka pitoisuus on esimerkiksi 1-10 gl-1.

Tämä kasvualusta on merkittävä siinä mielessä, että siinä ei ole lainkaan auksiineja.

Tämän jälkiviljelyn jälkeen alkioiden kehitys on verrattavissa pakastamattomien alkioiden kehitykseen.

Pakastuksen ja jälkiviljelyn jälkeinen elossaolo näkyy alkioiden kaksinapaisena kasvuna. Alkio säilyttää tehokkaasti rakenteensa eheyden myöhemmän kehityksen aikana eikä siinä esiinny muuta morfogeneesimuotoa, kuten solugeneesiä tai sattumanvaraista alkiogeneesiä.

Siten keksinnön mukaineh varastointimenetelmä mahdollistaa yhtäältä alkioiden eloonjäämisen morfologisesti eheinä ja toisaalta mahdollistaa sen, että alkiot säilyttävät tehokkaasti kykynsä regeneroida taimi.

Esillä olevaa keksintöä selvitetään yksityiskohtaisemmin seuraa-villa esimerkeillä. Näitä esimerkkejä edeltää esimerkki somaattisten alkioiden tavanomaisesta valmistuksesta, elinvoimaisuus-testin selvitys ja taulukko 1, jossa on esitetty edullisen esikäsittely- ja viljelyväliaineen koostumus.

Esimerkki somaattisten alkioiden valmistuksesta

Porkkanasolujen (Daucus carota L.) differentioimaton solusus-pensio alaviljellään joka 12. päivä (1 g biomassaa 100 ml:aan väliainetta) nestemäisessä Murashige- ja Skoog-kasvualustassa, jonka koostumus on esitetty taulukossa 1 ja johon on lisätty . 20 g l'1 sakkaroosia ja 0,1 mg l-1 2,4-dikloorifenoksietikka- 9 95042 happoa. Koko käsittely suoritetaan aseptisissa olosuhteissa laminaarivirtauskuvun alla. Suspensio sijoitetaan sekoittimeen, joka suorittaa epäkeskeistä hyrräliikettä nopeudella 100 rpm ja viljellään 24°C:ssa 200 lux'in valaistuksessa valojakson ollessa 16 tuntia.

8-10 päivän viljelyn jälkeen solususpensio suodatetaan siten, että jäljelle jäävät vain soluaggregaatit, joiden koko on 50 - 180 μπ\. Nämä pienet aggregaatit tai ryppäät edustavat alkioiden esialkiovaihetta ja niiden kehitys jatkuu sydän-, torpedoja taimivaiheiksi. Aggregaatit pestään ja sijoitetaan Murashige-ja Skoog-väliaineeseen, joka ei sisällä 2,4-dikloorifenoksietik-kahappoa aggregaattien määrän ollessa noin 1,5 x 103 aggregaattia per ml väliainetta.

Alkiot ovat muodostuneet 10 päivän viljelyn jälkeen. Suspensio suodatetaan siten, että jäljelle jää ainoastaan alkioita, joiden koko on välillä 150 - 600 μιη.

Elinvoimaisuustesti

Nopea ja yksinkertainen elinvoimaisuustesti on kehitetty alkioiden elinkelpoisuusasteen määrittelemiseksi pakastuksen jälkeen.

Erilaisia kriteereitä voidaan käyttää alkioiden elinkelpoisuus-asteen määrittelemiseksi ja näistä erityisen sopivia ovat - alkioiden koon lisääntyminen ja - klorofyllisen värittymisen ilmeneminen.

Näitä kriteereitä voidaan arvioida eri tavoin, esimerkiksi visuaalisella laskennalla tai biokemiallisilla testeillä (esimerkiksi värinmuodostustesti).

Tämän testin periaatteen mukaisesti sulatetut alkiot sijoitetaan nestemäiseen kasvualustaan. 10 päivän viljelyn jälkeen merkitään muistiin niiden alkioiden lukumäärä, joiden koko on lisääntynyt ja jotka osoittavat merkkejä klorofyllisestä värittymisestä.

•10 95042 Tämän määrän ja alkioiden kokonaismäärän välinen suhde mahdollistaa alkioiden elinvoimaisuusasteen määrittelyn.

Alkiot voidaan sijoittaa sen jälkeen kiinteään kasvualustaan, jonka koostumus on sama kuin aikaisemman nestemäisen väliaineen, jolloin ne voivat jatkaa kehittymistään taimivaiheeseen.

Tässä kiinteässä väliaineessa suoritetun 10 päivän viljelyn jälkeen määritellään regeneraatioaste taimivaiheeseen kehittyneiden alkioiden määrän ja alkioiden kokonaismäärän välisenä suhteena.

Taulukko 1

Murashige- ja Skoog-väliaineen koostumus (pH 5,8 - 6)

Makroalkuaineet mg 1_1 NH4N03 1650

CaCl2 . 2H20 440

MgS04 . 7H20 370 KN03 1900 KH2P04 170

Mikroalkuaineet

CoCl2 0,025

CuS04 . 5H20 0,025

FeS04 . 7H20 27,8

Na2 - EDTA 37,3

MnS04 . 4H20 22,3 KI 0,83

Na2Mo04 0,25

ZnS04 . 7H20 10,6 H3B03 6,2

Muut alkuaineet 5

Nikotiinihappo 5

Adeniini 2 11 95042 + osmoottinen paineaine (esikäsittelyväliaine) tai assimiloituvat hiilipitoiset substraatit (kasvualusta)

Esimerkki 1

Yllä kuvatulla tavalla saadut torpedovaiheessa olevat somaattiset porkkana-alkiot, joiden keskimääräinen koko on 550 μπι, sijoitetaan Petrimaljoissa nestemäiseen Murashige- ja Skoog-esikäsittelyväliaineeseen, joka sisältää 135 gl“ sakkaroosia ja jossa ei ole auksiineja, jolloin alkioiden määrä on noin 100 alkiota ja 10 ml:aan väliainetta.

Näitä alkioita esikäsitellään 1 tunnin ajan 20°C:ssa 100 luxin valaistuksessa. Sen jälkeen ne siirretään kryoputkiin, jotka sisältävät 1,8 ml esikäsittelyväliainetta. Kryoputket sijoitetaan kotipakastimeen, jossa niiden sisältö jäähdytetään nopeudella l°C/minuuttia -6°C:een ja sen jälkeen nopeudella 0,4°C/mi-nuutti -6 - -20°C.

Oltuaan 24 tuntia -20°C:ssa kryoputket erotetaan kahdeksi ryhmäksi. Ensimmäinen ryhmä sulatetaan upottamalla jäätyneet kryoputket 40°C vesikylpyyn 2 minuutiksi. Toinen ryhmä upotetaan lämpötilassa -196°C olevaan nestemäiseen typpeen ja pidetään siinä yhden tunnin ajan ennen sulatuksen suorittamisesta samalla tavoin kuin ensimmäisen ryhmän kohdalla.

Täydellisen sulatuksen jälkeen alkiot pestään esikäsittelyväli-aineen poistamiseksi ja sijoitetaan 10 päiväksi nestemäiseen Murashige- ja Skoog-kasvualustaan, joka sisältää 5 gl"1 sakkaroosia ja jossa ei ole auksiineja. Sen jälkeen ne siirretään koostumukseltaan samanlaiseen kiinteään kasvualustaan.

Samoihin kasvualustoihin sijoitetaan vertailualkioita, joita ei ole esikäsitelty eikä pakastettu.

Kiinteässä väliaineessa tapahtuneen 10 päivän viljelyn jälkeen verrataan alkioiden kykyä regeneroida porkkanantaimia.

12 95042

Vertailualkioista 46 % kykenee regeneroimaan taimen. -20°C:een ja -196°C:een pakastettujen alkioiden regeneroimisasteet ovat vastaavassa järjestyksessä 44 % ja 43 %.

Pakastus ei siis heikennä alkioiden kykyä regeneroida taimia edellyttäen, että alkiot on esikäsitelty.

Esimerkki 2

Valitaan kaksi populaatiota somaattisia Daucus carota L. porkkana-alkioita .

Toinen populaatio käsittää sydänasteella olevia alkioita, joiden keskimääräinen koko on 300 ^m ja toinen populaatio käsittää torpedoasteella olevia alkioita, joiden keskimääräinen koko on 500 μτη.

Kummastakin alkiopopulaatiosta otetaan viisi näytettä (A, B, C, D ja vertailu), jotka kukin sisältävät noin 100 alkiota.

Sydänasteella olevien alkioiden näytteet Ah, Bh ja Ch ja torpedoasteella olevien alkioiden näytteet Ar, Bt ja Ct esikäsitel-lään Murashige- ja Skoog-kasvualustassa, joka sisältää 135 gl”1 sakkaroosia ja käsittelyaika on 1 tunti 20°C:ssa 200 luxin valaistuksessa.

Näytteet Ah, Bh> At ja Bt jäähdytetään sitten -20°C:een nopeudella noin 0,5°/minuutti. Sen jälkeen ne pidetään -20°C:ssa 24 tuntia. Näytteet Ah ja At sulatetaan, kun taas näytteet Bh ja Bt upotetaan lämpötilassa -196°C olevaan nestemäiseen typpeen, jossa ne pidetään yhden tunnin ajan ennen sulatusta.

Vertailun vuoksi näytteet Ch ja Ct upotetaan välittömästi lämpötilassa -196°C olevaan nestemäiseen typpeen esikäsittelyn jälkeen. Ne sulatetaan yhden tunnin kuluttua. Vertailun vuoksi näytteet Dh ja Dt jäähdytetään -20°C:een nopeudella noin 13 95042 O,5°C/minuutti ilman esikäsittelyä. Ne sulatetaan 24 tunnin kuluttua.

Sydän- ja torpedovaiheissa olevia vertailunäytteitä ei esikäsi-tellä eikä myöskään pakasteta.

Sen jälkeen eri alkionäytteet viljellään uudelleen nestemäisessä Murashige- ja Skoog-väliaineessa, joka sisältää 5 gl'1 sakkaroosia .

10 päivä viljelyn jälkeen saadaan seuraavat tulokset:

Alkioiden elinvoimaisuusaste (%) Näyte

Vaihe_A_B_C_D_Vertailu

Sydän 88 71 Q 0 90

Torpedo 84 67 0 0 91

Voidaan todeta, että esikäsittelyn jäädessä pois lämpötilaan -20°C jäädytetyt alkiot (D) eivät selviydy, kun taas yhden tunnin impregnointi esikäsittelyväliaineessa varmistaa sen, että lähes kaikki lämpötilaan -20°C pakastetut sydän- ja torpedovaiheissa olevat alkiot (A) säilyvät elossa. Samalla tavoin alkiot eivät selviydy välittömästi upotuksesta nestemäiseen typpeen • edes yhden tunnin esikäsittelyn jälkeen (C).

Esikäsittelyn jälkeen lämpötilaan -196°C ja lämpötilaan -20°C jäädytetyillä alkioilla (B) on hyvin tyydyttävä elinvoimaisuus-aste .

Haluttaessa siis varastoida alkiot lämpötilassa -196°C, niille täytyy suorittaa esikäsittely- ja -20°C:een tapahtuvat pakastus-vaiheet.

Sen jälkeen alkiot sijoitetaan kiinteään kasvualustaan, jonka koostumus on sama kuin nestemäisen väliaineen.

14 95042 10 päivän viljelyn jälkeen suurin osa näytteiden A ja B alkioista ja myös vertailunäytteistä on kehittynyt taimivaiheeksi, joilla on selvästi differentioitunut juuripiste ja klorofyllinen sirkkalehtikärki.

Nämä alkiot eivät osoita merkkiäkään solugeneesistä tai toisesta alkiogeneesistä.

Esimerkki 3

Sydänasteella ja torpedoasteella olevia somaattisia porkkana-alkioita esikäsiteltiin eripituisia jaksoja 135 gl'1 sisältävässä nestemäisessä Murashige- ja Skoog-kasvualustassa 20°C:ssa 200 luxin valaistuksessa. Sen jälkeen nämä alkiot jäähdytetään -20°C:een nopeudella noin 0,5°C/minuutti. Oltuaan 24 tuntia -20°C:ssa osa alkioista upotetaan nestemäiseen typpeen ja pidetään siinä yhden tunnin.

Sulatuksen jälkeen alkiot sijoitetaan nestemäiseen Murashige- ja Skoog-kasvualustaan, joka sisältää 5 gl'1 sakkaroosia.

Samoin viljellään vertailualkioita, joita ei ole esikäsitelty eikä pakastettu. Alkioiden elinvoimaisuusaste määritellään .10 päivän viljelyn jälkeen.

Saadaan seuraavat tulokset:

Sydänasteella olevien alkioiden elinvoimaisuusaste (%)

Esikäsittelyaika

Vertailu _30 min. 1 h 24 h 48 h 72 h -20°C:een jäädytetyt alkiot 89 88 87 56 40 -196°C:een jäädytetyt alkiot 73 72 68 42 32

Vertailualkioiden elinkelpoisuusaste on 90 %.

15 95042

Torpedovaiheessa olevien alkioiden elinvoimaisuusaste (%)

Esikäsittelyaika

Vertailu _30 min. 1 h 24 h 48 h 72 h -20°C:een jäädytetyt alkiot 85 84 82 56 34 -196°C:een jäädytetyt alkiot 78 77 78 46 36

Vertailualkioiden elinkelpoisuusaste on 90 %.

Voidaan havaita, että 10 päivän viljelyn jälkeinen elinvoimaisuusaste on käytännöllisesti katsoen identtinen esikäsittely-ajan ollessa 30 minuuttia, 1 tunti tai 24 tuntia sekä sydänas-teella olevien alkioiden että torpedoasteella olevien alkioiden kohdalla.

Sen sijaan 24 tunnin jälkeen elinvoimaisuusaste alenee progressiivisesti esikäsittelyajan pidentyessä. Tämä aste on korkeintaan noin 35 % 72 tunnin esikäsittelyajan jälkeen. Siten voidaan todeta, että alkioiden pakastuskestävyys huononee käytettäessä pidennettyjä esikäsittelyjä.

Esimerkki 4

Torpedovaiheessa olevia somaattisia porkkana-alkioita esikä-sitellään eripituisia aikoja 135 gl-1 sakkaroosia sisältävässä nestemäisessä Murashige- ja Skoog-väliaineessa 20°C:ssa 200 luxin valaistuksessa.

Nämä alkiot jäähdytetään ja pakastetaan -20°C:een nopeudella noin 0,5°C/minuutti.

Oltuaan 72 tuntia -20°C:ssa alkiot sulatetaan ja sijoitetaan nestemäiseen Murashige- ja Skoog-kasvualustaan, joka sisältää 5 gl-1 sakkaroosia.

is 95042

Samoin viljellään vertailualkioita, joita ei ole esikäsitelty eikä pakastettu.

Alkioiden elinvoimaisuusaste määritellään 10 päivän viljelyn jälkeen. Saadaan seuraavat tulokset: • Esikäsittely- aika (min.)_1_15_30_45_60 Vertailu

Elinvoimaisuusaste (5) 86 85 73 68 83 80

Voidaan havaita, että alkioiden elinvoimaisuusaste -20°C:een tapahtuneen pakastuksen jälkeen on hyvä kaikilla näillä esikä-sittelyajoilla. Alkioiden pakastusstabiilisuus saavutetaan siten hyvin nopeasti.

Esimerkki 5

Torpedovaiheessa olevia ja keskimääräiseltä kooltaan 550 μτα olevia somaattisia porkkana-alkioita esikäsitellään ja pakastetaan -20°C:een. Osa alkioista upotetaan sen jälkeen nestemäiseen typpeen esimerkissä 1 kuvatulla menetelmällä.

Alkiot varastoidaan näissä lämpötiloissa eripituisiksi ajoiksi. Sen jälkeen ne sulatetaan ja sijoitetaan nestemäiseen Murashige-ja Skoog-kasvualustaan, joka sisältää 5 gl-1 sakkaroosia. Alkioiden elinvoimaisuusaste määritellään niiden -20°C:ssa tai -196°:ssa tapahtuneen varastointiajan funktiona.

Esikäsittelemättömien sekä pakastamattomien vertailualkioiden elinvoimaisuusaste on 72 %.

Saadaan seuraavat tulokset: -20°C:een pakastetut alkiot:

Varastointi aika_24 h_1 kk_2 kk

Elinvoimaisuusaste (5) 64 69 0 95042 • 17 -196°C:een pakastetut alkiot:

Varastointiaika_24 h_1 kk 2 kk

Elinvoimaisuusaste (5) 6 67 67 -20°C:een tai -196°C:een tapahtuneen pakastuksen jälkeen on keskimääräinen elinvoimaisuusaste noin 67 % varastointiaikojen ollessa 1 päivä tai vähemmän. Tämä aste säilyy muuttumattomana -20°C:ssa tai -196°C:ssa tapahtuneen yhden kuukauden pituisen varastoinnin jälkeen. 2 kuukauden varastoinnin jälkeen ei -20°C:een varastoitujen alkioiden joukossa ole lainkaan eloonjääneitä, kun taas -196°C:ssa varastoitujen alkioiden kohdalla elinvoimaisuusaste on edelleen sama.

Esimerkki 6

Torpedovaiheessa olevia ja keskimääräiseltä kooltaan 500 μτη olevia somaattisia porkkana-alkioita esikäsitellään 1 tunnin ajan 20°C:ssa 200 luxin valaistuksessa nestemäisissä Murashige-ja Skoog-väliaineissa, joiden sakkaroosipitoisuus vaihtelee välillä 35 gl"1 - 205 gl-1.

Sen jälkeen alkiot jäähdytetään ja pakastetaan -20°C:een. Oltuaan 1 tunnin -20°C:ssa, alkiot sulatetaan ja sijoitetaan nestemäiseen Murashige- ja Skoog-kasvualustaan, joka sisältää 5 gl'1 sakkaroosia.

Samoin viljellään vertailualkioita, joita ei ole esikäsitelty eikä pakastettu.

Alkioiden elinvoimaisuusaste määritellään 10 päivän viljelyn jälkeen esikäsittelyväliaineen sakkaroosipitoisuuden funktiona.

Saavutetaan seuraavat tulokset:

Sakkaroosi (gl-1)_35 68 100 145 170 205 Vertailu

Elinvoimaisuusaste (%) 22 41 77 82 65 14 88 18 95042 135 gl"1 sakkaroosia sisältävässä väliaineessa esikäsiteltyjen alkioiden elinvoimaisuusasteon vertailukelpoinen vertailualki-oiden elinvoimaisuusasteen kanssa.

Tämä aste on edelleen varsin suuri sakkaroosipitoisuuden ollessa 100 tai 170 gl"1.

Alkioiden elinvoimaisuus heikkenee, kun sakkaroosipitoisuus muodostuu liian suureksi (205 gl-1) tai liian pieneksi (35 gl-1).

Claims (8)

19 95042

1. Kasvialkioiden varastointimenetelmä, tunnettu siitä, että alkiot esikäsitellään 30 sek. - 36 tunnin aikana kasvuvä-liaineessa, joka sisältää sakkaroosia osmoottista painetta kehittävänä aineena ja esikäsittelyn jälkeen jäähdytetään ja pakastetaan lämpötila-alueelle -15 - -40°C.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että esikäsittelyväliaine sisältää sakkaroosia pitoisuuden ollessa 75 - 190 gl'1.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lämpötilaan -15/-40°C pakastetut alkiot upotetaan nestemäiseen jäähdytysaineeseen.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että jäähdytysnopeus välillä -6 - -40°C on 0,1 - l°C/mi-nuutti.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että esikäsittelyväliaine on Murashige- ja Skoog-väli-aine, johon lisätään osmoottista painetta kehittävää ainetta.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän käyttö taimien : tuottamiseksi, tunnettu siitä, että pakastetut alkiot sulatetaan ja pestään esikäsittelyväliaineen poistamiseksi ja pestyt alkiot viljellään kasvualustassa niiden muodostamiseksi taimiksi.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän käyttö keinosiemen-ten tuottamiseksi, tunnettu siitä, että pakastetut alkiot kapseloidaan keino- tai luonnonpolymeereihin.

8. Keinosiemenet, jotka on saatu patenttivaatimuksen 7 mukaisesti . 20 95042