PT94115B

PT94115B - Processo para a conservacao de embrioes vegetais

Info

Publication number: PT94115B
Application number: PT94115A
Authority: PT
Inventors: Bruno Florim; Vincent Petiard; Claude Lecouteux
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 1989-05-23
Filing date: 1990-05-22
Publication date: 1997-03-31
Also published as: EP0399158B1; IE67530B1; FR2647465A1; FI902519A0; MY105890A; AU625795B2; FI95042B; NO901479L; DK0399158T3; NO179271B; PT94115A; EP0399158A1; DE69017078T2; DE69017078D1; AU5458290A; JPH0339019A; BR9002404A; ATE118813T1; FI95042C; MX171279B

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N2 94 115

NOME:

SOCIÊTÉ DES PRODUITS NESTLÊ S.A.

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A CONSERVAÇÃO DE EMBRIÕES VEGETAIS

INVENTORES:Bruno Florin, Claude Lecouteux e Vincent Petiard, residentes na França.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 42 da Convenção da União de Paris de 20 de Março de 1883. França, 22 de Maio de 1990, sob o No. 8906738.

Descrição referente à patente de invenção de SOCIÊTÉ DES PRODUITS NESTLÊ S.A., suiça, industrial e comercial, com sede em Vevey, Sui ça, (inventores: Bruno Florin, Claude Lecouteux e Vincent Petiard, residentes na França) para PROCESSO PARA A CONSERVAÇÃO DE EMBRIÕES VEGETAIS:

DESCRIÇÃO

A presente invenção tem por objectivo um processo para a conservação de embriões vegetais somáticos ou zigõticos.

Muitas espécies podem ser conservadas criogenicamente sob a forma de suspensões celulares, de calos ou de meristemas.

A conservação a baixa temperatura de embriões justifica-se em muitos casos, por exemplo para regular a produção de plântulas quando estão na sua época ou para acele rar a manutenção de uma linhagem clonal.

A conservação criogênica dos embriões oferece a possibilidade de bloquear temporariamente o desenvolvimento dos embriões, o tempo necessário ao seu transporte até à sementeira ou à sua armazenagem, bem como a possibilidade de criação de bancos de genotipos afim de evitar uma depreciação progressiva do património genético.

Os embriões somáticos apresentam certas vantagens para a multiplicação das plantas. Eles são em principio originários duma única célula e produzem plantas geneticamente

idênticas. Os embriões somáticos apresentam desde o início da sua formação uma estrutura bipolar: possuem os dois meristemas de caule e de raiz necessários para produzir uma planta. A embriogênese somática parece assim uma alternativa interessante para a propagação das plantas: ela poderia permitir a multipli cação rápida de espécies com um custo de produção elevado, ou de indivíduos particularmente dotados provenientes de culturas in vitro, ou de plantas transformadas dificilmente manipuláveis por via sexuada, por exemplo.

Os problemas colocados pela conservação de embriões são complexos. Trata-se em particular de conservar vivos os dois polos meristemáticos susceptíveis de assegurar a retomada do alongamento e da organogênese da raiz e do caule.

Existem diferentes procedimentos conhecidos para a conservação criogênica de embriões.

Um destes procedimentos consiste numa pré-cultura dos embriões num meio enriquecido em sorbitol, em prolina ou em manitol, seguido de uma impregnação a 0°C no meio de cultura adicionado de sulfõxido de dimetilo e/ou de glicerol e em seguida uma congelação induzida e lenta até -4o°C e finalmente uma congelação rápida em azoto liquido. A retomada da embriogênese apôs descongelação necessita a dição de ácido 2,4-diclorofenoxiacêtico ao meio de cultura.

Um outro procedimento, aplicável a embriões somáticos cultivados num meio de geleia, consiste numa pré-cultura de uma semana num meio enriquecido em sacarose, seguido de uma congelação directa em azoto líquido de embriões co locados a seco num criotubo.

Ainda um outro procedimento conhecido consiste numa pré-cultura de embriões somáticos num meio a que se adicionou gradualmente pelo menos 2,5% de sulfõxido de dimetilo, seguido de uma congelação lenta até -10C) C e depois uma congelação rápida em azoto líquido. A retomada da embriogênese é facilitada por uma cultura num meio contendo 0,lmg. Γ¹ de ãcido 2,4-diclorofenoxiacético.

evitar a formação de gelo durante a congelação. Todavia a utilização destas substâncias pode apresentar alguns inconvenientes. Por um lado, elas não são geralmente facilmente sublimáveis e não podem portanto sofrer um tratamento ulterior de liofilização, por outro lado elas podem revelar-se citotõxicas.

O papel das auxinas como o ácido 2,4diclorofenoxiacético ê de conservar as células no estado indiferenciado em fase de calogénese, e de favorecer a retomada da proliferação celular após descongelação dos embriões. Ora a paragem por congelação do desenvolvimento dos embriões induz frequentemente uma retomada anormal do seu crescimento. As auxinas podem favorecer a formação de embriões adventícios por divisão celular durante a retomada da embriogénese, e aumentar os riscos de embriogénese secundária.

Afim de resolver os inconvenientes da técnica anterior, a presente invenção tem por objectivo propor um processo de conservação de embriões vegetais somáticos ou zi góticos que permitem assegurar a paragem por congelação do desenvolvimento de embriões, e em seguida a retomada do desenvolvimento sem o aparecimento de outras fornas de morfogénese como por exemplo a embriogénese secundária ou a calogénese.

Para este fim, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo facto de:

- os embriões serem pré-tratados num meio de pré-tratamentos contendo um agente de pressão osmõtica, e em seguida os embriões pré-tratados serem arrefecdidos e congelados a uma temperatura compreendida entre -15°C e -40°C.

Os embriões congelados a -15/40°C podem ser conservados a esta temperatura, ou mergulhados posteriormente num fluido frigorífico e conservados a uma temperatura mais baixa.

Uma vantagem deste processo consiste em evitar a utilização de substâncias crioprotectoras tóxicas e/ou não sublimáveis. Uma outra vantagem consiste em evitar a utilização de auxinas nos meios de cultura utilizados antes da congelação e após descongelação durante a retomada do crescimento. Uma outra vantagem consiste em permitir a conservação a uma tem peratura baixa (-15/-40°C) em que é facilmente acessível (num congelador doméstico por exemplo) sem ter necessidade de utilizar material de elevado custo.

Uma outra vantagem consiste em propor um processo de conservação rapidamente e facilmente realizável.

Uma outra vantagem consiste em permitir uma eventual liofilização posterior dos embriões.

O presente processo de conservação permite obter embriões com uma retomada de crescimento normal, não necessitando qualquer administração de substância de crescimento, e não apresentando proliferação adventícia, e portanto uma qualidade superior da semente produzida. Com efeito, a embriogênese secundária ê prejudicial a uma distribuição industrial do produto porque se podem obter sementes multigermes indesejáveis.

Os embriões utilizados na presente invenção podem ser de qualquer espécie e de origem diversa. Ustes embriões são por exemplo, embriões de cenoura.

Os embriões podem ser embriões somáticos ou embriões zigõticos.

Os embriões somáticos podem ser obtidos por intermédio de suspensões celulares indiferenciadas. Neste caso, as sementes de mãe de híbrido por exemplo podem ser colocadas a germinar assepticamente. Os hipocotilos podem ser cortados e depois colocados num meio de cultura contendo auxinas. Os calos obtidos podem ser em seguida dissociados num meio de cultura líquida. Obtem-se assim uma suspensão celular indiferenciada em que as células, após várias transplantações podem ser tran sferidas para um meio de cultura. Após uma dezena de dias, a suspensão celular pode ser filtrada afim de reter apenas os agregados celulares de dimensão pretendida. Esses agregados podem ser cultivados num meio de cultura isento de auxina durante al-

guns dias, afim de induzir a formação de embriões.

Os embriões zigõticos podem ser obtidos por recolha por dissecação sobre o grão no estado maduro ou ligeiramente não maduro.

Os embriões somáticos e zigõticos obtidos podem ser em seguida escrutinados em função do seu estado de desenvolvimento. Escolhem-se de preferência embriões nos primeiros estados do seu desenvolvimento, quando eles apresentam uma dimensão compreendida entre cerca de 150 e 600 jum, dado que eles são nessa altura mais resistentes à congelação. Estas dimensões correspondem às fases de desenvolvimento de coração (150-300 pm) ou de torpedo (300-600 pm) dos embriões somáticos.

Os embriões obtidos são em seguida prétratados num meio de cultura, designado como meio de prê-tratamento. Este meio pode ser um meio habitual do domínio da cultura de embriões, como por exemplo um meio de Murashige e Skoog por exemplo, ao qual se adiciona um agente de pressão osmõtica e a que se podem igualmente adicionar certas substâncias orgânicas, por exemplo a vitamina Bl, o ãcido nicotínico ou a adenina.

Ê necessário, durante o processo de con servação criogênica, evitar a formação de gelo intracelular que, mesmo se não danificar directamente os embriões durante a congelação, pode induzir uma recristalização destrutiva durante a descongelação. No presente processo, para reduzir os eventuais danos sofridos pelos embriões, eles são desidratados parcialmente graças a um prê-tratamento cora um meio contendo um agente de pressão osmõtica.

Este agente pode ser escolhido pelo especialista de entre as substâncias susceptiveis de penetrar os tecidos e assegurar uma boa pressão osmõtica afim de obter uma desidratação correcta da célula, sem influenciar a permeabilidade membranal. Este agente não deve, além disso, apresentar risco de toxicidade para os embriões. Este agente pode ser um açúcar, como por exemplo a sacarose ou a tredlose, ou qualquer outra substância conhecida que possa cumprir as mesmas funções.

A concentração em agente de pressão os5

nõtica άο meio de pré-tratamento não deve ser demasiadamente baixa afim de assegurar uma desidratação corracta da célula.

Ela também não deve ser demasiadamente elevada afim de não deteriorar os embriões ou impedir a sua retomada de crescimento após a descongelação.

Numa forma de realização preferida do presente processo de conservação, o meio de pré-tratamento contém sacarose com uma concentração compreendida entre 70 e 190 gl \ e de preferência entre 100 e 150 gl \

Verificou-se que este único pré-tratamento seguido de uma fase de congelação às temperaturas indicadas, permite atingir, de maneira simples, eficaz e segura, o objectivo pretendido.

pré-tratamento pode durar de 30 segundos até 36 horas. Este pré-tratamento não deve ser demasiadamente curto afim de permitir ao agente de pressão osmõtica desidratar parcialmente as células e aumentar a sua resistência à conjugação.

O pré-tratamento também não deve durar um tempo demasiado. Pode-se observar uma diminuição da resistên cia dos embriões ã congelação, ilustrada por uma diminuição do número de embriões ainda vivos após descongelação, quando o pré -tratamento ultrapassa 36 horas. S possível que durante um prétratamento prolongado, o embrião sofra modificações morfológicas que podiam diminuir a sua resistência à congelação, senso este facto devido a que o embrião continua a crescer e atinge então um estado menos compatível com um tratamento de congelação.

X.

Por outro lado, a diminuição da secção protectora do agente de pressão osmõtica durante permanências prolongadas no pré-tratamento poderia também explicar-se por uma habituação do embrião ao meio de pré-tratamento, o que conduziria a uma diminuição do efeito da pressão osmõtica.

O pré-tratamento pode efectuar-se de preferência â temperatura ambiente, isto é a cerca de 18-24°C e com. uma iluminação média de cerca de 150-250 lux, por exemplo.

Os embriões pré-tratados são arrefecidos e eia seguida congelados a uma temperatura compreendida entre -15°C e -40°C. Eles são congelados de preferência a uma tem peratura de cerca de -20°C.

Esta congelação pode efectuar-se transferindo os embriões com o meio de pré-tratamento em criotubos e colocando estes criotubos num congelador doméstico por exemplo.

A velocidade de arrefecimento imposta durante a congelação influencia a velocidade de aparecimento de gelo e o grau de desidratação dos embriões no momento desta tomada em gelo. Verificou-se que era preferível que a velocidade de arrefecimento, para a gama de temperaturas situada entre -6° C e -40°C, fosse moderada, da ordem de 0,l-l°C por minuto, afim de favorecer a retomada do crescimento posterior dos embriões. Para a passagem da temperatura ambiente a uma temperatura de -6°C, a velocidade de arrefecimento pode ser mais rápida, por exemplo compreendida entre 1 e 5°C por minuto.

Os embriões congelados a uma temperatura compreendida entre -15 e -40°C podem ser conservados tal e qual durante pelo menos um mês. Para durações de conservação superiores, ê preferível conservar os embriões a uma temperatura inferior, por exemplo num fluido frigorífico. Com efeito, parece que uma conservação prolongada a -15/-40°C é incompatível com a retomada de crescimento, e portanto a viabilidade ãos embriões após descongelação. Parece que a temperatura de -15/-40°C é demasiadamente elevada para assegurar uma paragem co??.pleta do metabolismo do embrião.

Se se desejar uma conservação prolongada, a congelação a -15/-40°C é de considerar como uma primeira fase que pode ser seguida por uma congelação num líquido frigorifico a uma temperatura mais baixa.

Neste caso, os embriões são de preferên cia mantidos a -15/-40°C durante algum tempo, da ordem de 18-24h, afim de a congelação ser completa.

Os embriões podem ser em seguida mergulhados directamente num fluido frigorífico, por exemplo num banho de metanol a -70°C ou num banho de azoto líquido a -196°C ou arrefecidos a uma temperatura muito baixa, por qualquer outro meio.

Os embriões congelados podem ser em seguida conservados durante longos períodos, podendo durar vários anos. Os embriões congelados podem assim ser posteriormente envolvidos em polímeros artificiais ou naturais, por exemplo do tipo alginato, afim de se obterem as sementes artificiais.

A descongelação dos embriões pode ser efectuada, por exemplo, por estabilização dos criotubos num banho-maria a 40°C durante 2 minutos. Os tubos podem ser retirados do banho-maria antes da fusão completa do gelo, afim de evitar uma elevação de temperatura demasiadamente rãpida. Após a descongelação completa, os embriões podem ser libertos do meio de pré-tratamento por lavagem simples, e em seguida os embriões lavados podem ser colocados num meio de cultura habitual no domínio da cultura de embriões, como por exemplo um meio de Iíurashige e Skoog.

Este meio pode conter um substrato carbonado assimilável, como por exemplo, sacarose com uma concentração de 1 a 10 gl por exemplo.

Este meio de cultura é notável pelo fac to de ser isento de auxinas.

Após esta retomada em cultura, os embriões retomam um desenvolvimento comparável ao dos embriões não congelados.

A sobrevida após congelação e retomada em cultura traduz-se por um crescimento bipolar dos embriões.

Há uma boa manutenção da integridade da estrutura do embrião no decurso do seu desenvolvimento posterior sem qualquer outra for ma de morfogénese como por exemplo a calogénese ou erabriogénese adventiva.

O presente processo de conservação de embriões permite assim obter por um lado a sobrevida de embri8

oes na sua integridade morfologica, e por outro lado uma boa manutenção da sua capacidade de regenerar uma plantula.

A presente invenção é ilustrada mais em pormenor nos exemplos a seguir apresentados.

Estes exemplos são precedidos por exemplos de preparação tradicional de embriões somáticos, pela descrição de um ensaio de viabilidade e pelo quadro 1 que dá a com posição de um meio de pré-tratamento e de cultura preferido.

Exemplo de preparação de embriões somáticos

Repica-se uma suspensão celular indiferenciada de células de cenouras Daucus carota L. em cada 12 dias, à razão de 1 grama de biomassa por cada 100 ml de meio, num meio de cultura líquida de LOrashige e Skoog de composição idên tica à referida no quadro 1, a qual se adicionaram 20 g. 1 de sacarose e 0,1 mg. 1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacêtico. Todas as anipulações são efectuadas em hote com fluxo laminar, em condicões assépticas. A suspensão é colocada num agitador anima do de um movimento giratório excêntrico de 100 rotações por minuto, e é cultivada a 24°C, com uma iluminação de 200 lux com um fotoperíodo de 16 horas.

Após 3 a 10 dias de cultura, a suspensão celular ê filtrada afim. de não reter senão os agregados celulares que possuam uma dimensão compreendida entre 50 e 180 pm. Estes agregados de bai xr dimensão representam um estado prõ-embrionãrio dos embriões rue prosseguirão o seu desenvolvimento até aos estados coração, to:.—'ilo e plãntula. Os agregados são lavados e colocados num meio de 'íorashige e Skooc contendo apenas ácido 2,4-diclorofeno ’ 3 xiacetico a razao de cerca de 1,5.10 agregados por ml de meio.

Após 10 dias de cultura, os embriões estão ?or:.iados. Filtra-se a suspensão de maneira a reter apenas os e? briões com uma dimensão compreendida entre 150 e 600 /im.

Ensaio de viabilidade

Foi estabelecido um ensío de viabilidade rápido e simples na sua execução, com o objectivo de avaliar a

taxa de viabilidade dos embriões após congelação.

De entre os diferentes critérios utiliza vois para apreciar a taxa de viabilidade dos embriões, retem-se principalmente:

- o aumento da dimensão dos embriões e

- o aparecimento de una coloração clorofiliana.

A apreciação destes critérios pode ser efectuada de diferentes maneiras, por exemplo por inumeração visual cu com auxílio de ensaios bioquímicos (ensaio de coloração por exemplo).

De acordo com o princípio deste ensaio, os embriões descongelados sao colocados num meio de cultura líquida. Retira-se após 10 dias de cultura, o número de embriões em que a dimensão aumentou e que apresentam sinais de coloração clorofiliana.

A relação entre este número e o número total de embriões presentes permite determinar a taxa de viabilidade dos embriões.

Os embriões podem em seguida ser colocados num meio de cultura solida com a mesma composição que o meb líruido anterior afim de prosseguirem o seu desenvolvimento pai ra o estado de plântula.

Após 10 dias de cultura neste meio sólido, determina-se a taxa de regeneração como sendo a relação entre o número de embriões çuc evoluíram para o estado de plantula e:. relação ao número total ce embriões.

Quadro 1

Composição do meio de Murashige e Skoog (pH 5,8-6)

Racroelementos mg 1

Ν1. ,_;<Ό_Ο

3

CaCl₉,2:-^0 ,7Η_σ0

Κ’τη ^K“~3 k’V'-l

370

1900

170

’-íicroe lamentos
CoCl_n	0,025
CuSO^,5E₂O	0,025
Fe5O₄,7h₇O	27,8
i?a₉ -EDTA	37,3
L ·. , ‘-í ‘i 2.	22,3
Kl	0,83
Kr,,· iOO^	0,25
Zr.S? ,7.%0	10,6

ⁿ3“^3	6,2
Outros elementos
Jciro r.icotínico	5
Tizmina (vit.B-J	5
pcanina	2

+ agente de pressão osmõtica (meio de tratamento) ou substratos carbonacos assimiláveis (meio de cultura).

Exemplo 1

Colocaram-se embriões somáticos de cenou ra, outidos da forna acima descrita, no estado de torpedo, com

uma dimensão nédia de 550 μη, en caixas de Pétri, num meio de pré-tratamento liquido de horashige e Skoog contendo 135 g.l de sacarose e isento de auxinas, a unia taxa de cerca de 100 embriões para 10 ml de meio.

Estes embriões são prê-tratados durante uma iiora, a 20°C e com uma iluminação de 200 lux.

Eles são em seguida transferidos para criotubos contendo 1,8 ml de meio de pré-tratamento. Os criotubos são colocados num congelador doméstico, onde o seu conteúdo é refrigerado a uma velocidade da ordem de l°C/min. até -6°C, e depois a uma velocidade da ordem de 0,4°C/min de -6°C a -20°C

Após 24 horas de permanência a -20°C, os crictubos são separados em dois lotes. O primeiro lote é descon gelado, mergulhando os criotubos congelados num banho-maria a 40°C, durante 2 minutos. O segundo lote ê mergulhado em azoto llauido a -196°C onde permanece durante 1 hora, antes de ser descongelado de maneira idêntica â do primeiro lote.

.Após descongelação total, os embriões são lavados para retirar o meio de pré-tratamento e colocados num meio de cultura líquida de morashige e Skoog contendo 5 g.

* de sacarose e isento de auxinas, durante 10 dias.

São em seguida transferidos para um meio de cultura sólida, com a mesma composição.

Colocam-se embriões testemunhos, que não scfrerai· nem pré-tratamentos nem congelação, nos mesmos meios de cultura.

Passados 10 dias de cultura em meio sólido, compara-se a capacidade dos embriões para regenerar plântulas de cenoura.

Entre os embriões testemunhos, 46¾ estão aptos a regenerar uma plãntula. Para os embriões congelados a -20 C e a -196°C as taxas de regeneração são de 44% e de 43%.

A capacidade dos embriões para regenerar plântulas nao Ó assim alterada pela congelação se eles tiverem tido anteriormente um pre-tratamento.

Exemplo 2

Seleccionam-se duas populações de embriões somáticos de cenoura Daucus carota L.

Uma população á constituída por embriões no estaco do coração com dimensão média de 300 um, sendo a outra população constituída por embriões no estado de torpedo com uma dimensão média de 500 um.

Retiram-se 5 amostras (A,B,C,D e testemunho) contendo cerca de 100 embriões cada uma em cada população de embriões.

ks amostras A , Β , e C dos embriões no c c c estado coração, e as amostras A, , B_ e C. de embriões no estado ^s t B t torpedo são pré-tratadas num meio de Morashige e Skoog contendo 135 g.l de sacarose, durante 1 hora, a 20°C e com uma ilumina çãc de 200 lux.

As amostras A , Β , A. , e Β , são em seO COO Ό guida refrigeradas a -20°C a uma velocidade da ordem de 0,5°C/ /min. Elas são mantidas a -20°C durante 24 horas.

As amostras A e são descongeladas, enquanto as amostras B e B, são mergulhadas em azoto líquido a -136^C onde permanecem durante 1 hora antes de serem desconge lacas.

Para comparação, as amostras C e C. são O “ directamente mergulhadas em azoto líquido a -196 C após o pré-trataranto. Elas são descongeladas apôs 1 hora.

Para comparação, as amostras D e são refrigeradas a -20°C a uma velocidade da ordem de 0,5^C/min.

se t_rem sofrido pré-tratamento. Elas são descongeladas após 24 horas.

As amostras testemunho coração e torpedo não sofrem qualquer pré-tratamento e qualquer congelação.

As diferentes amostras de embriões são em seguida recolocadas em cultura num meio líquido de Morashig e Ekoog contendo 5 g.l de sacarose.

Passados 10 de cultura, obtêm-se os resultados seguintes:

Taxa de viabilidade dos embriões (%)

Amostra

Comparação

Estado	A	B	C '	D	Testemunho
Coração	88	71	0	0	90
Torpilo	84	67	0	0	91

Nota-se que a ausência de prê-tratamento os emtriõee congelados a -20°C (D) não sobrevivem, enquanto que ura impregnação de 1 hora no meio do pré-tratamento permite a se· revida de quase todos os embriões de estado coração e torpedo congelados a -20°C (A).

Os embriões não sobrevivem a uma imersão directa em azoto líquido, mesmo após um prê-tratamento de 1 hora. (C) .

Os embriões congelados a -196°C após pré -tratamento e congelação a -20°C (3), apresentam uma taxa de viabilidade muito satisfatória.

Ê assim necessário, se se desejar conser var os embriões a -196°C, passar pelas fases de prê-tratamento e de congelação a -20°C.

Os embriões são em seguida colocados num meie de cultura sólida, com a mesma composição do meio líquido.

Passados 10 dias de cultura, a maior par te dos embriões das amostras A e E, bem como os das amostras testemunho, evoluíram para plântula apresentando por sua vez uma monta radicular e um apex cotiledonãrio clorofiliano bem diferenciados.

Estes embriões não apresentam qualquer traçc de calogénese ou de embriogénese secundária.

Exemplo 3

Os embriões somáticos de cenoura, no estado coração e no estado torpedo são pré-tratados num meio líquido de Morashige e Skoog contendo 135 g. de sacarose, a 20^uC e com uma iluminação de 200 lux, durante um período de tempo variável.

Estes embriões são em seguida refrigerados a -20°C a uma velocidade da ordem de 0,5°C/min. Passadas 24 lioras a -20°C uma parte deles é mergulhada em azoto líquido e é mantida nesse banho durante 1 hora.

Após descongelação, os embriões são colocaaos num meio de cultura líquida de Morashige e Skoog contcn do 5 g.l * de sacarose.

Os embriões testemunho que não sofreram nem pré-tratamento nem congelação são também cultivados. Regista-se, após 10 dias de cultura, a taxa de viabilidade dos embriões.

Obtêm-se os resultados seguintes: cis viabilidade dos embriões no estado de coração (%)

Duração de pré-tratamento

Os embriões testemunho tinham uma taxa de viabilidade de 90%.

Taxa de viabilidade dos embriões na fase torpedo (%)

Duração de pré-tratamento

Os embriões testemunho tinham uma taxa de viabilidade de 91%.

Nota-se que a taxa de viabilidade após 10 dias de cultura é quase idêntica para um período de prê-tratamento de 30 min., de lh ou de 24h, tanto para os embriões no estado coração como para os embriões no estado torpedo.

Pelo contrário, para além de 24 horas, a taxa de viabilidade diminui progressivamente em função do alongamento da duração de pré-tratamento.

Esta taxa é apenas de cerca de 35% após 72h de pré-tratamento. Observa-se assim uma diminuição da resistência dos embriões à congelação para pré-tratamentos prolongados .

Exemplo 4

Embriões somáticos de cenoura no estado torpedo são prê-tratados num meio liquido de Morashige e Skoog

contendo 135 g.l ¹ de sacarose, a 20°C e com uma iluminação de 200 lux durante um período variável.

Estes embriões são refrigerados e congelados a -20°C a uma velocidade da ordem de 0,5°C/min.

Passadas 72 horas -20°C, os embriões são descongelados e colocados num meio de cultura líquida de Morashige e Skoog contendo 5 g.l de sacarose.

Os embriões testemunho que não sofreram nem pré-tratamento, nem congelação sao também cultivados.

Calcula-se, após 10 dias de cultura, a taxa de viabilidade dos embriões.

Obtêm-se os resultados seguintes:

Duração do pré- -tratamento (minutos)	1	15	30	45	60 Testemunh
Taxa de viabilidade (%)	86	85	73	68	83	80

Nota-se que a taxa de viabilidade dos embriões após congelação a -20°C é boa para todos estes períodos de pré-tratamento. A tolerância à congelação dos embriões adquire-se assim muito rapidamente.

Exemplo 5

Embriões somáticos de cenoura no estado torpilo, com a dimensão média de 550 um são pré-tratados e con gelados a -20°C, sendo em seguida úma parte mergulhada em azoto líquido, de acordo com o método descrito no Exemplo 1.

Os embriões são conservados a estas tem peraturas durante um tempo variável. Eles são em seguida descongelados e colocados num meio de cultura líquida de Morashige

Determina-se a taxa de viabilidade dos embriões em função do seu período de conservação a -20°C ou

-196°C.

Os embriões testemunho que não sofreram nem pré-tratamento, nem congelação têm uma taxa de viabilidade de 72%.

Obtêm-se os resultados seguintes:

Para os embriões congelados a -20°C:

Duração de conservação	24h	1 mês	2 meses
Taxa de viabilidade
(%)	64	69	0

Para os embriões congelados a -196°C:

Duração de conservação	lh	1 mês	2 meses
Taxa de viabilidade
(%)	66	67	67

A taxa de viabilidade média após congelação a -20°C ou a -196°C ê assim de cerca de 67% para períodos de conservação de um dia ou menos.

Esta taxa permanece inalterada após um mês de conservação a -20°C ou a -196°C.

Após 2 meses de conservação, não se observa qualquer sobrevida entre os embriões conservados a -20°C enquanto que a taxa de viabilidade é sempre a mesma para os embriões conservados a -196°C.

Exemplo 6

Embriões somáticos de cenoura, no estado de torpedo, com uma dimensão média de 500 jim, são pré-tratados numa iluminação de 200 lux, a 20°C e durante 1 hora em meios líquidos de Morashige e Skoog com uma concentração em sacarose variando de 35 g. l'¹ a 205 g.l¹.

Os embriões são em seguida arrefecidos e congelados a -20°C. Passada 1 hora a -20°C, os embriões são descongelados e colocados num meio de cultura líquida de Morashige e Skoog contendo 5 g.l de sacarose.

Embriões testemunho, que não sofreram nem pré-tratamento nem congelação são também cultivados.

Determina-se a taxa de viabilidade dos embriões apôs 10 dias de cultura, em função da concentração em sacarose do meio de pré-tratamento.

Obtêm-se os resultados seguintes:

Sacarose (gl”¹)	35	68	100	135	170	205	Testemunho
Taxa de viabilidade (%)	22	41	77	82	65	14	88

A taxa de viabilidade dos embriões prétratados num meio contendo 135 g.l ¹ de sacarose é comparável à dos embriões testemunho.

Esta taxa é ainda muito elevada para uma concentração em sacarose de 100 ou 170 g.l”·*·.

A viabilidade dos embriões é alterada quando a concentração em sacarose se torna muito elevada (205 g.l 1) ou muito baixa (35g.l ^).

Claims

REIVINDICAÇÕES

- I^a Processo para a conservação de embriões vegetais, caracterizado por os embriões serem pré-tratados com um meio de pré-tratamento contendo um agente de pressão osmótica, e em seguida os embriões pré-tratados serem refrigerados e congelados a uma temperatura compreendida entre -15 e -40°C.

- 2^a Processo de acordo com a reivindicação

1, caracterizado por o agente de pressão osmótica ser a sacarose.

- 3^a Processo de acordo com a reivindicação
2, caracterizado por o meio de pré-tratamento conter sacarose a uma concentração de 75-190 gl’¹.

- 4^a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os embriões congelados a -15/-40°C serem mergulhados num fluido frigorifico.

- 5^a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o pré-tratamento ter uma duração compreendida entre 30 segundos e 36 horas.

- 6^a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a velocidade de arrefecimento entre -6°C e -40°C estar compreendida entre 0,1 e l°C/min.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o meio de pré-tratamento ser um meio de Murashige e Skoog ao qual se adiciona um agente de pressão osmótica.

- 8“ Aplicação do processo de acordo com a reivindicação 1, para a produção de plântulas, caracterizado por os embriões congelados serem descongelados e lavados para retirar o meio de pré-tratamento, e os embriões lavados serem cultivados num meio de cultura, para se desenvolverem para plântulas.

- 9^a Aplicação do processo de acordo com a reivindicação 1, para a obtenção de sementes artificiais, caracterizado por os embriões congelados serem envolvidos por polímeros artificiais ou naturais.

A requerente reivindica a prioridade do pedido francês apresentado em 23 de Maio de 1989, sob o