DE3033562C2

DE3033562C2 - Polymerisierte Zusammensetzung mit einer darin immobilisierten Zelle oder Organelle und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Info

Publication number: DE3033562C2
Application number: DE3033562A
Authority: DE
Inventors: Takashi Takasaki Gunma Fujimura; Isao Kaetsu; Fumio Fujioka Gunma Yoshii
Original assignee: Japan Atomic Energy Research Institute
Current assignee: Japan Atomic Energy Agency
Priority date: 1979-09-05
Filing date: 1980-09-05
Publication date: 1983-12-22
Also published as: DE3033562A1

Description

Erfindungsgegenstand ist die im Patentanspruch 1 angegebene polymerisierte Zusammensetzung und das im Patentanspruch 2 genannte Verfahren zur Herstellung dieser polymerisierien Zusammensetzung.

Auf medizinischem, pharmazeutischem und landwirtschaftlichem Gebiet sind in jüngerer Zeit viele Versuche unternommen worden, lebende Zellen oder deren Organellen (einzelne kleine Organe in der Zelle) aus dem Qrgap.isrnu?, zu isolieren, u-rr, rni; ihrer Hilfe physiologisch aktive Substanzen herzustellen, die Photosynthesc durchzuführen odc auch eine klinische Diagnose oder Medikation unter Nutzung der biochemischen Funktion der Zellen auszuführen. Für diese Zwecke verwendete Zellen sind z. B. Mäuseembryonenzellen. Kälbernierenzellen. Schweinenierenzellen. embryonale Nicrenzellen vom Menschen. Thyreoidzellen vom erwachsenen Menschen, menschliche Amnionzellen, Hühnerembryonenzellen. Affennierenzellen. Heia-Zellen, Nierenzellcn von neugeborenen Hamstern.

-0 menschliche Lymphozyten, Leberzellen vom erwachsenen Menschen, Bindehautzellen vom erwachsenen Menschen. Schimpansenleberzellen. Hundenicrenzellen. Hundeleberzellen. Schimpansennierenzellen, Nierenzellen vom afrikanischen Grünaffen, Kaninchennierenzellen. Rhesusaffenzellen, embryonale Lungenzellcn vom Menschen, embryonale Darmzellen vom Menschen, menschliche Cervixcarcinomzellen, Mäusesarkomzellen, Mäusefibrioblasten, Kaninchenhornhautzellen. menschliche Hautzellen. Pferdehautzelien. embryonale Tracheazellen vom Rind, Schafhinrzellen. embryonale Hautzellen vom Menschen, embryonale Muskelzellen vom Menschen, embryonale Nierenzellen vom Menschen, embryonale Hirnzellen vom Menschen, embryonale Milzzellen vom Menschen, embryonale Hypophysenzellen vom Menschen, Hypophysenzellen vom erwachsenen Menschen, embryonale Thyreoidzellen vom Menschen, Katzennierenzellen, Nierenzellen vom krabbenfressenden Affen, embryonale Nieren/eilen

vom Rind, iCatzenlungenzellen, Rhesushodenzellen, Hodenzellen vom afrikanischen Grünaffen, Hühnernierenzellen, Meerschweinchennierenzellen, Hamsterembryonenzellen, Mäuseembryonenzellen, Mäusenierenzellen, Mäusehautzellen, Rattennierenzellen, Rattenembryonenzellen, Affenherzzellen, Hamstertumorzellen, menschliche Sternalmarkzellen. menschliche Hautzellen, menschliche Lungenzellen, Ösophaguszellen von der Ziege, Büffellungenzellen, Nerzlungenzellen, Delphinnierenzellen, Zellen von Fischen, Amphibien, Vögeln, Insekten, Reptilien eta. Zellen von speziellen Human- und Tierkrankheiten, Korpuskeln (d.h. Erythrozyten, Leukozyten und Lymphozyten) und Sera vom Menschen (mit unterschiedlichen Blutgruppen), von Vieh, Hühnern, Hühnchen, Gänsen, Meerschweinchen, Pferden, Affen, Kaninchen, Mäusen, Ratten und Schafen, Spermien und Eier, Hypophysenzellen, Thyreoidzellen, Parathyreoidzellen, Nebennierenmarkzellen, Nebennierenrindenzellen, Spermazellen, Ovarzellen, Epiphysenzellen und Placentazellen vom Menschen und von Wirbeltieren, Pflanzenzellen, Algeneinzelzellen und Hefezeüeü. Organellen sind einzelne kleine Organe in der Zelle und umfassen z. B. Mitochondrien, Ribroomen, Golgi-Körper und Chloroplasten. Diese Zellen und Organellen im lebenden Gewebe stehen miteinander in Wechselwirkung und erfüllen komplexe Funktionen. Viele von ihnen sind sehr labil und werden außerhalb des Organismus schnell desaktiviert Sie halten auch einer in-vitro-Anwendung nicht stand, selbst wenn ihre morphologischen Eigenschaften dieselben wie vorher sind.

Die Organellen, die erfindungsgemäß von besonderem Interesse sind, sind Chloroplasten, und die Erfindung zielt insbesondere auf deren Verwendung ab. Chloroplasten' sind eine Art von Organellen in Pflanzenzellen, die für die Phctosynthese verantwortlich sind. Die Bedeutung von Chloroplasten hat in letzter Zeit zugenommen, da sie befähigt sind. Sonnenenergie zu nutzen und möglicherweise zur Wasserstoffherstellung. Kohlenstoffixierung und Entwicklung von Photosynthese-Solarr.sllen eingesetzt werden können. Isoliert man jedoch Chloroplasten aus dem lebenden Organismus für diese Zwecke, so verlieren sie ihre Fähigkeit zur Photosynthese; beispielsweise geht die Aktivität nach 2tägigem Stehen bei 4° C vollständig verloren. Außerdem sind die aus dem lebenden Organismus isolierten Chloroplasteii eine wäßrige Suspemion, die für die verfahrenstechnische Anwendung wenig geeignet ist. Der isolierte Chloroplast muß daher in einem Träger eingeschlossen werden, damit er einer mehrmaligen und kontinuierlichen Verwendeng in der Praxis standhält. Unter diesen Umständen scheint es notwendig. Zellen oder OrganeMen so zu modifizieren, daß sie außerhalb des lebenden Organismus stabil bleiben, und ihnen Dimensionen, Formen sowie chemische und physika'ische Eigenschaften zu verleihen, die eine in-vitro-Anwendung ermöglichen.

Die Terminologie beim »Immobilisieren« von biologisch aktiven Substanzen, wie Enzymen, Zellen und Organellen, ist noch nicht zu einer systematischen Nomenklatur geordnet. In den meisten Fällen wird jedoch der Ausdruck »Immobilisieren« als allgemeiner Begriff für drei Konzepte verstanden, nämlich das »Einschließen« (oder Einfangen), bei dem eine biologisch aktive Substanz physikalisch in einem betimmten Raum innerhalb eires Trägers eingeschlossen wird, das »Binden«, bei dem eine biologisch aktive Substanz durch kovalente Bindung. Onenbindung oder physikalische Adsorption an einen Träger gebunden wird, und die »Adhäsion«, bei der eine biologisch aktive Substanz mit der Polymerkette eines Trägers verflochten wird Der Mechanismus der »Immobilisierung« von biologisch aktiven Substanzen ist noch nicht vollständig geklärt, es wurde jedoch bestätigt, daß die Erscheinungen: »Einschließen«, »Binden« und »Adhäsion« niemals unabhängig, sondern in Kombination auftreten. Es versteht sich somit, daß der Ausdruck »Immobilisie-Ki rung« die Bedeutung von »Adhäsion« hat, wenn eine Zelle oder Organelle mit der Polymerkette eines Trägers verflochten ist, die Bedeutung von »Einschließen« hat, wenn die Zelle oder Organelle von dem Netzwerk, das durch die Polymerkette des Trägers gebildet wird, eingeschlossen ist, und die Bedeutung von »Binden« hat, wenn die Zelle oder Organelle an das Trägerpolymer gebunden ist Die strukturelle Beziehung zwischen der Zelle oder Organelle und dem Träger ist noch nicht genau geklärt Für die Zwecke der Erfindung ist eine Zelle oder Organelle »immobilisiert«, wenn sie von dem Träger eingeschlossen, damit verbunden oder verflochten ist, ohne ütre Funktion zu verringern oder ihre Struktur zu zerstörer so daß sie mit dem Träger integriert ist und kontinuierlich verwendet oder für andere Anwendungen wiedergewonnen werden kann. Es versteht sich somit daß alle Begriffe, £ie im Zusammenhang mit »Immobilisieren« verwendet werden, z. B. Fixieren, Verkapseln, Matrix-Einfangen, Mikroverkapseln, Anhaften, Implantieren, Absorbieren und kovalent Binden mit dem Begriff Immobilisieren synonym sind und von diesem umfaßt werden.

In jüngerer Zeit sind mehrere Methoden zum

Immobilisieren von biologisch aktiven Substanzen vorgeschlagen worden. So hat die Anmelderin ein Verfahren entwickelt, bei dem ein Mikroorganismus oder Enzym in einem Polymer aus glasbildenden Monomeren mit stabilem Unterkühlungsverhalten, die) bei tiefen Temperaturen durch Bestrahlen mit Licht oder ionisierender Strahlung polymerisiert werden, wirksam immobilisiert sind. Dieses Verfahren hat folgende Vorteile:

Der Mikroorganismus oder die Zelle können ohne Desaktivierung durch Wärme oder Strahlung immobilisiert werden; das erhaltene Polymer läßt sich leicht zu der gewünschten Form mit großer Oberfläche verarbeiten; und die Polymerisation verläuft schnell, so daß eine wirksame Immobilisierung erreicht wird. Wie bereits erwähnt, haben die Zellen oder Organellen jedoch eine komplexe Struktur und ergeben im lebenden Organismus komplexe Stoffwechselreaktionen. Im Vergleich zu Enzymen und Mikroorganismen sind sie so labil, daß das Verfahren für ihre Immobilisierung nicht angewandt werden kann, ohne irreversible Änderungen ihrer komplexen Struktur und eine Zerstörung ihrer Funktion in Kauf zunehmen.

Bei Untersuchungen zur Entwicklung eines Verfahrens zum Immobilisieren von Zellen oder Organellen ohne diese Nachteile wurde nun gefunden, daß eine spezielle Schutzsubsfnz notwendig ist, um die Zelle oder Organelle in ihrem Träger zu immobilisieren, ohne ihre Funktion zu zerstören oder zu beeinträchtigen. Für Zellen und Organellen speziell angepaßte Scitutzsubstanzen sind bisher dazu verwendet worden, deren Funktion aufrechtzuhalten. Ihr Hauptzweck war es jedoch, die Suspension der Zellen oder Organellen zu schützen und nicht, sie zu immobilisieren.
Die erfindungsgemäß verwendete Schutzsubstanz

schützt die Zelle oder Organdie, während ein glasbildeiides Monomer mit stabilem Unterkühlungsverhalten bei tiefen Temperaturen durch Bestrahlen mit Licht oder ionisierender Strahlung zu einem Polymer polymerisiert wird, in dem die Zelle oder Organelle immobilisiert ist. Die Substanz schützt auch die immobilisierte Zelle oder Organelle während der Lagerung des Polymers und bei ihrer Anwendung in bestimmten Reaktionen. Die Substanz muß so gewählt werden, daß sie beim Kontakt mit dem Monomer oder Polymer, beim Unterkühlen oder Bestrahlen mit Licht oder ionisierender Strahlung ihre gewünschte Funktion nicht verliert.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß eine Schutzsubstanz verwendet werden muli, die diesen Anforderungen genügt. Dem Polymer mit der darin immobilisierten Zelle oder Organelle muß eine Schutzsubstanz einverleibt werden, d.e selbst unter den erfindungsgemäß angewandter. Bedingungen ihre Funktion beibehält. In diesem Punkt unterscheidet sich die Erfindung grundlegend von herkömmlichen Methoden zur Immobilisierung von Enzymen oder Mikroorganismen und von derart immobilisierten Enzymen oder Mikroorganismen.

Die erfindungsgemäß verwendete Schutzsubstanz ist

Polyäthylenglykol, Glycerin. Glycerindiester. Glycerinmonoester, TriacetiniGlycerintriacetat). TributyriniGlycerintributyrat). Triäthylenglykol. Diäthylenglykol, Propylenglykol, Tetraäthylengiykol. Butandiol. Propandiol, Pentandiol. Hexandiol, Heptandiol, Polypropylenglykol, Methoxypolyäthylenglykol. Äthoxypolyätrylenglykol.Triäthanolamin. Dipropylenglykol. Ä thy lenglykolmonomethy läther. -äthyläther oder -n-butyläther, Tripropy lengly kol, Rinderserumalbumin, D-Mannit. Gelatine, Agar. L-Ascorbinsäure. Sorbit. Glucose. Fructose. Galactose. Mannose. Arabinose. Xylose. Raffinose. Stachyose. Dextrin. Inosit. Xylit, Erythrit. Eieralbumin. L-Glutaminsäure. D-Glutaminsäure. Glutarsäure. LGIutamin, L-Asparaginsäure. DL-Apfelsäure, DL-Thioäpfelsäure. !\-Ketoglut.irs£ure. L-Cysteinsäure. L-Glutaminsäure-rt-bcnzylester. N-Acetyl-L-glutaminsäure.
DL^-Pyrrolidon-S-carbonsäure. Glycylglycin. Acetylglycin. LArginin. Benzoyl-L-arginin. Benzoy 1-L-argininä thy !ester. Nitro-L-arginin. L-Homoarginin. L-Alginsäure
(a-Hydroxy-^-jiuanido-N-valeriansäure). L-Canavanin, L-Lysin. L-Histidin. Guanidoessigsäure. DL-Threonin. L-Threonin. DL-Allothreonsn. L-Serin, L-Allothreonin. D-Glucosamin, D-Gluconsäure, Methyl-D-glycosid. Saccharose. Lactose. (5-Aminobuttersäure und L-Prolin.

Bei Abkühlen auf niedrige Temperatur zeigen die im Rahmen der Erfindung verwendeten glasbildenden Monomere stabiles Unterkühlungsverhalten, d.h. sie kristallisieren nicht, sondern bilden eine stabile unterkühlte Substanz, wobei die Viskosität schnell zunimmt und beim Erreichen der Glasübergangstemperatur Werte von bis zu 10^}cP erreichen kann, so daß der Zustand als glasig oder amorph bezeichnet werden kann. Diese Eigenschaften der glasbildenden Monomere haben verschiedene Vorteile, von denen die folgenden drei für die Immobilisierung von Zellen und Organellen von Bedeutung sind:

1) Da die Monomere bei niedriger Temperatur durch Bestrahlen mit kleinen Dosen polymerisiert werden, können die Zellen und Organellen ohne größere Schädigung oder Desaktivierung durch Wärme oder Strahlung immobilisiert werden;

2) die unterkühlten Monomere stellen ein homogenes ίο Dispersionsmedium dar, das als Flüssigkeit bezeichnet werden kann, so daß die Zellen und Organelien leicht darin eingeschlossen werden können. Außerdem haben die Monomere eine ähnliche Viskosität wie eine Flüssigkeit, so daß die

ι i darin immobilisierten Zellen oder Organellen selbst

nach längerer Verwendungsdauer nicht voneinander getrennt sind:

3) das unterkühlte Monomer läßt sich durch Gießen

Form bringen und kann als solche polymerisiert werden. Da das Monomer hochviskos ist und schnell polymerisiert werden kann, läßt sich z. B. ein Polymerfilm mit darin immobilisierten Zellen oder Organellen auf der Innenwand eines kleinen

Ji Kunststoffrohres ausbilden, ohne daß Verstopfungen oder Verlaufprobleme auftreten. Auch Polymerkapseln oder Feinteilchen können ausgebildet Aerdcn, ohne daß es zu einer Koaleszenz oder Kohiision dor Einzelteilchen kommt.

Glasbildende Monomere mit stabilem Unterkühlungsverhalten sind daher für die Polymerisation bei tiefen Temperaturen am besten geeignet. Hochviskose Monomere im unterkühlten Zustand können nur durch Einwirken von Licht oder ionisierender Strahlung wirksam polymerisiert werden, und auch Zellen oder Organellen, die bei Normaltemperatur sehr instabil sind, müssen durch schnelle Polymerisation bei niedrigen Temperaturen immobilisiert werden. Die genannten

•»ο Monomere sind daher ideale Trägermaterialien zum Immobilisieren von Zellen oder Organellen.

Erfindungsgemäß wird eine Dispersion der Zelle oder Organelle, des glasbildenden Monomers oder eines entsprechenden Prepolymers und der Schutzsubs'anz auf niedrige Temperatur abgekühlt, gegebenenfalls in die gewünschte Dimension und Form gebracht und bei niedrigen Temperaturen mit Licht oder ionisierender Strahlung bestrahlt, um das Monomer zu einer Zusammensetzung zu polymerisieren, in der die Zelle

so oder Organelle immobilisiert ist. Dabei kann die Zelle oder Organelle in Wasser gelöst oder in Wasser oder einem geeigneten Lösungsmittel dispergiert werden, bevor man sie mit dem Monomer vermischt. Alternativ kann man auch direkt mit dem Monomer vermischen.

Zweckmäßig verwendet man die Zelle oder Organelle als Suspension in einem Puffer (pH 7 bis 8) der Saccharose. Tris-hydroxymethyl-aminomethan und Natriumchlorid enthält. Das Abkühlen des Gemisches aus der Zelle oder Organelle und dem glasbildenden Monomer hat den Zweck, die Viskosität des Monomers zu erhöhen und dadurch die Dispersion zu stabilisieren. Das Gemisch kann in die gewünschte Form gebracht werden, z. B. zu einer Folie gegossen, durch Eintropfen in ein geeignetes organisches Lösungsmittel, in dem das Gemisch unlöslich ist z. B. Hexanol, zu Feinteilchen verarbeitet oder auf die Oberfläche eines Filmträgers oder die Innenwand eines Rohres aus Polyäthylen oder Polyvinylchlorid aufgetragen werden. Wegen der hohen

Viskosität des Monomers kommt es zu keinem Laufen der gegossenen Folie oder des Monomeriiberzugs und auch bei den Feinteilchen tritt keine Koaleszenz oder Kohäsion auf. Beim Bestrahlen mit Licht oder ionisierender Strahlung polymerisiert das Monomer schnell zu einer festen Form, in der die Zelle oder Organelle immobilisiert ist. ohne den Dispersionszustand, den sie in dem Monomer hatte, zu stören.

Die S,- lutzsubstanz kann der wäßrigen Lösung oder Suspension der Zelle oder Organelle in der Form, in der sie mit dem glasbildenden Monomer vermischt wird, oder aber auch dem Gemisch aus dem gla.'Oildenden Monomer und der Zelle oder Organelle unmittelbar vor der Polymerisation zugesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren wird bei einer Temperatur von 0⁰C oder weniger (bis -I96°C), zweckmäßig -20 bis -10O⁰C. durchgeführt. Als Quellen für Licht und ionisierende Strahlung eignen sich z. B. sichtbare UV-Strahlen aus Nieder- oder Hochdruck-Quecksilberdsrripi'aiMperi. Sonnenlicht. Licht. Röntgenstrahlen. Gamma-Strahlen, Beta-Strahlen, Elektronenstrahlen und «-Strahlen, Mischstrahlung aus chemischen Reaktoren und y-Strahlen aus verbrauchten Brennelementen oder Spaltprodukten. Die Strahlungsdosis sollte auf einem Minimum gehalten werden, um eine Desaktivierung der immobilisierten Zellen oder Organellen zu vermeiden. Um jedoch das gesamte Monomer zu härten, muß die Gesamtstrahlendosis mindestens I χ 10⁵ R betragen. Das Monomer muß daher mit ionisierender Strahlung in einer Dosis von IxIO⁴ bis 1x10* R/h bestrahlt werden, um eine Gesamtdosis von 1 χ ICHt :s5x IO⁶ R.zweckmäßig 1 χ Ι0>bis I χ 10<> R,zu ergeben.

Das polymerisierbare glasbildende Monomer wird in einer Menge von 5 bis 60 Gewichtsprozent, die Zelle oder Organelle in einer Menge von 10 bis 60 Gewichtsprozent, die Schutzsubstanz in einer Menge von 1 bis 10 Gewichtsprozent und der Puffer in einer Menge von 10 bis 60 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gesamtgewicht des erhaltenen Gemisches, verwendet.

Das polymerisierbare glasbildende Monomer wird ausgewählt aus mindestens einem Monomer der folgenden Gruppe (A), das bei niedriger Temperatur nicht kristallisiert, sondern eine stabile, unterkühlte Substanz bildet, oder aus Monomeren der folgenden Gruppe (B), die selbst keine Unterkühlungseigenschaften zeigen, sondern beim Vermischen mit Monomeren der Gruppe (A) in einer Menge von 5 bis 30% ein Monomergemisch mit Unterkühlungseigenschaften ergeben.

Gruppe (A):

Hydroxyäthylmethacrylat. Hydroxyäthylacrylat, Hydroxypropylmethacrylat, Hydroxypropylacrylat Hydroxybutylmethacrylat, Hydroxybutylacrylat, Hydroxypentylmethacrylat, Hydroxypentylacrylau Hydroxyhexylmethacrylat Hydroxyhexyiacrylat Hydroxyheptylmethacrylat Hydroxyheptylacrylat Glycidylmethacrylat, Glycidylacrylat, Diäthylenglykoldimethacrylat(-djacrylat), Tetraäthylenglykoldimethacrylat(-diacrylat),

Polyäthylenglykoldimethacrylat(-diacrylat), Äthylenglykoldimethacrylat(-diacrylat), Propylenglykoldimethacrylat(-diacryiat), Dipropylenglykoldimethacrylat(-diacrylat), Polypropylenglykoidimethacrylat(-diacrylat), Buiylenglykoldimethacrylat(-diacrylat), Pentandioldimethacrylat(-diacrylat), Hexandioldimethacrylat(-diacrylat), Heptandioldimethacrylat(-diacrylat), Neopentylglykoldimethacrylatf-diacrylat), Trimethyloläthantrimethacrylatf-triacrylat), Trimethylolpropantrimethacrylati-triacrylat), Glycerinmonomethacrylati-monoacrylat), Glycerindimethacrylat(-diacrylat), Glycerintrimethacrylati-triacrylat). Diäthylaminoäthylmethacrylat(-acrylat), Diäthylaminobutylmethacrylat (-acrylat), Dimethylaminoäthylmethacrylat (-acrylat), Dimethylaminobutylmethacrylat (-acrylat), Benzylrneshacrylat,

MethoxypolySthylenglykolmcthacrylat (-acrylat). Äthoxypolyäthylenglykolmethacrylat (-acrylat), M ethoxypropylenglykolmethacrylat (-acrylat) und

Ä thoxypropylenglykolmethacrylat (-acrylat) etc. Gruppe (B):

Vinylacetat, Vinylpropionat, Vinylbutyrat, Methylmethacrylat, Methylacrylat, Äthylmethacrylat, Äthylacrylat, Propylmethacrylat, Propylacrylat, Butylmethacrylat, Butylacrylat, Pcntyltnethacrylat, Pentylacrylat, Hexylmethacrylat, Hexylacrylat, Laurylmethacrylat. Laurylacrylat. Stearylmethacrylat, Stearylacrylat, Styrol, Vinyltoluol. sulfoniertes Styrol, Acrylsäure. Methacrylsäure, Aminostyrol. Vinylpyrrolidon, Acrylamid, Methacrylamid, Methylenbisacrylamid. Methylolacrylamid. Acrylnitril. Methacrylnitril, Diallylphthalat, Itaconsäure, Maleinsäure. Diallylphthalat, Diallylsuccinat, Diallylitaconat, Divinylbenzol und Triallylcyanurat etc.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

In den Beispielen wird die Aktivität der immobilisierten Organellen folgendermaßen bestimmt: 10 bis 200 μΙ einer Zelle oder Organelle (suspendiert in einem Puffer), die in einer 1-ml-Absorptionszelle immobilisiert ist, werden mit 50 bis 20 mg einer frischen Zelle oder Organelle, die der immobilisierten entspricht, 0,2 Mol rotem Kaliumprussiat und 0,1 Mol Ammoniumchlorid versetzt, worauf man das Gemisch 3 Minuten Licht aus einem Projektor aussetzt und die Menge des gelüsten Sauerstoffes, der in der Absorptionszelle entsteht, mit einer Sauerstoffelektrode bestimmt. In den Beispielen beziehen sich alle Prozente auf das Gewicht, sofern nichts anderes angegeben ist

Beispiel 1 Immobilisierung von Leberzellen

Leberzellen vom erwachsenen Menschen (10* lebende Zellen/ml) werden in Eagle-Medium gezüchtet, das 10% Kälberserum enthält 5 ml der Kolonie werden mit einem Gemisch aus 5 ml Polyäthylengrykol und einer geringen Menge D-Mannit versetzt Hierauf gibt man ml einer Hank-Lösung zu, die 1 ml Methoxypojyäthylenglykolmethacryiat enthält Das erhaltene Gemisch

wird allmählich auf - 7S°C abgekühlt und 5 Stunden mit y-Strahlen von Kobalt 60 in einer Dosis von IxIO⁵ R/h bestrahlt. Das feste polymerisierte Produkt wird langsam auf 4°C erwärmt und bei dieser Temperatur gelagert, um den Effekt der Immobilisierung der Leberzellen zu prüfen. Die immobilisierten Zellen behalten selbst nach 30tägiger Lagerung ihre Funktion. Lagert man dagegen eine Lösung, die nicht modifizierte (nicht immobükierte) Leberzellen enthält, 250 Stunden bei4°C, so verlieren die Zellen ihre Funktion.

Nach dem vorstehenden Verfahren wird aus denselben Materialien ein festes polymerisiertes Produkt mit darin immobilisierten Leberzellen hergestellt, jedoch verwendet man die 5 ml Polyäthylenglykol nicht. Nach lOtägiger Lagerung bei 4°C haben fast alle immobilisierten Leberzellen ihre Aktivität verloren.

Beispiel 2

■ K'l* " , P it, ,»

Immobilisiert man Erythrozyten bei diesen Temperaturen, so erfolgt eine Hämolyse. da das enthaltene Wasser zu Eis gefriert und die Zellmembranen des Blutes sprengt. Vermischt man dagegen die Erythrozyten allmählich mit einer gleichen Menge eines Gemisches aus Polyäthylenglykol (unter Kühlen der Substanz mit relativ hoher Viskosität bei Raumtemperatur) und 5 bis 20% Natriumchlorid. Kaliumchlorid und Zuckern, so erhält man eine Mischung, die beim Abkühlen keine Hämolyse zeigt. Dieses Gemisch wird mit 10% 2-Hydroxyäthylacrylat versetzt und nach dem Abkühlen auf -24°C mit einer Rate von 2°C/min mit 1 χ 10^b R y-Strahlen von Kobalt 60 bestrahlt. Hierbei entsteht ein festes Produkt mit darin immobilisierten Erythrozyten, das sofort auf Raumtemperatur gebracht wird. Nach dem Entfernen von nicht umgesetztem Monomer durch mehrmaliges Waschen mit Hanks-Lö-

Süng WiMj u35 r rOuUKt uci 4°\_ in ι länKS-L-OSUHg

aufbewahrt. Die Erythrozyten in dem Produkt behalten ihre Aktivität (bestimmt als Fähigkeit zur Sauerstoffabsorption) mehr als 20 Tage und die Aktivität nimmt auch bei mehrmaliger Verwendung nicht ab. Eine nicht modifizierte Kontrollprobe verliert die Fähigkeit zur Satierstoffabsorption nach 2 oder 3 Tagen. Die immobilisierten Erythrozyten haben somit eine längere Lebens/.eit als die nicht modifizierten.

Beispiel 3
Immobilisierung von Karottenkailus

5 g Karottenkailus werden in 5 ml einer wäßrigen Lösung suspendiert, die 2.5 ml Diäthylenglykol und 30% Methoxypolyäthylenglykolmethacrylat enthält. Die Dispersion wird allmählich auf — 50⁰C abgekühlt und bei dieser Temperatur mit 6 χ ΙΟ⁵ R y-Strahlen von Kobalt 60 bestrahlt. Das feste polymerisierte Produkt wird eine bestimmte Zeit bei 4°C gelagert. Eine mehr als 12 Monate aufbewahrte Probe des Produktes wächst in einem Kulturmedium. Dagegen verliert nicht modifizierter Karottenkailus nach 1 monatiger Lagerung bei 4° C seine Reproduktionsfähigkeit.

Beispiel 4

Mikrosomenkörnchen werden aus Rattenleberzellen mit einer Zentrifuge abgetrennt. Die Körnchen werden mit einer geringen Menge Rinderserdrnalbumin und D-Mannit versetzt, worauf man die Mikrosomen mit der gleichen Menge Hanks-Lösung vermischt, die 20% 2-Hydroxypropylmethacrylat enthält. Das erhaltene Gemisch wird allmählich auf -78°C abgekühlt und bei dieser Temperatur 10 Stunden mit 5 χ ΙΟ⁴ R/h y-Strahlen von Cäsium 137 bestrahlt. Das feste polymerisierte Produkt wird langsam auf 4°C erwärmt und bei dieser Temperatur gelagert, um den Effekt der Immobilisierung zu prüfen. Die immobilisierten Mikrosomen behalten ihre Aktivität mehr als 30 Tage bei. Bewahrt man sie bei Raumtemperatur auf, so bleiben sie

to mindestens I Woche aktiv. Dagegen verliert eine Suspension von nicht modifizierten Mikrosomen ihre Aktivität bereits nach 15 Stunden bei 4°C bzw. nur 4 Stunden bei Raumtemperatur.

Ein fesies polymerisiertes Produkt mit darin immobilisierten Mikrosomen wird auf dieselbe Weise aus denselben Materialien hergestellt, jedoch verwendet man weder D-Mannit noch das genannte Albumin. Die Mirkosomen haben nach I Stunde ihre Aktivität vollständig verloren.

Beispiel 5

I g eines ribosomenhaltigen Niederschlages wird in einer Zentrifuge (10 500OxG) von Froschnierenzellen abgetrennt. Der Niederschlag wird mit 2 m! Hanks-Lösung versetzt, die eine geringe Menge D-Munnit enthält, worauf man 0.5 ml Poiyäthylenglykoldiacrylat zugibt und gründlich vermischt. Das Gemisch wird allmählich auf —78°C abgekühlt und bei dieser Temperatur mit I χ IO^b R Elektronenstrahlen aus einem Resonanztransformatorbeschleuniger bestrahlt. Das feste polymerisierte Produkt wird bei 4° C bzw. Raumtemperatur gelagert, um den Effekt der Immobilisierung zu prüfen. Nach 50 Tagen bei 4° C bzw. 14 Tagen bei Raumtemperatur behält es seine Aktivität bei. Dagegen

J5 verlieren nicht modifizierte Ribosomen nach 24 Stunden bei 4 C bzw. 6 Stunden bei Raumtemperatur ihre Akmiiiit.

Lm iCSiCS pOiVrnCriSiCrtCS t TOuUrCi Πϋΐ uiifin iiTiiTiöui-

lisierten Ribosomen wird auf dieselbe Weise aus denselben Materialien hergestellt, jedoch verwendet man keinen D-Mannit. Die immobilisierten Ribosomen verlieren nach I Stunde ihre Aktivität.

Beispiel 6

5 g Karottenkailus werden in 10 ml einer wäßrigen Lösung dispergiert. die 2 g D-Mannit enthält, worauf man 2 ml Hydroxyäthylacrylat zumischt. Das Gemisch wird auf —30°C abgeschreckt und bei dieser Temperatur 120 Stunden mit Licht aus einer Hochdruckquecksilberdampflampe bestrahlt. Das feste polymerisierte Produkt wird mehr als 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert, wobei der immobilisierte Kallus seine Aktivität beibehält und in einem herkömmlichen Agarmedium gezüchtet werden kann. Bewahrt man dagegen einen nicht modifizierten Karottenkailus bei Raumtemperatur auf, so verliert er seine Aktivität nach 20 Tagen und kann nicht einfach gezüchtet werden.

Beispiel 7

Ein als herkömmlicher Fmmobilisierungsträger zugesetztes Monomer führt zu einer Hämolyse von Erythrozyten durch Sprengen der Zellmembran. Versetzt man jedoch 2,5 ml Erythrozyten bei Raumtemperatur langsam mit einem Gemisch aus 1.25 g L-Ascorbinsäure und 1,25 ml Hanks-Lösung und gibt dann zu der Lösung 0,5 rnl fviethoxypolyäihyleng-iykolrneihacrylat, so erfolgt keine Hämolyse. Die Mischung wird mit einer Rate von 2°G'min auf -24°C abgekühlt und bei

Il

dieser Temperatu- mit I χ IO^b R y-Strahlen bestrahlt. Das fest:: polymerisierte Produkt mit darin immobilisierten Erythrozyten wird auf Raumtemperatur gebracht und nach dem Entfernen von nicht umgesetztem (.'onomer durch mehrmaliges Auswaschen mit Hanks-Lösung bei 4" C in Hanks-Lösung aufbewahrt. Die Erythrozyten in dem Produkt behalten ihre Aktivität (bestimmt als Fähigkeit zur Sauerstoffabsorption) mehr als 20 Tage, und die Aktivität nimmt auch bei mehrmaliger Verwendung nicht ab. Eine nicht modifizierte Kontrollprobe verliert ihre Fähigkeit zur Sauerstoffabsorption nach 2 oder 3 Tagen.

Beispiel 8

Zu einem STN-Puffer. der 0.4 Mol Saccharose. 0.01 Mol Tris-hydroxymethylaminomethan und 0,01 Mol Natriumchlorid enthält, werden 1,0 ml aus Spinat isolierte Chloroplasten und 0,4 ml der folgenden drei .Schutzmittel gegeben: STN-Puffer. der 10% Rinderserumalbumin enthält. STN-Puffer. der 0,1% D-Mannit enthält bzw. STN-Puffer, der ö,6°/b Natrium-L-Äscorbai enthält, jede der drei Zusammensetzungen wird mit 0,24 ml Λ-Hydroxyäthylacrylat versetzt, worauf man sie

bei -24°C mit 1 χ 10« R y-Strahlen von Kobalt 60 bestrahlt. Das feste polymerisierte Produkt wird gründlich mit STN-Puffer gewaschen und in kleine Stücke zerbrochen, die bei 4⁰C in einem Puffer aufbewahrt werden, der 2,5% Rinderserumalbumin und 0,01% D-Mannit enthält. Die Lebensdauer der in dem Polymer immobilisierten Chloroplasten ist viel langer als die von nicht modifizierten, aus Spinat isolierten Chloroplasten, die nach 4 Tagen ihre Aktivität verlieren. Der Vergleich der Aktivitäten von immobilisierten (Kurve B) bzw. nicht modifizierten (Kurve A) Chloroplasten ist in F i g. 1 gezeigt.

Beispiel 9

Chloroplasten werden gemäß Beispiel 8 immobilisiert, jedoch verwendet man Mcthoxypolyä'thylenglykoliiicthacryliit anstelle von Λ-Hydroxyälhylacrylai. Der Vergleich der Aktivitäten der immobilisierten (Kurve B) bzw. nicht modifizierten (Kurve A) Chloroplasten nach der Aufbewahrung bei 4°C ist in F i g. 2 gezeigt. Daraus Lsi ersichtlich, daß sich die Lebensdauer der Chlorcpla sten durch die erfindungsgemäße Immobilisierung verlängern läß\.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Polymerisierte Zusammensetzung mit einer darin immobilisierten Zelle oder Organnelle, erhältlich durch Vermischen einer Zelle oder Organelle mit einem polymerisierbaren Monomer, Abkühlen des Gemisches auf eine Temperatur von 0⁰C oder weniger und Bestrahlen des gekühlten Gemisches mit Licht oder ionisierender Strahlung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vermischung der Zelle oder Organelle mit einem polymerisierbaren Monomer in Gegenwart von

Polyäthylenglykol, Glycerin, Glycerindiester, Glycerinmonoester.Glycerintriacetat. Glycerintributyrat.Triäthylenglykol, Diäthylenglykol, Propylenglykol, Tetraäthylenglykol, Butandiol, Propandiol, Pentandiol, Hexandiol. Hfptandiol, Polypropylenglykol,
Methcysypolyäthylenglykol.
ÄthoxypolyäthylenglykolTriäthanolamin. Dipropylenglykol,

Äthylenglykolmonomethyläther, -äihyläther oder-n-butyläther.Tripropylenglykol. Rinderserumalbumin. D-Mannit, Gelatine. Agar. L-Ascorbinsäure. Sorbit. Glucose, Fructose. Galactose. Mannose, Arabinose. Xylose. Raffinose.Stachyose. Dextrin. Inosit. Xylit. Erythrit. Eialbumin. L-Glutaminsäure. D-Glutaminsäure.Glutarsäure. L-Glutamin. L-Asparaginsäure. DL-Äpfelsäure. DL-Tbioäpfelsätk e. a-K_L .oglutarsäure. L-Cysteinsäure

L-Glutaminsäure-ix-benzyi, ter. N-Acctyl-L-glutaminsäure,
DL-2-PyΓrolidon-5-carbonsäure. Glycylglycin. Acetylglycin, L-Arginin. Bcnzoyl-L-arginin. Benzoy!-L-argininäthylester, Nitro-L-arginin. L-Homoarginin, L-Alginsäure (ix-Hydroxy-<5-guanido-N-valeriansäure), L-Canavanin. I -Lysin. L-Histidin, Guanidoessigsäure. DL-Threonin, L-Threonin. DL-Allothreonin. L-Serin, L-Allothreonin. D-Glucosamin, D-Gluconsäure, Methyl-D-glycosid, Saccharose, Lactose, (5-Aminobuttersäureoder L-Prolin vornimmt.

2. Verfahren zur Herstellung einer polymerisierten Zusammensetzung mit einer darin immobilisierten Zelle oder Organelle gemäß Anspruch I. wobei man eine Zelle oder Organelle mit einem polymerisierbaren Monomer vermischt, das Gemisch auf eine Temperatur von 0⁰C oder weniger kühlt und das gekühlte Gemisch mit Licht oder ionisierender Strahlung bestrahlt, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vermischung der Zelle oder Organelle mit einem polymerisierbaren Monomer in Gegenwart von

Polyäthylenglykol, Glycerin, Glycerindiester. Glycerinmonoester. Glycerintriacetat. Glycerin tributyrat.Triäthylenglykol. Diäthylenglykol, Propylenglykol, Tetraäthylenglykol, Butandiol. Propandiol. Pentandiol. Hexandiol. Heptandiol. Polypropylenglykol,
M ethoxy polyäthylenglykol,
Äthoxypolyiilhylenglykol. Triethanolamin.

Dipropylenglykol,

Äthylenglykolmonomethyläther.-äthyläther
oder -n-butyläther.Tripropylenglykol,
Rinderserumalbumin, D-Mannit, Gelatine,
Agar, L-Ascorbinsäure, Sorbit, Glucose,
Fructose, Galactose, Mannose, Arabinose,
Xylose, Raffinose, Stachyose, Dextrin, Inosit,
Xylit, Erythrit, Eialbumin, L-Glutaminsäure,
D-Glutaminsäure, Glutarsäure, L-Glutt min,
L-Asparaginsäure, DL-Äpfelsäure,
DL-Thioäpfelsäure.a-Ketoglutarsäure,
L-Cysteinsäure,

L-Glutaminsäure-a-benzylester,
N-Acetyl-L-glutaminsäure,
DL-2-Pyrrolidon-5-carbonsäure. Glycylglycin.
Acetylglycin, L-Arginin, Benzoyl-L-arginin,
Benzoyl-L-argininäthylester, Nitro-L-arginin,
L-Homoarginin, L-AIginsäure
(<x-Hydroxy-<5-guanido-N-valeriansäure).
L-Canavanin, L-Lysin, L-Histidin,
Guanidoessigsäure, DL-Threonin, L-Threonin,
DL-Allothreonin, L-Serin, L-Allothreonin,
D-GIucosamin, D-Gluconsäure,
Methyl-D-glycosid. Saccharose, Lactose.
(5-Aminobuttersäure oder L-Prolin

vornimmt.