DE3033562C2 - Polymerisierte Zusammensetzung mit einer darin immobilisierten Zelle oder Organelle und Verfahren zu ihrer Herstellung. - Google Patents
Polymerisierte Zusammensetzung mit einer darin immobilisierten Zelle oder Organelle und Verfahren zu ihrer Herstellung.Info
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Description
Erfindungsgegenstand ist die im Patentanspruch 1 angegebene polymerisierte Zusammensetzung und das
im Patentanspruch 2 genannte Verfahren zur Herstellung dieser polymerisierien Zusammensetzung.
Auf medizinischem, pharmazeutischem und landwirtschaftlichem
Gebiet sind in jüngerer Zeit viele Versuche unternommen worden, lebende Zellen oder deren
Organellen (einzelne kleine Organe in der Zelle) aus dem Qrgap.isrnu?, zu isolieren, u-rr, rni; ihrer Hilfe
physiologisch aktive Substanzen herzustellen, die Photosynthesc durchzuführen odc auch eine klinische
Diagnose oder Medikation unter Nutzung der biochemischen Funktion der Zellen auszuführen. Für diese
Zwecke verwendete Zellen sind z. B. Mäuseembryonenzellen. Kälbernierenzellen. Schweinenierenzellen. embryonale
Nicrenzellen vom Menschen. Thyreoidzellen vom erwachsenen Menschen, menschliche Amnionzellen,
Hühnerembryonenzellen. Affennierenzellen. Heia-Zellen, Nierenzellcn von neugeborenen Hamstern.
-0 menschliche Lymphozyten, Leberzellen vom erwachsenen Menschen, Bindehautzellen vom erwachsenen
Menschen. Schimpansenleberzellen. Hundenicrenzellen. Hundeleberzellen. Schimpansennierenzellen, Nierenzellen
vom afrikanischen Grünaffen, Kaninchennierenzellen. Rhesusaffenzellen, embryonale Lungenzellcn vom
Menschen, embryonale Darmzellen vom Menschen, menschliche Cervixcarcinomzellen, Mäusesarkomzellen,
Mäusefibrioblasten, Kaninchenhornhautzellen. menschliche Hautzellen. Pferdehautzelien. embryonale
Tracheazellen vom Rind, Schafhinrzellen. embryonale Hautzellen vom Menschen, embryonale Muskelzellen
vom Menschen, embryonale Nierenzellen vom Menschen, embryonale Hirnzellen vom Menschen, embryonale
Milzzellen vom Menschen, embryonale Hypophysenzellen vom Menschen, Hypophysenzellen vom
erwachsenen Menschen, embryonale Thyreoidzellen vom Menschen, Katzennierenzellen, Nierenzellen vom
krabbenfressenden Affen, embryonale Nieren/eilen
vom Rind, iCatzenlungenzellen, Rhesushodenzellen,
Hodenzellen vom afrikanischen Grünaffen, Hühnernierenzellen, Meerschweinchennierenzellen, Hamsterembryonenzellen,
Mäuseembryonenzellen, Mäusenierenzellen, Mäusehautzellen, Rattennierenzellen, Rattenembryonenzellen,
Affenherzzellen, Hamstertumorzellen, menschliche Sternalmarkzellen. menschliche Hautzellen,
menschliche Lungenzellen, Ösophaguszellen von der Ziege, Büffellungenzellen, Nerzlungenzellen, Delphinnierenzellen,
Zellen von Fischen, Amphibien, Vögeln, Insekten, Reptilien eta. Zellen von speziellen
Human- und Tierkrankheiten, Korpuskeln (d.h. Erythrozyten, Leukozyten und Lymphozyten) und Sera
vom Menschen (mit unterschiedlichen Blutgruppen), von Vieh, Hühnern, Hühnchen, Gänsen, Meerschweinchen,
Pferden, Affen, Kaninchen, Mäusen, Ratten und Schafen, Spermien und Eier, Hypophysenzellen, Thyreoidzellen,
Parathyreoidzellen, Nebennierenmarkzellen, Nebennierenrindenzellen, Spermazellen, Ovarzellen,
Epiphysenzellen und Placentazellen vom Menschen und von Wirbeltieren, Pflanzenzellen, Algeneinzelzellen und
Hefezeüeü. Organellen sind einzelne kleine Organe in
der Zelle und umfassen z. B. Mitochondrien, Ribroomen,
Golgi-Körper und Chloroplasten. Diese Zellen und
Organellen im lebenden Gewebe stehen miteinander in Wechselwirkung und erfüllen komplexe Funktionen.
Viele von ihnen sind sehr labil und werden außerhalb des Organismus schnell desaktiviert Sie halten auch
einer in-vitro-Anwendung nicht stand, selbst wenn ihre morphologischen Eigenschaften dieselben wie vorher
sind.
Die Organellen, die erfindungsgemäß von besonderem Interesse sind, sind Chloroplasten, und die
Erfindung zielt insbesondere auf deren Verwendung ab. Chloroplasten' sind eine Art von Organellen in
Pflanzenzellen, die für die Phctosynthese verantwortlich sind. Die Bedeutung von Chloroplasten hat in letzter
Zeit zugenommen, da sie befähigt sind. Sonnenenergie zu nutzen und möglicherweise zur Wasserstoffherstellung.
Kohlenstoffixierung und Entwicklung von Photosynthese-Solarr.sllen
eingesetzt werden können. Isoliert man jedoch Chloroplasten aus dem lebenden Organismus
für diese Zwecke, so verlieren sie ihre Fähigkeit zur Photosynthese; beispielsweise geht die Aktivität nach
2tägigem Stehen bei 4° C vollständig verloren. Außerdem sind die aus dem lebenden Organismus isolierten
Chloroplasteii eine wäßrige Suspemion, die für die verfahrenstechnische Anwendung wenig geeignet ist.
Der isolierte Chloroplast muß daher in einem Träger eingeschlossen werden, damit er einer mehrmaligen und
kontinuierlichen Verwendeng in der Praxis standhält. Unter diesen Umständen scheint es notwendig. Zellen
oder OrganeMen so zu modifizieren, daß sie außerhalb
des lebenden Organismus stabil bleiben, und ihnen Dimensionen, Formen sowie chemische und physika'ische
Eigenschaften zu verleihen, die eine in-vitro-Anwendung ermöglichen.
Die Terminologie beim »Immobilisieren« von biologisch aktiven Substanzen, wie Enzymen, Zellen und
Organellen, ist noch nicht zu einer systematischen Nomenklatur geordnet. In den meisten Fällen wird
jedoch der Ausdruck »Immobilisieren« als allgemeiner Begriff für drei Konzepte verstanden, nämlich das
»Einschließen« (oder Einfangen), bei dem eine biologisch aktive Substanz physikalisch in einem betimmten
Raum innerhalb eires Trägers eingeschlossen wird, das
»Binden«, bei dem eine biologisch aktive Substanz durch kovalente Bindung. Onenbindung oder physikalische
Adsorption an einen Träger gebunden wird, und die »Adhäsion«, bei der eine biologisch aktive Substanz
mit der Polymerkette eines Trägers verflochten wird Der Mechanismus der »Immobilisierung« von biologisch
aktiven Substanzen ist noch nicht vollständig geklärt, es wurde jedoch bestätigt, daß die Erscheinungen:
»Einschließen«, »Binden« und »Adhäsion« niemals unabhängig, sondern in Kombination auftreten. Es
versteht sich somit, daß der Ausdruck »Immobilisie-Ki
rung« die Bedeutung von »Adhäsion« hat, wenn eine Zelle oder Organelle mit der Polymerkette eines
Trägers verflochten ist, die Bedeutung von »Einschließen« hat, wenn die Zelle oder Organelle von dem
Netzwerk, das durch die Polymerkette des Trägers gebildet wird, eingeschlossen ist, und die Bedeutung von
»Binden« hat, wenn die Zelle oder Organelle an das Trägerpolymer gebunden ist Die strukturelle Beziehung
zwischen der Zelle oder Organelle und dem Träger ist noch nicht genau geklärt Für die Zwecke der
Erfindung ist eine Zelle oder Organelle »immobilisiert«, wenn sie von dem Träger eingeschlossen, damit
verbunden oder verflochten ist, ohne ütre Funktion zu
verringern oder ihre Struktur zu zerstörer so daß sie mit dem Träger integriert ist und kontinuierlich
verwendet oder für andere Anwendungen wiedergewonnen werden kann. Es versteht sich somit daß alle
Begriffe, £ie im Zusammenhang mit »Immobilisieren« verwendet werden, z. B. Fixieren, Verkapseln, Matrix-Einfangen,
Mikroverkapseln, Anhaften, Implantieren, Absorbieren und kovalent Binden mit dem Begriff
Immobilisieren synonym sind und von diesem umfaßt werden.
In jüngerer Zeit sind mehrere Methoden zum
Immobilisieren von biologisch aktiven Substanzen vorgeschlagen worden. So hat die Anmelderin ein
Verfahren entwickelt, bei dem ein Mikroorganismus oder Enzym in einem Polymer aus glasbildenden
Monomeren mit stabilem Unterkühlungsverhalten, die) bei tiefen Temperaturen durch Bestrahlen mit Licht
oder ionisierender Strahlung polymerisiert werden, wirksam immobilisiert sind. Dieses Verfahren hat
folgende Vorteile:
Der Mikroorganismus oder die Zelle können ohne Desaktivierung durch Wärme oder Strahlung immobilisiert
werden; das erhaltene Polymer läßt sich leicht zu der gewünschten Form mit großer Oberfläche verarbeiten;
und die Polymerisation verläuft schnell, so daß eine wirksame Immobilisierung erreicht wird. Wie bereits
erwähnt, haben die Zellen oder Organellen jedoch eine komplexe Struktur und ergeben im lebenden Organismus
komplexe Stoffwechselreaktionen. Im Vergleich zu Enzymen und Mikroorganismen sind sie so labil, daß das
Verfahren für ihre Immobilisierung nicht angewandt werden kann, ohne irreversible Änderungen ihrer
komplexen Struktur und eine Zerstörung ihrer Funktion in Kauf zunehmen.
Bei Untersuchungen zur Entwicklung eines Verfahrens zum Immobilisieren von Zellen oder Organellen
ohne diese Nachteile wurde nun gefunden, daß eine spezielle Schutzsubsfnz notwendig ist, um die Zelle
oder Organelle in ihrem Träger zu immobilisieren, ohne ihre Funktion zu zerstören oder zu beeinträchtigen. Für
Zellen und Organellen speziell angepaßte Scitutzsubstanzen sind bisher dazu verwendet worden, deren
Funktion aufrechtzuhalten. Ihr Hauptzweck war es jedoch, die Suspension der Zellen oder Organellen zu
schützen und nicht, sie zu immobilisieren.
Die erfindungsgemäß verwendete Schutzsubstanz
Die erfindungsgemäß verwendete Schutzsubstanz
schützt die Zelle oder Organdie, während ein
glasbildeiides Monomer mit stabilem Unterkühlungsverhalten
bei tiefen Temperaturen durch Bestrahlen mit Licht oder ionisierender Strahlung zu einem Polymer
polymerisiert wird, in dem die Zelle oder Organelle immobilisiert ist. Die Substanz schützt auch die
immobilisierte Zelle oder Organelle während der Lagerung des Polymers und bei ihrer Anwendung in
bestimmten Reaktionen. Die Substanz muß so gewählt werden, daß sie beim Kontakt mit dem Monomer oder
Polymer, beim Unterkühlen oder Bestrahlen mit Licht oder ionisierender Strahlung ihre gewünschte Funktion
nicht verliert.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß eine Schutzsubstanz verwendet werden muli, die diesen
Anforderungen genügt. Dem Polymer mit der darin immobilisierten Zelle oder Organelle muß eine Schutzsubstanz
einverleibt werden, d.e selbst unter den erfindungsgemäß angewandter. Bedingungen ihre
Funktion beibehält. In diesem Punkt unterscheidet sich die Erfindung grundlegend von herkömmlichen Methoden
zur Immobilisierung von Enzymen oder Mikroorganismen und von derart immobilisierten Enzymen oder
Mikroorganismen.
Die erfindungsgemäß verwendete Schutzsubstanz ist
Polyäthylenglykol, Glycerin. Glycerindiester.
Glycerinmonoester, TriacetiniGlycerintriacetat). TributyriniGlycerintributyrat). Triäthylenglykol.
Diäthylenglykol, Propylenglykol, Tetraäthylengiykol. Butandiol. Propandiol,
Pentandiol. Hexandiol, Heptandiol, Polypropylenglykol, Methoxypolyäthylenglykol.
Äthoxypolyätrylenglykol.Triäthanolamin.
Dipropylenglykol. Ä thy lenglykolmonomethy läther. -äthyläther oder -n-butyläther, Tripropy lengly kol,
Rinderserumalbumin, D-Mannit. Gelatine, Agar. L-Ascorbinsäure. Sorbit. Glucose. Fructose.
Galactose. Mannose. Arabinose. Xylose. Raffinose. Stachyose. Dextrin. Inosit. Xylit, Erythrit.
Eieralbumin. L-Glutaminsäure. D-Glutaminsäure.
Glutarsäure. LGIutamin, L-Asparaginsäure. DL-Apfelsäure, DL-Thioäpfelsäure.
!\-Ketoglut.irs£ure. L-Cysteinsäure.
L-Glutaminsäure-rt-bcnzylester. N-Acetyl-L-glutaminsäure.
DL^-Pyrrolidon-S-carbonsäure. Glycylglycin. Acetylglycin. LArginin. Benzoyl-L-arginin. Benzoy 1-L-argininä thy !ester. Nitro-L-arginin. L-Homoarginin. L-Alginsäure
(a-Hydroxy-^-jiuanido-N-valeriansäure). L-Canavanin, L-Lysin. L-Histidin. Guanidoessigsäure. DL-Threonin. L-Threonin. DL-Allothreonsn. L-Serin, L-Allothreonin. D-Glucosamin, D-Gluconsäure, Methyl-D-glycosid. Saccharose. Lactose. (5-Aminobuttersäure und L-Prolin.
DL^-Pyrrolidon-S-carbonsäure. Glycylglycin. Acetylglycin. LArginin. Benzoyl-L-arginin. Benzoy 1-L-argininä thy !ester. Nitro-L-arginin. L-Homoarginin. L-Alginsäure
(a-Hydroxy-^-jiuanido-N-valeriansäure). L-Canavanin, L-Lysin. L-Histidin. Guanidoessigsäure. DL-Threonin. L-Threonin. DL-Allothreonsn. L-Serin, L-Allothreonin. D-Glucosamin, D-Gluconsäure, Methyl-D-glycosid. Saccharose. Lactose. (5-Aminobuttersäure und L-Prolin.
Bei Abkühlen auf niedrige Temperatur zeigen die im Rahmen der Erfindung verwendeten glasbildenden
Monomere stabiles Unterkühlungsverhalten, d.h. sie kristallisieren nicht, sondern bilden eine stabile unterkühlte
Substanz, wobei die Viskosität schnell zunimmt und beim Erreichen der Glasübergangstemperatur
Werte von bis zu 10}cP erreichen kann, so daß der
Zustand als glasig oder amorph bezeichnet werden kann. Diese Eigenschaften der glasbildenden Monomere
haben verschiedene Vorteile, von denen die folgenden drei für die Immobilisierung von Zellen und
Organellen von Bedeutung sind:
1) Da die Monomere bei niedriger Temperatur durch Bestrahlen mit kleinen Dosen polymerisiert werden,
können die Zellen und Organellen ohne größere Schädigung oder Desaktivierung durch
Wärme oder Strahlung immobilisiert werden;
2) die unterkühlten Monomere stellen ein homogenes ίο Dispersionsmedium dar, das als Flüssigkeit bezeichnet
werden kann, so daß die Zellen und Organelien leicht darin eingeschlossen werden
können. Außerdem haben die Monomere eine ähnliche Viskosität wie eine Flüssigkeit, so daß die
ι i darin immobilisierten Zellen oder Organellen selbst
nach längerer Verwendungsdauer nicht voneinander getrennt sind:
3) das unterkühlte Monomer läßt sich durch Gießen
Form bringen und kann als solche polymerisiert werden. Da das Monomer hochviskos ist und
schnell polymerisiert werden kann, läßt sich z. B. ein Polymerfilm mit darin immobilisierten Zellen
oder Organellen auf der Innenwand eines kleinen
Ji Kunststoffrohres ausbilden, ohne daß Verstopfungen
oder Verlaufprobleme auftreten. Auch Polymerkapseln oder Feinteilchen können ausgebildet
Aerdcn, ohne daß es zu einer Koaleszenz oder Kohiision dor Einzelteilchen kommt.
Glasbildende Monomere mit stabilem Unterkühlungsverhalten sind daher für die Polymerisation bei
tiefen Temperaturen am besten geeignet. Hochviskose Monomere im unterkühlten Zustand können nur durch
Einwirken von Licht oder ionisierender Strahlung wirksam polymerisiert werden, und auch Zellen oder
Organellen, die bei Normaltemperatur sehr instabil sind,
müssen durch schnelle Polymerisation bei niedrigen Temperaturen immobilisiert werden. Die genannten
•»ο Monomere sind daher ideale Trägermaterialien zum
Immobilisieren von Zellen oder Organellen.
Erfindungsgemäß wird eine Dispersion der Zelle oder Organelle, des glasbildenden Monomers oder eines
entsprechenden Prepolymers und der Schutzsubs'anz auf niedrige Temperatur abgekühlt, gegebenenfalls in
die gewünschte Dimension und Form gebracht und bei niedrigen Temperaturen mit Licht oder ionisierender
Strahlung bestrahlt, um das Monomer zu einer Zusammensetzung zu polymerisieren, in der die Zelle
so oder Organelle immobilisiert ist. Dabei kann die Zelle
oder Organelle in Wasser gelöst oder in Wasser oder einem geeigneten Lösungsmittel dispergiert werden,
bevor man sie mit dem Monomer vermischt. Alternativ kann man auch direkt mit dem Monomer vermischen.
Zweckmäßig verwendet man die Zelle oder Organelle als Suspension in einem Puffer (pH 7 bis 8) der
Saccharose. Tris-hydroxymethyl-aminomethan und Natriumchlorid
enthält. Das Abkühlen des Gemisches aus der Zelle oder Organelle und dem glasbildenden
Monomer hat den Zweck, die Viskosität des Monomers zu erhöhen und dadurch die Dispersion zu stabilisieren.
Das Gemisch kann in die gewünschte Form gebracht werden, z. B. zu einer Folie gegossen, durch Eintropfen
in ein geeignetes organisches Lösungsmittel, in dem das Gemisch unlöslich ist z. B. Hexanol, zu Feinteilchen
verarbeitet oder auf die Oberfläche eines Filmträgers oder die Innenwand eines Rohres aus Polyäthylen oder
Polyvinylchlorid aufgetragen werden. Wegen der hohen
Viskosität des Monomers kommt es zu keinem Laufen der gegossenen Folie oder des Monomeriiberzugs und
auch bei den Feinteilchen tritt keine Koaleszenz oder Kohäsion auf. Beim Bestrahlen mit Licht oder
ionisierender Strahlung polymerisiert das Monomer schnell zu einer festen Form, in der die Zelle oder
Organelle immobilisiert ist. ohne den Dispersionszustand, den sie in dem Monomer hatte, zu stören.
Die S,- lutzsubstanz kann der wäßrigen Lösung oder Suspension der Zelle oder Organelle in der Form, in der
sie mit dem glasbildenden Monomer vermischt wird, oder aber auch dem Gemisch aus dem gla.'Oildenden
Monomer und der Zelle oder Organelle unmittelbar vor der Polymerisation zugesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren wird bei einer Temperatur von 00C
oder weniger (bis -I96°C), zweckmäßig -20 bis
-10O0C. durchgeführt. Als Quellen für Licht und ionisierende Strahlung eignen sich z. B. sichtbare
UV-Strahlen aus Nieder- oder Hochdruck-Quecksilberdsrripi'aiMperi. Sonnenlicht. Licht. Röntgenstrahlen.
Gamma-Strahlen, Beta-Strahlen, Elektronenstrahlen und «-Strahlen, Mischstrahlung aus chemischen Reaktoren und y-Strahlen aus verbrauchten Brennelementen
oder Spaltprodukten. Die Strahlungsdosis sollte auf einem Minimum gehalten werden, um eine Desaktivierung der immobilisierten Zellen oder Organellen zu
vermeiden. Um jedoch das gesamte Monomer zu härten, muß die Gesamtstrahlendosis mindestens
I χ 105 R betragen. Das Monomer muß daher mit ionisierender Strahlung in einer Dosis von IxIO4 bis
1x10* R/h bestrahlt werden, um eine Gesamtdosis von
1 χ ICHt :s5x IO6 R.zweckmäßig 1 χ Ι0>bis I χ 10<>
R,zu ergeben.
Das polymerisierbare glasbildende Monomer wird in einer Menge von 5 bis 60 Gewichtsprozent, die Zelle
oder Organelle in einer Menge von 10 bis 60 Gewichtsprozent, die Schutzsubstanz in einer Menge
von 1 bis 10 Gewichtsprozent und der Puffer in einer Menge von 10 bis 60 Gewichtsprozent, bezogen auf das
Gesamtgewicht des erhaltenen Gemisches, verwendet.
Das polymerisierbare glasbildende Monomer wird ausgewählt aus mindestens einem Monomer der
folgenden Gruppe (A), das bei niedriger Temperatur nicht kristallisiert, sondern eine stabile, unterkühlte
Substanz bildet, oder aus Monomeren der folgenden Gruppe (B), die selbst keine Unterkühlungseigenschaften zeigen, sondern beim Vermischen mit Monomeren
der Gruppe (A) in einer Menge von 5 bis 30% ein Monomergemisch mit Unterkühlungseigenschaften ergeben.
Gruppe (A):
Polyäthylenglykoldimethacrylat(-diacrylat),
Äthylenglykoldimethacrylat(-diacrylat),
Propylenglykoldimethacrylat(-diacryiat),
Dipropylenglykoldimethacrylat(-diacrylat),
Polypropylenglykoidimethacrylat(-diacrylat),
Buiylenglykoldimethacrylat(-diacrylat),
Pentandioldimethacrylat(-diacrylat),
Hexandioldimethacrylat(-diacrylat),
Heptandioldimethacrylat(-diacrylat),
Neopentylglykoldimethacrylatf-diacrylat),
Trimethyloläthantrimethacrylatf-triacrylat),
Trimethylolpropantrimethacrylati-triacrylat),
Glycerinmonomethacrylati-monoacrylat),
Glycerindimethacrylat(-diacrylat),
Glycerintrimethacrylati-triacrylat).
Diäthylaminoäthylmethacrylat(-acrylat),
Diäthylaminobutylmethacrylat (-acrylat),
Dimethylaminoäthylmethacrylat (-acrylat),
Dimethylaminobutylmethacrylat (-acrylat),
Benzylrneshacrylat,
MethoxypolySthylenglykolmcthacrylat (-acrylat).
Äthoxypolyäthylenglykolmethacrylat (-acrylat),
M ethoxypropylenglykolmethacrylat (-acrylat)
und
Ä thoxypropylenglykolmethacrylat (-acrylat)
etc.
Gruppe (B):
Vinylacetat, Vinylpropionat, Vinylbutyrat,
Methylmethacrylat, Methylacrylat,
Äthylmethacrylat, Äthylacrylat, Propylmethacrylat, Propylacrylat, Butylmethacrylat, Butylacrylat,
Pcntyltnethacrylat, Pentylacrylat,
Hexylmethacrylat, Hexylacrylat,
Laurylmethacrylat. Laurylacrylat.
Stearylmethacrylat, Stearylacrylat, Styrol,
Vinyltoluol. sulfoniertes Styrol, Acrylsäure.
Methacrylsäure, Aminostyrol. Vinylpyrrolidon,
Acrylamid, Methacrylamid, Methylenbisacrylamid.
Methylolacrylamid. Acrylnitril. Methacrylnitril,
Diallylphthalat, Itaconsäure, Maleinsäure.
Diallylphthalat, Diallylsuccinat, Diallylitaconat,
Divinylbenzol und Triallylcyanurat etc.
In den Beispielen wird die Aktivität der immobilisierten Organellen folgendermaßen bestimmt: 10 bis 200 μΙ
einer Zelle oder Organelle (suspendiert in einem Puffer), die in einer 1-ml-Absorptionszelle immobilisiert ist,
werden mit 50 bis 20 mg einer frischen Zelle oder Organelle, die der immobilisierten entspricht, 0,2 Mol
rotem Kaliumprussiat und 0,1 Mol Ammoniumchlorid versetzt, worauf man das Gemisch 3 Minuten Licht aus
einem Projektor aussetzt und die Menge des gelüsten Sauerstoffes, der in der Absorptionszelle entsteht, mit
einer Sauerstoffelektrode bestimmt. In den Beispielen beziehen sich alle Prozente auf das Gewicht, sofern
nichts anderes angegeben ist
Beispiel 1
Immobilisierung von Leberzellen
Leberzellen vom erwachsenen Menschen (10* lebende Zellen/ml) werden in Eagle-Medium gezüchtet, das
10% Kälberserum enthält 5 ml der Kolonie werden mit
einem Gemisch aus 5 ml Polyäthylengrykol und einer geringen Menge D-Mannit versetzt Hierauf gibt man
ml einer Hank-Lösung zu, die 1 ml Methoxypojyäthylenglykolmethacryiat enthält Das erhaltene Gemisch
wird allmählich auf - 7S°C abgekühlt und 5 Stunden mit
y-Strahlen von Kobalt 60 in einer Dosis von IxIO5 R/h
bestrahlt. Das feste polymerisierte Produkt wird langsam auf 4°C erwärmt und bei dieser Temperatur
gelagert, um den Effekt der Immobilisierung der Leberzellen zu prüfen. Die immobilisierten Zellen
behalten selbst nach 30tägiger Lagerung ihre Funktion. Lagert man dagegen eine Lösung, die nicht modifizierte
(nicht immobükierte) Leberzellen enthält, 250 Stunden
bei4°C, so verlieren die Zellen ihre Funktion.
Nach dem vorstehenden Verfahren wird aus denselben Materialien ein festes polymerisiertes Produkt mit
darin immobilisierten Leberzellen hergestellt, jedoch verwendet man die 5 ml Polyäthylenglykol nicht. Nach
lOtägiger Lagerung bei 4°C haben fast alle immobilisierten Leberzellen ihre Aktivität verloren.
■ K'l* " , P it, ,»
Immobilisiert man Erythrozyten bei diesen Temperaturen, so erfolgt eine Hämolyse. da das enthaltene
Wasser zu Eis gefriert und die Zellmembranen des Blutes sprengt. Vermischt man dagegen die Erythrozyten
allmählich mit einer gleichen Menge eines Gemisches aus Polyäthylenglykol (unter Kühlen der
Substanz mit relativ hoher Viskosität bei Raumtemperatur) und 5 bis 20% Natriumchlorid. Kaliumchlorid und
Zuckern, so erhält man eine Mischung, die beim Abkühlen keine Hämolyse zeigt. Dieses Gemisch wird
mit 10% 2-Hydroxyäthylacrylat versetzt und nach dem Abkühlen auf -24°C mit einer Rate von 2°C/min mit
1 χ 10b R y-Strahlen von Kobalt 60 bestrahlt. Hierbei
entsteht ein festes Produkt mit darin immobilisierten Erythrozyten, das sofort auf Raumtemperatur gebracht
wird. Nach dem Entfernen von nicht umgesetztem Monomer durch mehrmaliges Waschen mit Hanks-Lö-
aufbewahrt. Die Erythrozyten in dem Produkt behalten ihre Aktivität (bestimmt als Fähigkeit zur Sauerstoffabsorption)
mehr als 20 Tage und die Aktivität nimmt auch bei mehrmaliger Verwendung nicht ab. Eine nicht
modifizierte Kontrollprobe verliert die Fähigkeit zur Satierstoffabsorption nach 2 oder 3 Tagen. Die
immobilisierten Erythrozyten haben somit eine längere Lebens/.eit als die nicht modifizierten.
Beispiel 3
Immobilisierung von Karottenkailus
Immobilisierung von Karottenkailus
5 g Karottenkailus werden in 5 ml einer wäßrigen Lösung suspendiert, die 2.5 ml Diäthylenglykol und 30%
Methoxypolyäthylenglykolmethacrylat enthält. Die Dispersion wird allmählich auf — 500C abgekühlt und bei
dieser Temperatur mit 6 χ ΙΟ5 R y-Strahlen von Kobalt
60 bestrahlt. Das feste polymerisierte Produkt wird eine bestimmte Zeit bei 4°C gelagert. Eine mehr als 12
Monate aufbewahrte Probe des Produktes wächst in einem Kulturmedium. Dagegen verliert nicht modifizierter
Karottenkailus nach 1 monatiger Lagerung bei 4° C seine Reproduktionsfähigkeit.
Mikrosomenkörnchen werden aus Rattenleberzellen mit einer Zentrifuge abgetrennt. Die Körnchen werden
mit einer geringen Menge Rinderserdrnalbumin und
D-Mannit versetzt, worauf man die Mikrosomen mit der
gleichen Menge Hanks-Lösung vermischt, die 20% 2-Hydroxypropylmethacrylat enthält. Das erhaltene
Gemisch wird allmählich auf -78°C abgekühlt und bei dieser Temperatur 10 Stunden mit 5 χ ΙΟ4 R/h y-Strahlen
von Cäsium 137 bestrahlt. Das feste polymerisierte Produkt wird langsam auf 4°C erwärmt und bei dieser
Temperatur gelagert, um den Effekt der Immobilisierung zu prüfen. Die immobilisierten Mikrosomen
behalten ihre Aktivität mehr als 30 Tage bei. Bewahrt man sie bei Raumtemperatur auf, so bleiben sie
to mindestens I Woche aktiv. Dagegen verliert eine Suspension von nicht modifizierten Mikrosomen ihre
Aktivität bereits nach 15 Stunden bei 4°C bzw. nur 4 Stunden bei Raumtemperatur.
Ein fesies polymerisiertes Produkt mit darin immobilisierten Mikrosomen wird auf dieselbe Weise aus
denselben Materialien hergestellt, jedoch verwendet man weder D-Mannit noch das genannte Albumin. Die
Mirkosomen haben nach I Stunde ihre Aktivität vollständig verloren.
I g eines ribosomenhaltigen Niederschlages wird in einer Zentrifuge (10 500OxG) von Froschnierenzellen
abgetrennt. Der Niederschlag wird mit 2 m! Hanks-Lösung
versetzt, die eine geringe Menge D-Munnit enthält,
worauf man 0.5 ml Poiyäthylenglykoldiacrylat zugibt und gründlich vermischt. Das Gemisch wird allmählich
auf —78°C abgekühlt und bei dieser Temperatur mit I χ IOb R Elektronenstrahlen aus einem Resonanztransformatorbeschleuniger
bestrahlt. Das feste polymerisierte Produkt wird bei 4° C bzw. Raumtemperatur gelagert, um den Effekt der Immobilisierung zu prüfen.
Nach 50 Tagen bei 4° C bzw. 14 Tagen bei Raumtemperatur behält es seine Aktivität bei. Dagegen
J5 verlieren nicht modifizierte Ribosomen nach 24 Stunden
bei 4 C bzw. 6 Stunden bei Raumtemperatur ihre Akmiiiit.
lisierten Ribosomen wird auf dieselbe Weise aus denselben Materialien hergestellt, jedoch verwendet
man keinen D-Mannit. Die immobilisierten Ribosomen verlieren nach I Stunde ihre Aktivität.
5 g Karottenkailus werden in 10 ml einer wäßrigen Lösung dispergiert. die 2 g D-Mannit enthält, worauf
man 2 ml Hydroxyäthylacrylat zumischt. Das Gemisch wird auf —30°C abgeschreckt und bei dieser Temperatur
120 Stunden mit Licht aus einer Hochdruckquecksilberdampflampe
bestrahlt. Das feste polymerisierte Produkt wird mehr als 6 Monate bei Raumtemperatur
gelagert, wobei der immobilisierte Kallus seine Aktivität beibehält und in einem herkömmlichen Agarmedium
gezüchtet werden kann. Bewahrt man dagegen einen nicht modifizierten Karottenkailus bei Raumtemperatur
auf, so verliert er seine Aktivität nach 20 Tagen und kann nicht einfach gezüchtet werden.
Ein als herkömmlicher Fmmobilisierungsträger zugesetztes
Monomer führt zu einer Hämolyse von Erythrozyten durch Sprengen der Zellmembran. Versetzt
man jedoch 2,5 ml Erythrozyten bei Raumtemperatur langsam mit einem Gemisch aus 1.25 g L-Ascorbinsäure
und 1,25 ml Hanks-Lösung und gibt dann zu der Lösung 0,5 rnl fviethoxypolyäihyleng-iykolrneihacrylat,
so erfolgt keine Hämolyse. Die Mischung wird mit einer Rate von 2°G'min auf -24°C abgekühlt und bei
Il
dieser Temperatu- mit I χ IOb R y-Strahlen bestrahlt.
Das fest:: polymerisierte Produkt mit darin immobilisierten Erythrozyten wird auf Raumtemperatur gebracht
und nach dem Entfernen von nicht umgesetztem (.'onomer durch mehrmaliges Auswaschen mit Hanks-Lösung
bei 4" C in Hanks-Lösung aufbewahrt. Die Erythrozyten in dem Produkt behalten ihre Aktivität
(bestimmt als Fähigkeit zur Sauerstoffabsorption) mehr als 20 Tage, und die Aktivität nimmt auch bei
mehrmaliger Verwendung nicht ab. Eine nicht modifizierte Kontrollprobe verliert ihre Fähigkeit zur
Sauerstoffabsorption nach 2 oder 3 Tagen.
Zu einem STN-Puffer. der 0.4 Mol Saccharose. 0.01 Mol Tris-hydroxymethylaminomethan und 0,01 Mol
Natriumchlorid enthält, werden 1,0 ml aus Spinat isolierte Chloroplasten und 0,4 ml der folgenden drei
.Schutzmittel gegeben: STN-Puffer. der 10% Rinderserumalbumin
enthält. STN-Puffer. der 0,1% D-Mannit enthält bzw. STN-Puffer, der ö,6°/b Natrium-L-Äscorbai
enthält, jede der drei Zusammensetzungen wird mit 0,24 ml Λ-Hydroxyäthylacrylat versetzt, worauf man sie
bei -24°C mit 1 χ 10« R y-Strahlen von Kobalt 60
bestrahlt. Das feste polymerisierte Produkt wird gründlich mit STN-Puffer gewaschen und in kleine
Stücke zerbrochen, die bei 40C in einem Puffer aufbewahrt werden, der 2,5% Rinderserumalbumin und
0,01% D-Mannit enthält. Die Lebensdauer der in dem Polymer immobilisierten Chloroplasten ist viel langer
als die von nicht modifizierten, aus Spinat isolierten Chloroplasten, die nach 4 Tagen ihre Aktivität verlieren.
Der Vergleich der Aktivitäten von immobilisierten (Kurve B) bzw. nicht modifizierten (Kurve A) Chloroplasten
ist in F i g. 1 gezeigt.
Chloroplasten werden gemäß Beispiel 8 immobilisiert,
jedoch verwendet man Mcthoxypolyä'thylenglykoliiicthacryliit
anstelle von Λ-Hydroxyälhylacrylai. Der
Vergleich der Aktivitäten der immobilisierten (Kurve B) bzw. nicht modifizierten (Kurve A) Chloroplasten nach
der Aufbewahrung bei 4°C ist in F i g. 2 gezeigt. Daraus Lsi ersichtlich, daß sich die Lebensdauer der Chlorcpla
sten durch die erfindungsgemäße Immobilisierung verlängern läß\.
Claims (2)
1. Polymerisierte Zusammensetzung mit einer darin immobilisierten Zelle oder Organnelle, erhältlich
durch Vermischen einer Zelle oder Organelle mit einem polymerisierbaren Monomer, Abkühlen
des Gemisches auf eine Temperatur von 00C oder
weniger und Bestrahlen des gekühlten Gemisches mit Licht oder ionisierender Strahlung, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Vermischung der Zelle oder Organelle mit einem polymerisierbaren
Monomer in Gegenwart von
Polyäthylenglykol, Glycerin, Glycerindiester,
Glycerinmonoester.Glycerintriacetat. Glycerintributyrat.Triäthylenglykol,
Diäthylenglykol, Propylenglykol, Tetraäthylenglykol, Butandiol, Propandiol, Pentandiol, Hexandiol. Hfptandiol,
Polypropylenglykol,
Methcysypolyäthylenglykol.
ÄthoxypolyäthylenglykolTriäthanolamin. Dipropylenglykol,
Methcysypolyäthylenglykol.
ÄthoxypolyäthylenglykolTriäthanolamin. Dipropylenglykol,
Äthylenglykolmonomethyläther, -äihyläther
oder-n-butyläther.Tripropylenglykol.
Rinderserumalbumin. D-Mannit, Gelatine.
Agar. L-Ascorbinsäure. Sorbit. Glucose, Fructose. Galactose. Mannose, Arabinose.
Xylose. Raffinose.Stachyose. Dextrin. Inosit.
Xylit. Erythrit. Eialbumin. L-Glutaminsäure. D-Glutaminsäure.Glutarsäure. L-Glutamin.
L-Asparaginsäure. DL-Äpfelsäure. DL-Tbioäpfelsätk e. a-KL .oglutarsäure.
L-Cysteinsäure
L-Glutaminsäure-ix-benzyi, ter.
N-Acctyl-L-glutaminsäure,
DL-2-PyΓrolidon-5-carbonsäure. Glycylglycin. Acetylglycin, L-Arginin. Bcnzoyl-L-arginin. Benzoy!-L-argininäthylester, Nitro-L-arginin. L-Homoarginin, L-Alginsäure (ix-Hydroxy-<5-guanido-N-valeriansäure), L-Canavanin. I -Lysin. L-Histidin, Guanidoessigsäure. DL-Threonin, L-Threonin. DL-Allothreonin. L-Serin, L-Allothreonin. D-Glucosamin, D-Gluconsäure, Methyl-D-glycosid, Saccharose, Lactose, (5-Aminobuttersäureoder L-Prolin vornimmt.
DL-2-PyΓrolidon-5-carbonsäure. Glycylglycin. Acetylglycin, L-Arginin. Bcnzoyl-L-arginin. Benzoy!-L-argininäthylester, Nitro-L-arginin. L-Homoarginin, L-Alginsäure (ix-Hydroxy-<5-guanido-N-valeriansäure), L-Canavanin. I -Lysin. L-Histidin, Guanidoessigsäure. DL-Threonin, L-Threonin. DL-Allothreonin. L-Serin, L-Allothreonin. D-Glucosamin, D-Gluconsäure, Methyl-D-glycosid, Saccharose, Lactose, (5-Aminobuttersäureoder L-Prolin vornimmt.
2. Verfahren zur Herstellung einer polymerisierten Zusammensetzung mit einer darin immobilisierten
Zelle oder Organelle gemäß Anspruch I. wobei man eine Zelle oder Organelle mit einem polymerisierbaren
Monomer vermischt, das Gemisch auf eine Temperatur von 00C oder weniger kühlt und das
gekühlte Gemisch mit Licht oder ionisierender Strahlung bestrahlt, dadurch gekennzeichnet, daß
man die Vermischung der Zelle oder Organelle mit einem polymerisierbaren Monomer in Gegenwart
von
Polyäthylenglykol, Glycerin, Glycerindiester. Glycerinmonoester. Glycerintriacetat.
Glycerin tributyrat.Triäthylenglykol. Diäthylenglykol, Propylenglykol,
Tetraäthylenglykol, Butandiol. Propandiol. Pentandiol. Hexandiol. Heptandiol. Polypropylenglykol,
M ethoxy polyäthylenglykol,
Äthoxypolyiilhylenglykol. Triethanolamin.
M ethoxy polyäthylenglykol,
Äthoxypolyiilhylenglykol. Triethanolamin.
Dipropylenglykol,
Äthylenglykolmonomethyläther.-äthyläther
oder -n-butyläther.Tripropylenglykol,
Rinderserumalbumin, D-Mannit, Gelatine,
Agar, L-Ascorbinsäure, Sorbit, Glucose,
Fructose, Galactose, Mannose, Arabinose,
Xylose, Raffinose, Stachyose, Dextrin, Inosit,
Xylit, Erythrit, Eialbumin, L-Glutaminsäure,
D-Glutaminsäure, Glutarsäure, L-Glutt min,
L-Asparaginsäure, DL-Äpfelsäure,
DL-Thioäpfelsäure.a-Ketoglutarsäure,
L-Cysteinsäure,
oder -n-butyläther.Tripropylenglykol,
Rinderserumalbumin, D-Mannit, Gelatine,
Agar, L-Ascorbinsäure, Sorbit, Glucose,
Fructose, Galactose, Mannose, Arabinose,
Xylose, Raffinose, Stachyose, Dextrin, Inosit,
Xylit, Erythrit, Eialbumin, L-Glutaminsäure,
D-Glutaminsäure, Glutarsäure, L-Glutt min,
L-Asparaginsäure, DL-Äpfelsäure,
DL-Thioäpfelsäure.a-Ketoglutarsäure,
L-Cysteinsäure,
L-Glutaminsäure-a-benzylester,
N-Acetyl-L-glutaminsäure,
DL-2-Pyrrolidon-5-carbonsäure. Glycylglycin.
Acetylglycin, L-Arginin, Benzoyl-L-arginin,
Benzoyl-L-argininäthylester, Nitro-L-arginin,
L-Homoarginin, L-AIginsäure
(<x-Hydroxy-<5-guanido-N-valeriansäure).
L-Canavanin, L-Lysin, L-Histidin,
Guanidoessigsäure, DL-Threonin, L-Threonin,
DL-Allothreonin, L-Serin, L-Allothreonin,
D-GIucosamin, D-Gluconsäure,
Methyl-D-glycosid. Saccharose, Lactose.
(5-Aminobuttersäure oder L-Prolin
N-Acetyl-L-glutaminsäure,
DL-2-Pyrrolidon-5-carbonsäure. Glycylglycin.
Acetylglycin, L-Arginin, Benzoyl-L-arginin,
Benzoyl-L-argininäthylester, Nitro-L-arginin,
L-Homoarginin, L-AIginsäure
(<x-Hydroxy-<5-guanido-N-valeriansäure).
L-Canavanin, L-Lysin, L-Histidin,
Guanidoessigsäure, DL-Threonin, L-Threonin,
DL-Allothreonin, L-Serin, L-Allothreonin,
D-GIucosamin, D-Gluconsäure,
Methyl-D-glycosid. Saccharose, Lactose.
(5-Aminobuttersäure oder L-Prolin
vornimmt.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11394179A JPS5639786A (en) | 1979-09-05 | 1979-09-05 | Preparation of polymer composition containing cell or organelle |
JP11394079A JPS5639785A (en) | 1979-09-05 | 1979-09-05 | Polymer composition containing cell or organelle and its preparation |
JP11393979A JPS5639784A (en) | 1979-09-05 | 1979-09-05 | Polymer composition containing chloroplast and its preparation |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3033562A1 DE3033562A1 (de) | 1981-03-12 |
DE3033562C2 true DE3033562C2 (de) | 1983-12-22 |
Family
ID=27312618
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE3033562A Expired DE3033562C2 (de) | 1979-09-05 | 1980-09-05 | Polymerisierte Zusammensetzung mit einer darin immobilisierten Zelle oder Organelle und Verfahren zu ihrer Herstellung. |
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Country | Link |
---|---|
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EP0160260A3 (de) * | 1984-05-02 | 1986-10-08 | Bayer Ag | Verfahren zur Immobilisierung von biologischem Material |
EP0160253A3 (de) * | 1984-05-02 | 1986-10-08 | Bayer Ag | Immobilisierung von Protaminobacter rubrum und Verwendung des immobilisierten Präparates zur Umwandlung von Sucrose zu Isomaltulose |
JP2817923B2 (ja) * | 1987-10-30 | 1998-10-30 | デヴァーズ・エムエス・カンパニー | ソリッドステート電池 |
FR2647465B1 (fr) * | 1989-05-23 | 1993-11-05 | Nestle Sa Produits | Procede de conservation d'embryons vegetaux |
WO2005107479A1 (en) * | 2004-04-29 | 2005-11-17 | Research Development Foundation | Oxidation of sulfites with chloroplast |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1125698A (en) * | 1978-03-09 | 1982-06-15 | Masaru Yoshida | Process for preparing a polymer composition |
-
1980
- 1980-09-05 DE DE3033562A patent/DE3033562C2/de not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE3033562A1 (de) | 1981-03-12 |
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Legal Events
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OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: STREHL, P., DIPL.-ING. DIPL.-WIRTSCH.-ING. SCHUEBE |
|
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |