DE3885733T2 - Verfahren zur befreiung von zellgemischen und geweben von unerwünschten populationen. - Google Patents
Verfahren zur befreiung von zellgemischen und geweben von unerwünschten populationen.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Konjugat, das einen monoklonalen Antikörper und eine Markierung enthält, ein Verfahren zur Herstellung des Konjugats und die Verwendung des Konjugats in einem Verfahren zur Zerstörung unerwünschter Zellen in einer Zellpopulation.
- Die zielgerichtete und selektive Eliminierung bestimmter Zelltypen aus gemischen Zellpopulationen verursacht sowohl in der experimentellen Forschung als auch in der klinischen Praxis Probleme. Zu diesem Zweck wurde die Anwendung von an Trägerstoffe gebundenen, d.h. an Immunoglobuline gebundenen zytotoxischen Substanzen versucht, siehe z.B. Keith, A. et al. Cancer Imm. Immunother. (1981) 12, 39 - 41. Dies bildet den theoretischen Hintergrund der sogenannten "Targeting" Therapie, in deren Verlauf monoklonale Antikörper mit stark zytotoxischen Substanzen wie der Alphakette von Ricin konjugiert werden. Die Selektivität der Methode hängt ausschließlich von der Spezifität des Trägermoleküls ab. Seit dies für immer mehr Antikörper nachgewiesen wurde, die früher als spezifisch für einen einzigen Zelltyp galten, und seit man feststellte, daß die durch die Antikörper gebundene Determinante auch auf anderen Strukturen vorhanden sein kann, wird die Spezifität eher quantitativ als qualitativ angesehen. Um die Wirkung unerwunschter Bindungen zu beseitigen, kann die Kombination lokal wirksamer physikalischer Wirkungen eine Lösung bieten. Dies unterstreicht die Bedeutung normalerweise harmloser Moleküle, die erst durch physikalischen Einfluß, z.B. durch Bestrahlung mit Licht, toxisch werden.
- Die Fototheraphie ist ein Gebiet mit zunehmender Bedeutung in der Medizin. Unter den Anwendungen, wo Lichtquellen auf spezifische Ziele gerichtet werden, gilt den Verfahren mit Einsatz von Laserstrahlen besondere Aufmerksamkeit. Neben der größeren Energiedichte tragen die einzigartigen physikalischen Eigenschaften (Kohärenz, Polarisation) des Laserstrahls erheblich zur angestrebten biologischen Wirkung bei.
- Im Verlauf der Untersuchung der biologischen Wirkungen eines Niedrigenergie-He-Ne-Lasers auf in vitro Zellkulturen konnten wir eine eindeutige energieabhängige Reaktion nachweisen. Bei einem bestimmten Niveau der Strahlungsenergie kommt es zur biologische Aktivierung, während bei einem höheren Schwellenwert eine Zellspaltung beobachtet werden kann. Dieses Phänomen wird in Kisérketes Orvostudom ny (1984) 36, 96 und Studia Biophys. (1985) 105, 144 beschrieben. Diese Methode wird als "Immunotargeting" bezeichnet.
- Durch Einsatz verschiedener fotosensibilisierender Moleküle können die Energieschwellenwerte von biologischer Aktivierung und Zellspaltung beeinflußt werden.
- Aus dem Stand der Technik ist bekannt, daß Porphyrinderivate im Wellenlängenbereich des sichtbaren Lichts gut aktiviert werden können; deshalb werden sie weit verbreitet als Fotosensibilisatoren eingesetzt (siehe z.B. Br. J. Cancer (1979) 39, 398; Photochem. Photobiophys. (1988) 10, 53 - 59 und Cancer Res. (1981) 41, 401).
- GB-A-2,063,469 offenbart ein Konjugat zur Verwendung in der Aufspürung und Quantifizierung von Antikörpern und Antigenen in Körperflüssigkeiten, das eine immunologisch aktive Verbindung umfaßt, an der eine Markierung in Form eines Metallporphyrins hängt, das eine Chemilumineszenz-Reaktion katalysieren kann. Offenbar enthalten die als Markierung verwendeten Verbindungen koordinierte Metallatome.
- Die Erfindung gründet sich auf die Beobachtung, daß der Zellzerfall bereits bei einem Energieniveau einsetzt, wo nicht sensibilisierte Zellen nicht zerstört würden, wenn man die Oberfläche verschiedener Zellen mit fotosensibilisierenden Substanzen in Kontakt bringt, darunter die an sich nicht toxischen und durch unseren He- Ne-Laser direkt nicht aktivierbaren Hematoporphyrinderivate (HPD-Moleküle), und dann mit Laser bestrahlt.
- Um dieses Ziel zu erreichen, werden Porphyrinderivate, vorzugsweise Hematoporphyrinhydrochlorid kovalent mit monoklonalen Antikörpern gepaart, die sich selektiv an Strukturen der Zelloberfläche binden können.
- Die Konjugation erfolgt durch Bebrüten des monoklonalen Antikörperproteins mit dem Porphyrinderivat, vorzugsweise mit Hematoporphyrinhydrochlorid in wäßriger Lösung.
- Die Bestrahlung dieser Hematoporphyrinderivate mit sichtbarem Licht führt zu einem wellenlängenabhängigen Induktionsprozeß freier Radikale, wodurch die biologischen Strukturen geschädigt werden. Da das Absorptionsmaximum von Hematoporphyrin etwa 405 nm beträgt, wird eine große Menge freier Radikale erzeugt, und ihre schädigende Wirkung auf lebende Zellen kann nach der Bestrahlung bei dieser Wellenlänge nicht kontrolliert werden. Im Gegensatz dazu ist die Wirkung im Wellenlängenbereich um 630 nm erheblich verringert, da die Lichtenergie anstatt durch das Hematoporphyrinmolekül durch die biologische Struktur selbst absorbiert wird und durch Elektronentransferprozesse eine sehr viel begrenztere Wirkung ausgelöst wird, die sich besser regulieren laßt. Die Rolle der fotosensibilisierenden Moleküle in diesem Prozeß ist es, den Elektronentransfer auszulösen.
- Der Einsatz von He-Ne-Laser mit ausgestrahltem Licht von 632,8 nm gestattet für relativ kurze Zeit einen Fluß an konzentrierter Fotoenergie, der ausreicht, regulierte Elektronentransferprozesse auszulösen, jedoch nicht direkt zur Bildung freier Radikale führt.
- In einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren für die Herstellung von fotosensibilisierenden Konjugaten zur Verfügung gestellt, bei dem man beispielsweise Anti-PNAr-I, Anti-PNAr-II, Anti-PNAr-III, Anti-WGA, Anti-T3, Anti-AFP, Anti-HCG und Anti-H Antikörper in einem wäßrigen Medium mit bestimmten Porphyrinderivaten bebrütet.
- Die vorstehend aufgeführten zielspezifischen monoklonalen Antikörper haben folgende Eigenschaften:
- Ein monoklonaler Antikörper (IgG1), der mit dem Erdnußagglutininantigen (peanut agglutinin antigen = PNA) bindenden Rezeptor reagiert, welcher durch Lectinaffinitätschromatographie aus den Epithelzellen der Magenschleimhaut isoliert wird. Er reagiert sowohl mit dem Golgi-Apparat der Zellen in der normalen Magenschleimhaut als auch mit der Oberfläche und zytoplasmischen Strukturen von Magenkrebszellen. Letztere binden den monoklonalen Antikörper auf spezifische Weise auch in ihren Metastasen.
- Ein monoklonaler Antikörper (IgG1) gegen den PNA bindenden Rezeptor, der durch Lectinaffinitätschromatographie aus der Körpermembran von Milchfett isoliert wird. Dieser Antikörper reagiert mit der Lamina basalis des Drüsenausführungsganges aus der normalen Brust sowie mit der Oberfläche und zytoplasmischen Strukturen von Brustkrebszellen sowohl im primären Tumor als auch in Metastasen.
- Ein monoklonaler Antikörper (IgG) gegen den PNA-Rezeptor, der durch Lectinaffinitätschromatographie aus dem Schleim einer Eierstockzyste isoliert wurde. Der Antikörper reagiert gut mit verschiedenen Typen von Eierstockkrebs sowohl im Primärtumor als auch in Metastasen.
- Ein monoklonaler Antikörper, der mit Weizenkeimagglutininantigen (wheat germ agglutinin antigen = WGA) reagiert. Nach der Inkubation mit WGA können Zellen, die auf ihrer Oberfläche WGA-bindende Rezeptoren aufweisen, dadurch sensibilisiert werden.
- Antikörper, die mit T-Lymphzyten reagieren. Sie können bei Knochenmarktransplantationen zur Entfernung von T- Zellen verwendet werden.
- Ein monoklonaler Antikörper, der mit dem Oberflächenantigen des das Y-Chromosom tragenden Bullenspermas für künstliche Insemination reagiert.
- Ein monoklonaler Antikörper, der mit Alphafoetoprotein erzeugenden Tumoren reagiert.
- Ein monoklonaler Antikörper, der mit menschliches Choriogonadotropin erzeugenden Tumoren reagiert.
- Fig. 1 der Zeichnungen zeigt das Testergebnis mit einem erfindungsgemäß erhaltenen Konjugat.
- Fig. 2 zeigt die Ergebnisse von Beispiel 1, das mit Anti-OVA- und Anti-WGA-Zellen durchgeführt wurde.
- Fig. 1 zeigt die Testergebnisse mit einem Konjugat, das durch das obenstehend beschriebene Verfahren hergestellt wurde. Der Anti-PNAr-I monoklonale Antikörper, der gegen den das Erdnußagglutinin-Antigen bindenden Rezeptor, der auf der Oberfläche normaler Zellen der Magenschleimhaut sowie auf den neoplastisch transformierten Formen vorhanden war, eingesetzt wurde, wurde mit Hematoporphyrin konjugiert und anschließend gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete monoklonale Antikörperhematoporphyrin-Konjugat kann für unbestimmte Zeit gelagert werden, wenn man es trocknet. Das Konjugat wird vor der Verwendung in sterilem destilliertem Wasser aufgelöst; die spezifische Antikörperaktivität und die Fotosensibilisatorbindung werden danach ermittelt.
- Das so hergestellte Konjugat ist für die Zwecke des "Fotoimmunotargeting" mit Laser geeignet.
- In einem in vitro Verfahren wird eine Zellmischung 1 bis 1,5 Stunden inkubiert, anschließend mit dem Kulturmedium gewaschen und dann mit einem He-Ne-Laser bei 14 J/cm² Strahlungsenergie mit einer Wellenlänge bestrahlt, die praktischerweise über 600 nm und vorzugsweise bei 632 nm liegt.
- Auf der Grundlage unserer Experimente betrug die optimale Konzentration des Konjugats 5 ug/ml Hematoporphyrin.
- In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung daher die Verwendung des Konjugats in einem Verfahren zur Entfernung unerwünschter Zellpopulationen aus Zellmischungen und -geweben zur Verfügung.
- Es kommt häufig vor, daß die Trennung bestimmter Zellpopulationen (z.B. spezifische monoklonale Antikörper erzeugende Hybridome) sich als sehr schwierig erweist; außerdem ist selbst bei vollständiger Trennung der Ertrag an reinen Zellen ziemlich niedrig.
- Erfindungsgemäß kann dieses Problem dadurch gelöst werden, daß man die Mischung aus den erwünschten und kontaminierenden Zellen mit dem Konjugat bestimmter Porphyrinderivate, die mit dem kontaminierenden zell(en)spezifischen monoklonalen Antikörper gepaart wurden, in Kontakt bringt und die Mischung mit Laser bestrahlt.
- Durch die Erfindung kann der Anteil der erwünschten Zellen merklich gesteigert werden.
- Die durch die Erfindung zu Verfügung gestellten Möglichkeiten können vorzugsweise für die Herstellung monoklonaler Antikörper genutzt werden, die spezifisch für Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht sind. In diesen Fällen wird das Antigen zur Immunisierung üblicherweise mit einigen Proteinen mit hohem Molekulargewicht wie Thyreoglobulinen, Rinderserumalbumin, "keyhole limpit"-Haemocyanin etc. gepaart. Nach der Zellfusion entstehen deshalb mehrere Hybridome, die einen Antikörper erzeugen, der mit der Antigendeterminante des Trägerproteins reagiert. Die Eliminierung solcher Antikörper verbessert die Chancen der Züchtung und Isolierung von Klonen erheblich.
- Wie bereits erwähnt, ist das erfindungsgemäße Konjugat nicht nur auf ein Verfahren zur Erzeugung von Hybridomzellen anwendbar, sondern durch Auswahl geeigneter monoklonaler Antikörper auch in einem Verfahren zur Entfernung von T-Zellen bei Knochenmarkstransplantationen sowie einem Verfahren zur Verrringerung der Y- Chromosomenkonzentration in Bullensperma, das für die künstliche Insemination verwendet wird, geeignet.
- Erfindungsgemäß wird das Konjugat in einem "Immunotargeting"-Verfahren verwendet, bei dem lebendes Gewebe, das einen unerwünschten Zelltyp bzw. unerwünschte Zelltypen enthält, mit dem Konjugat behandelt wird, das monoklonale, mit Porphyrinderivaten konjugierte Derivate enthält, und anschließend mit Laserstrahlen einer Wellenlänge bestrahlt, die über der liegt, die das Porphyrinderivat aktiviert. Vorzugsweise wird ein He- Ne-Laserstrahl mit einer Wellenlänge von mehr als 600 nm, vorzugsweise 630 nm verwendet.
- Bei diesem Verfahren ist die selektive Zerstörung verschiedener Zellen, ohne daß ihre Umgebung beeinträchtigt wird, von größter Wichtigkeit. Diese Hypothese wird durch folgende durch Experimente gewonnene Erkenntnisse gestützt.
- Menschliche Magenkrebszellen und Mäusehybridomzellen wurden durch subkutane Injektion dorsal in nackte Mäuse (haarlose Mäuse ohne Thymusdrüse) verpflanzt. Sobald die Tumorgröße 0,5 cm erreicht hatte, wurde das Konjugat, das 5 - 10 mg/kg Körpergewicht Hematoporphyrin entsprach, verabreicht. Als Konjugate verwendete man Anti-PNAr-I monoklonales Antikörperkonjugat für die Mäuse, die menschliche Tumorzellen trugen, und WGA- Hematoporphyrinkomplex für die Mäuse, denen Anti-WGA- Hybridome eingepflanzt worden waren. Nach 24 Stunden wurden die Tumoren, die auf dem Rücken der Mäuse wuchsen, mit einer Energie von 14 J/cm² durch die Haut bestrahlt.
- Bei beiden Modellen beeinflußte Hematoporphyrin allein das Tumorwachstum nicht. Auch die Laserbestrahlung allein veränderte die Tumorproliferation nicht. Doch bei der Anwendung beider Stimulantien wurde der Tumor innerhalb eines Tages zerstört. Nach der Behandlung verschwand der Tumor vollständig und ließ nur Kallus zurück. Der Prozeß wurde auch durch eine histologische Nachuntersuchung überwacht.
- Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß das Konjugat auch in in vitro "Fototargeting"-Verfahren angewendet werden kann. Seine Rolle erstreckt sich nicht nur auf die menschliche Gesundheitspflege, sondern auch auf die Veterinärmedizin, z.B. wenn man Tiere sterilisieren will.
- Folgende Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
- Man stellt eine Mischung von Hybridom-Zellen her. 1 x 10 Anti-WGA-Zellen werden im Verhältnis 1 : 1 mit Anti- OVA-Hybridomzellen vermischt. Ersterer Zellstamm, der ein monoklonales Immungammaglobulin erzeugt, das spezifisch mit Weizenkeimagglutininlectin (WGA) reagiert, wurde 1984 in unserem Labor erzeugt, während der zweite 1978 durch Bötcher et al. entwickelt wurde. Ein HP- Anti-OVA-Konjugat, das 5 ug/ml HP entsprach, wurde dem RPMI-1640 Medium zugesetzt und die Mischung eine Stunde in einem CO&sub2;-Inkubator bebrütet. Dann wurden die Zellen zentrifugiert und dreimal in konjugatfreiem RPMI-1640 Medium gewaschen. Die Zellmischung wurde mit einer Energie von 14 J/cm² durch einen He-Ne Laser bestrahlt. Durch ein früher von uns entwickeltes Verfahren, bei dem die Menge des Kulturmediums auf den Durchmesser des Laserstrahls verringert wird, konnte eine gleichmäßige Bestrahlung erreicht werden. Vor und nach der Bestrahlung wurde die Erzeugung spezifischer Antikörper durch ELISA festgestellt; daraus konnte der Anteil der Zellpopulation, die ein individuelles Immunoglobulin erzeugt, ermittelt werden. Fig. 2 zeigt die Ergebnisse.
- Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, blieb die durch die Anti-OVA-Zellen erzeugte Antikörpermenge nach wie vor in der Zellmischung, obwohl ihre Zahl sehr gering war. Die meßbare Antikörperproduktion, die erst nach einer Woche nachweisbar war, entsprach 10 Duplikationen für Hybridomzellen, was 10 - 100 überlebenden Zellen für einen Zellzahl von 2 x 10&sup5; entspricht.
- Auf der Grundlage vorstehender Ergebnisse führt bereits eine einzige Bestrahlung zu einem Wirksamkeitsgrad, der wesentlich höher als bei bereits bekannten Zelltrennungsverfahren wie dem Zellsortierer ist.
- 20,0 mg Hematoporphyrindihydrochlorid wurden durch 0,8 ml N,N-dimethylformamid in 1,25 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Dieses wurde mit 20,0 mg in 0,6 ml Wasser aufgelöstem 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDCL) vermischt. Nach 30 Minuten gab man 15,0 mg in 5,0 ml destilliertem Wasser aufgelöstes Antikörperprotein dazu und bebrütete die Mischung 5 Stunden bei Raumtemperatur, während der pH ständig zwischen 6 und 7 gehalten wurde. Anschließend gab man 50 ul Monoethanolamin zu und ließ die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Nach diesem Schritt wurde die Lösung 4 Tage gegen 0,0001 M Phosphatpuffer, wobei der Puffer dreimal täglich gewechselt wurde, und schließlich über Nacht gegen PBS dialysiert. (Dabei wurde der pH konstant auf 7,4 gehalten). Die dabei entstandene Lösung wurde durch Sephadex(R) G 25 gefiltert. Nach der Ermittlung des Gesamtproteingehaltes kann die Hematoporphyrinbindung fotometrisch bei 390 nm Wellenlänge durch eine Eichkurve ermittelt werden. Die Aktivität des spezifischen Antikörpers kann durch Immunserologie (z.B. durch ELISA) ermittelt werden.
Claims (6)
1. Konjugat enthaltend einen monoklonalen Antikörper und eine Markierung,
dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung Hematoporphyrin ist.
2. Konjugat nach Anspruch 1, in dem der monoklonale Antikörper aus
Anti-PNArI, Anti-PNAr-II, Anti-PNAr-III, Anti-AFP, Anti-hCG, Anti-WGA,
Anti-T3 und Anti-H ausgewählt ist.
3. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1
oder 2, bei dem man einen monoklonalen Antikörper mit Hematoporphyrin in
einem wäßrigen Medium inkubiert.
4. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 oder 2 oder hergestellt nach
Anspruch 3, zur Verwendung in einem Verfahren zur Zerstörung von
unerwünschten Zellen innerhalb einer Zellpopulation, bei dem man die
Zellpopulation mit einem Konjugat in Kontakt bringt und anschließend mit
Laserlicht bei einer Wellenlänge über 600 nm bestrahlt.
5. Konjugat nach Anspruch 4, zur Verwendung in einem Verfahren zur
Zerstörung von unerwünschten Zellen innerhalb einer Zellpopulation, bei dem
man die Zellpopulation mit einem Konjugat in Kontakt bringt und
anschließend mit Laserlicht bei etwa 630 nm Wellenlänge bestrahlt.
6. Verfahren zur Zerstörung von unerwünschten Zellen innerhalb einer
Zellpopulation in vitro, bei dem man die Zellpopulation mit einem
Konjugat nach Anspruch 1 oder 2 oder hergestellt nach Anspruch 3 in Kontakt
bringt und anschließend mit Laserlicht über 600 nm, vorzugsweise bei 630
nm bestrahlt.
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