FI96375C - Menetelmä kasvin alkioiden säilyttämiseksi - Google Patents

Description

96375

Menetelmä kasvin alkioiden säilyttämiseksi. - Förfarande för förvaring av växtgroddar.

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä kasvin alkioiden 5 säilyttämiseksi.

Useita kasvilajeja voidaan säilyttää ja varastoida solusus-pensioiden, solukudosten tai jopa meristeemien muodossa.

10 Kasvialkioiden varastointi on monissa tapauksissa oikeutettua esimerkiksi taimien tuotannon säätelemiseksi vuodenaikojen mukaisesti tai kloonilinjan säilyttämiseksi. Kasvialkioiden säilytyksellä voidaan saavuttaa erilaisia etuja, joita ovat esimerkiksi mahdollisuus keskeyttää 15 väliaikaisesti alkioiden kehitys, saada aikaan niiden kuljettamiseksi siemenpenkkiin tai niiden varastoimiseksi sekä mahdollisuus muodostaa keinosiemeniä.

Somaattisilla alkioilla on tiettyjä etuja kasvien moninker-20 taistamiseksi. Ne saavat periaatteessa alkunsa yksittäisestä solusta ja muodostavat geneettisesti identtisiä kasveja. Muodostumisensa alusta alkaen somaattisilla alkioilla on kaksinapainen rakenne. Niillä on kaksi meristee-miä, nimittäin varsi- ja juurimeristeemi, joita tarvitaan 25 kasvin muodostamiseksi. Tästä syystä somaattinen alkiosynty :· vaikuttaa mielenkiintoiselta vaihtoehdolta kasvien lisäämi seksi : sitä voitaisiin käyttää tuotantokustannuksiltaan kalliiden lajien tai in vitro viljelmistä alkunsa saavien suurtehoyksilöiden tai esimerkiksi seksuaalisesti vaikeasti 30 lisättävien muunnettujen kasvien nopeaksi moninkertaistamiseksi.

On olemassa erilaisia tunnettuja menetelmiä differentioi-mattomien kudosten varastoimiseksi alhaisissa lämpötiloissa 35 ja/tai happivajauksen alaisena. Yleisesti ottaen kudokset pidetään puolikiinteässä väliaineessa tai varastoidaan alle 0°C lämpötilassa.

2 96375

Eräässä tunnetussa menetelmässä varastoidaan viinirypäleso-lukkoja lämpötilassa 10 tai 15°C. Niiden varastoiti-iän pidentämiseksi voidaan solukkoihin lisätä kerros silikoni-öljyä, vaikka ne pidetäänkin edelleen ravintosubstraatis-5 saan. Erästä toista menetelmää voidaan soveltaa juustoihin tai soluihin ja siinä muodostetaan solujen vesiemulsio käyttämällä öljyväliainetta ja jäähdyttämällä koko rakenne suuruusluokkaa -20/-30°C olevaan lämpötilaan siten, että vesi säilyy alijäähtyneenä. Öljy siis toimii solujen tai 10 hiivojen kryosuojausaineena.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on saada aikaan menetelmä kasvialkioiden säilyttämiseksi, jolla kasvualustastaan eristettyjen alkioiden kasvua voidaan hidastaa 15 merkittävästi ennalta määrätyn ajan ja saattaa sen jälkeen uudelleen käyntiin ilman sekundäärisen alkiosynnyn esiintymistä .

Tätä tarkoitusta varten keksinnön mukainen menetelmä on 20 tunnettu siitä, alkiot pidetään happivajauksessa päällystämällä ne öljykerroksella, minkä jälkeen ne jäähdytetään ja varastoidaan lämpötilassa, joka on 1 - 10°C kyseisten alkioiden kylmäherkkyyskynnyksen yläpuolella.

25 Yllättäen on havaittu, että pitämällä alkiot happivajauksen alaisena öljyssä alhaisessa lämpötilassa, saadaan niiden kasvua osittain ja kestävästi estetyksi vaikuttamatta lainkaan niiden elinvoimaisuuteen ja pitämiskykyyn ja samanaikaisesti alkion rakenteen eheys säilyy sen myöhemmän 30 kasvun aikana ilman minkään muun morfogeneesin, kuten solugeneesin tai sekundäärisen alkiogeneesin esiintymistä missään muodossa sen paremmin valossa kuin pimeässäkään.

Toisin sanoen keksinnön mukainen menetelmä kasvialkioiden 35 säilyttämiseksi mahdollistaa yhtäältä alkioiden säilymisen morfologisesti eheinä ja toisaalta säilyttää tehokkaasti niiden kyvyn muodostaa taimi.

96375 3 Tämän menetelmän eräänä toisena etuna on siten se, että alkiot voidaan varastoida suhteellisen pitkiksi ajanjaksoiksi. Lisäksi menetelmän etuna on se, että alkiot voidaan’ varastoida helposti saavutettavissa lämpötiloissa (esimer-5 kiksi jääkaapissa) tarvitsematta käyttää kalliita laitteita. Lisäksi keksinnön etuna on se, että saadaan aikaan menetelmä, joka voidaan suorittaa nopeasti ja helposti sekä pimeässä että valossa.

10 Esillä olevassa keksinnössä käytetyt alkiot voivat olla mitä tahansa alkuperää tai lajia, jolloin kysymykseen tulevat esimerkiksi porkkanat tai kahvipuut.

Alkiot voivat olla somaattisia alkioita tai sygoottisia 15 alkioita.

Somaattiset alkiot voidaan muodostaa differentioimattomista solususpensioista. Tässä tapauksessa voidaan esimerkiksi hybridistä alkuperää olevia siemeniä aseptisesti idättää.

20 Sirkkalehden alapuoliset alkion osat eli hybokotyylit voidaan leikata ja sijoittaa sitten kasvualustaan, joka sisältää kasvuhormoneja. Saadut solukot voidaan sen jälkeen dissosioida nestemäisessä kasvualustassa. Tämä antaa diffe-rentioimattoman solususpension, jonka solut useiden alavil-25 jelyiden jälkeen voidaan siirtää kasvualustaan. Noin 10 päivän kuluttua solususpensio voidaan suodattaa siten, että jäljelle jäävät ainoastaan halutun kokoiset soluaggregaa-tit. Näitä aggregaatteja voidaan viljellä muutamia päiviä hormonittomassa kasvualustassa alkioiden muodostumisen 30 aloittamiseksi.

Sygoottiset alkiot voidaan muodostaa ottamalla näytteitä leikkaamalla siemenet kypsässä tai lievästi epäkypsässä vaiheessa.

Saadut somaattiset ja sygoottiset alkiot voidaan luokitella kehitysvaiheensa mukaisesti. Edulliset alkiot ovat kehityk- 35 4 96375 sensä alkuvaiheissa silloin, kun niiden koko on välillä 150 - 1000 /im. Nämä koot vastaavat niiden kehityksen sydän-tai torpedovaiheita.

5 Saadut alkiot voidaan sen jälkeen pestä alkioviljelyssä tyypillisesti tavattavia kasvuhormoneja sisältämättömällä nestemäisellä viljelyväliaineella, jollainen on esimerkiksi 5 g/1 sakkaroosia sisältävä Murashige- ja Skoog-väliaine. Pestyt alkiot voidaan sitten siirtää viljelylevyille ja 10 kuivata poistamalla jäljellä oleva viljelyväliaine esimerkiksi pipetin avulla.

Alkiot pidetään sen jälkeen happivajauksen alaisena päällystämällä ne öljykerroksella. Öljy valitaan sen happiva-15 jauksen aikaansaavan kyvyn mukaisesti, eli se siirtää vähän tai ei lainkaan ulkopuolista happea alkioon. Öljy toimii suoja-aineena ja antaa alkioon vain sen elossapysymiseksi tarvittavan minimimäärän happea. Happivajauksen säilyttämiseksi käytetty öljy voi olla mineraaliöljy, kasvisalkupe-20 rää oleva öljy, synteettinen öljy tai joku muu öljy, joka kykenee säilyttämään happivajauksen olematta myrkyllinen alkioille. Käytetty öljy on edullisesti nestemäinen parafiiniöljy. Öljystä voidaan poistaa kaasu ja/tai se voidaan steriloida edeltäkäsin esimerkiksi autoklaavikäsittelemällä 25 20 minuuttia 115°C:ssa.

Lisätyn öljyn määrä tulee olla riittävä alkioiden päällystämiseksi kokonaan. Lisätty öljymäärä on edullisesti 0,02 - 0,5 ml/alkio.

30

Sen jälkeen alkiot jäähdytetään lämpötilaan, joka on hieman kyseessä olevien alkioiden kylmäherkkyyskynnyksen yläpuolella. Kylmäherkkyyskynnyksellä ymmärretään sitä lämpötilaa, jonka alapuolella alkiot eivät ole enää elinkykyisiä. 35 Lämpötila, johon alkiot jäähdytetään ja jossa ne sen jälkeen varastoidaan, voi olla muutamia asteita, nimittäin 1 - 10°C kylmäherkkyyskynnyksen yläpuolella.

; IN i nil I i i tl 96375 5

Varastointilämpötila voi olla esimerkiksi välillä 2 - 8°C ja edullisesti 3 - 5°C porkkanoiden tapaisten vain lievästi kylmälle herkkien alkiolajien kohdalla. Se voi olla välillä 12 - 20°C ja edullisesti 15 - 17°C kylmälle arempien alkio-5 lajien kohdalla, jollaisia ovat esimerkiksi trooppista perua olevat lajit, kuten kahvipuut.

Alkiot voidaan jäähdyttää esimerkiksi siirtämällä alkiot sisältävät viljelylevyt jäähdytyslaitteeseen tai ilmastoi-10 tuun tilaan. Jäähdytysnopeus voi olla suhteellisen suuri, esimerkiksi suuruusluokkaa 1 - 3°C/min.

Happivajauksen alaisena öljyssä olevat alkiot voidaan varastoida heikossa valossa (suuruusluokkaa 200 lux) tai 15 pimeässä.

Keksinnön mukainen menetelmä varmistaa pimeässä varastoitujen alkioiden elossapysymisen. Tästä voi olla käytännön etua niissä tapauksissa, joissa myöhemmin muodostetaan 20 keinosiemeniä kapseloimalla alkio. Tämä johtuu siitä, että ilmeisesti jäljellä oleva valaistus ei lainkaan saavuta kapselin sisällä olevaa alkiota. Alkiot voidaan varastoida näissä olosuhteissa suhteellisen pitkiksi ajoiksi, eli suunnilleen 2-4 kuukautta.

25 *· Varastoinnin jälkeen alkiot voidaan poistaa jäähdytyslait teesta ja lämmittää uudelleen ympäröivään lämpötilaan. Kun ne ovat saavuttaneet suurusluokkaa 20°C olevan lämpötilan, ne voidaan pestä tyypillisellä nestemäisellä viljelyväliai-30 neella jäljellä olevien öljyjäämien poistamiseksi.

Sen jälkeen ne voidaan sijoittaa tyypilliseen kasvualustaan, jollainen on esimerkiksi Murshige- ja Skoog-väliaine, jossa ne aloittavat uudelleen normaalin kasvun, joka on 35 verrattavissa varastoimatta jätettyjen alkioiden kasvuun.

6 96375

Jaettavaksi käyttäjille tarkoituksena suorittaa tavanomainen kylvö siemenpenkkiin tai pellolle alkiot voidaan kapseloida kestävämpiin materiaaleihin, jotka suojaavat niitä samalla tavoin kuin on asianlaita luonnonsiemenissä. Tässä 5 tapauksessa öljyllä päällystetyt alkiot voidaan kapseloida luonnon- tai keinopolymeereihin, esimerkiksi natriumalgi-naattigeeliin. Nämä kapselit muodostavat alkiolle mekaanisen ja hygieenisen suojan ja mahdollistavat taimen ravinnonsaannin idätyksen aikana. Kapselit voidaan myöhemmin 10 päällystää lisäkalvolla, esimerkiksi vesiliukoisella hartsilla, joka osittain suojaa niitä särkymiseltä ja kuivumiselta. Tällä tavoin on mahdollista aikaansaada keinosiemen, joka säilyy pitkähköjä ajanjaksoja ja erityisesti sen ajan, joka käytännössä tarvitaan niiden käyttöön.

15

Esillä olevaa keksintöä selvitetään yksityiskohtaisemmin seuraavissa esimerkeissä. Ennen näitä esimerkkejä on esitetty esimerkki somaattisten alkioiden tavanomaisesta valmistuksesta suorittamalla elinvoimaisuustesti ja esittä-20 mällä taulukko 1, jossa on esitetty käytetyn edullisen kasvualustan koostumus.

Esimerkki somaattisten alkioiden valmistuksesta 25 Differentioimaton soluviljelmä porkkanasoluja (Daucus · carota L.) alaviljellään joka 12. päivä (1 gramma biomassaa 100 ml:aan väliainetta) nestemäisessä Murashige- ja Skoog-kasvualustassa, joka sisältää 20 g/1 sakkaroosia ja 0,1 mg/1 2,4-dikloorifenoksietikkahappoa.

30 Käsittely suoritetaan kokonaan aseptisissa olosuhteissa laminaarivirtauskuvun alapuolella. Suspensio sijoitetaan sekoittimeen, joka suorittaa epäkeskeistä hyrräliikettä nopeudella 100 rpm ja viljely suoritetaan 23°C:ssa 200 35 luxin valaistuksessa valojakson ollessa 16 tuntia.

ID «Il I 1:111 I I I DI

96375 7 8-10 päivän viljelyn jälkeen solususpensio suodatetaan siten, että jäljelle jäävät ainoataan kooltaan 50 - 200 μπι olevat soluaggregaatit. Nämä pienet aggregaatit edustavat alkioiden esialkioastetta ja nämä alkiot kehittyvät edel-5 leen sydän-, torpedo- ja taimivaiheiksi. Aggregaatit pestään ja sijoitetaan Murashige- ja Skoog-väliaineeseen, joka ei sisällä lainkaan 2,4-dikloorifenoksietikkahappoa ja aggregaattien määrä on noin 1,5 x 103 aggregaattia per ml väliainetta.

10 10 päivän viljelyn jälkeen muodostuvat alkiot. Suspensio suodatetaan siten, että jäljelle jää ainoastaan kooltaan 150 - 1000 μιη olevia alkioita.

15 Elinvoimaisuustesti

Nopea ja yksinkertainen elinvoimaisuustesti on kehitetty alkioiden elinvoimaisuusasteen määrittelemiseksi pakastuksen jälkeen.

20

Erityisen ajankohtaisia kriteerejä alkioiden elinvoimaisuusasteen määrittelemiseksi ovat - alkioiden koon suureneminen ja - klorofyllisen värityksen ilmeneminen.

25 • Näitä kriteereitä voidaan arvioida eri tavoin esimerkiksi visuaalisella laskennalla tai biokemiallisilla testeillä (esimerkiksi värjäytymistesti).

30 Tämän testin periaatteen mukaisesti alkiot sijoitetaan tyypilliseen nestemäiseen tai puolikiinteään kasvualustaan. 10 päivän viljelyn jälkeen merkitään muistiin niiden alkioiden määrä, joiden koko on suurentunut ja joissa on merkkejä klorofyllisestä värjäytymisestä. Tämän määrän ja 35 mukana olevien alkioiden kokonaismäärän välinen suhde mahdollistaa alkioiden elinvoi-maisuusasteen määrittelyn.

8 96375

Alkiot voidaan sen jälkeen pitää samassa nestemäisessä väliaineessa tai ne voidaan sijoittaa kiinteään kasvualustaan, jolla on sama koostumus kuin aikaisemmalla nestemäisellä väliaineella siten, että ne kykenevät jatkamaan 5 kehittymistään taimiasteelle. Tässä väliaineessa tapahtuneen 10 päivän viljelyn jälkeen konversiotaso määritellään taimivaiheeksi kehittyneiden alkioiden määrän ja alkioiden kokonaismäärän välisenä suhteena.

10 Taulukko 1

Murashige- ja Skoog-väliaineen (pH 5,8 - 6) koostumus

Makroelementit mg l'1 15 NH2N03 1650

CaCl2 * 2H20 440

MgS04 ’ 7H20 370 KN03 1900 KH2P04 170 20

Mikroelementit

CoCl2 0,025

CuC04 * 5H20 0,025

FeS04 · 7H20 27,8 25 Na2 - EDTA 37,3

MnS04 * 4H20 22,3 KI 0,83

Na2Mo04 0,25

ZnS04 * 7H20 10,6 30 H3B03 6,2

Muut elementit

Nikotiinihappo 5

Tiamiini (I^-vitamiini) 5 35 Adeniini 2

Sakkaroosi 5,000 j . m.» mu i i i a« - .

9 96375

Esimerkki 1

Torpedovaiheessa (keskimääräinen koko 670 /zm) olevia, yllä kuvatulla tavalla saatuja somaattisia porkkana-alkioita 5 pestään nestemäisellä Murashige- ja Skoog-viljelyväliai-neella. Sen jälkeen alkiot sijoitetaan viljelylautasille, joissa on 6 kuppia ja määrä on 20/30 alkiota per kuppi ja alkioista poistetaan viimeisetkin jäljellä olevat viljely-väliaineet poistamalla neste pipetillä.

10

Kaksi ryhmää (A) ja (B) alkioita päällystetään nestemäisellä parafiiniöljykerroksella, joka on steriloitu edeltäkäsin autoklaavikäsittelemällä 20 minuuttia 115°C:ssa. Sen jälkeen lisätään 1 ml öljyä 5-8 alkiota kohti. Kaksi vertai-15 luryhmää (C) ja (D) alkioita päällystetään nestemäisellä viljelyväliaineella.

Viljelylautaset peitetään sen jälkeen kannella ja suljetaan hermeettisesti. Ensimmäinen ryhmä (A) alkioita happivajauk-20 sen alaisena ja öljyssä sijoitetaan 4°C:een jäähdytettyyn tilaan. Vertailun vuoksi toinen ryhmä (B) alkioita happiva-jauksen alaisena ja öljyssä pidetään lämpötilassa 23°C. Ensimmäinen vertailuryhmä (C) alkioita, jotka eivät ole happivajauksen alaisina, varastoidaan 4°C:ssa, kun taas 25 toinen vertailuryhmä (D) varastoidaan 23°C:ssa.

Nämä eri ryhmät varastoidaan 200 luxin valaistuksessa.

Tietyn varastointiajän jälkeen alkiot lämmitetään uudelleen 30 ympäröivään lämpötilaan ja nestemäistä kasvuväliainetta ruiskutetaan happivajauksen alaisena olevia alkioita ympä-.. röivän öljykerroksen alle mahdollisimman monien alkioiden siirtämiseksi viljelyväliaineeseen tai kasvualustaan.

35 Öljykerroksen poistamisen jälkeen alkiot pestään useissa peräkkäisissä viljelyväliainekylvyissä viimeistenkin jäljellä olevien öljyrippeiden poistamiseksi.

96375 10

Alkioiden koon kehittymistä varastointijakson aikana tarkkaillaan mittaamalla niiden kokoa kaksiokulaarisella suurennuslasilla, joka on varustettu mittausokulaarilla.

5 Saavutetaan seuraavat tulokset:

Alkioiden koko (μτη)

Varastointiaika (päivää) 10 _0 14 35 49 63_105

Ryhmä A (4°C) 670 674 732 762 854 1327

Ryhmä B (23°C) 670 2863 2896 vertailu (4°C) 670 688 1104 1292 1536 3310 15 Vertailu (23°C) 670 10500

Voidaan havaita, että 23°C:ssa varastoidut alkiot kasvavat suhteellisen nopeasti siitä huolimatta, ovatko ne happiva-jauksessa vai eivät. 14 päivän jälkeen niiden koko on 20 enemmän kuin kolminkertaistunut, kun taas 4°C:ssa varastoidut alkiot eivät ole kasvaneet juuri lainkaan. 105 päivän kuluttua happivajauksessa ja öljyssä 4°C:ssa varastoidut alkiot ovat edelleen suhteellisen pienikokoisia, kun taas kasvualustassa 4°C:ssa varastoitujen vertailualkioiden 25 kasvu on jatkunut.

Samanaikaisesti voidaan todeta, että varastointi happiva-jauksessa ja öljyssä 4°C:ssa vaikuttaa alkioiden elinvoimaisuuteen .

30 Tätä tarkoitusta varten alkiot, joista on poistettu öljy-. kerros ja jotka on lämmitetty uudelleen ympäröivään lämpö tilaan, viljellään nestemäisessä Murashige- ja Skoog-kasvu-alustassa.

Alkioiden elinvoimaisuus määritellään niiden kasvun uudel-leenalkamisella tai jatkumisella nestemäisessä väliainees- 35 96375 11 sa. 10 päivän viljelyn jälkeen määritellään alkioiden elin-voimaisuustaso.

Saadaan seuraavat tulokset: 5

Elinvoimaisuustaso: (ilmaistuna prosentuaalisena uudelleenkasvuna)

Varastointiaika (päivää) 10 _0_14_35_49_63_105

Ryhmä A (4°C) 97 94 97 92 90 65

Ryhmä B (23°C) 97 96 18 0

Vertailu (4°C) 97 92 92 91 87 83 15 Vertailu (23°C) 97 90

Happivajauksen alaisena öljyssä 4°C:ssa varastoiduilla alkioilla on oikea elinvoimaisuustaso 105 päivän varastoinnin jälkeen, kun taas happivajauksessa 23°C:ssa varas-20 toidut alkiot eivät enää ole elinvoimaisia 35 päivän varastointia jän jälkeen.

4°C:ssa varastoitujen vertailualkioiden elinvoimaisuus on myös hyvä 105 päivän jälkeen, mutta tällöin niiden koko on 25 liian suuri (noin 3300 μτη) eikä niitä tästä syystä voida : varastoida kapseloimalla ne polymeeriin.

Nestemäisessä väliaineessa tapahtuneen 20 päivän viljelyn jälkeen määritellään niiden alkioiden määrä, jotka ovat 30 kehittäneet normaalin taimen.

·. Saadaan seuraavat tulokset:

Konversiotaso (ilmaistuna kasvaneiden taimien prosenttimää-35 ränä) 12 96375

Varastointiaika (päivää) _0_35_63_105

Ryhmä A (4°C) 97 99 80 36 5 Vertailu (4°C) 97 86 23 0

Happivajauksessa ja öljyssä 4°C:ssa varastoidut alkiot jatkavat kasvuaan ilman sattumanvaraisen lisääntymisen esiintymistä täsmälleen samalla tavoin kuin vertailualkiot.

10

Estämällä osittain somaattisten alkioiden kasvu pitämällä ne happivajauksessa ja öljyssä 4°C:ssa ei heikennä alkioiden elinvoimaisuutta tai niiden kykyä uudelleenkasvuun.

15 Esimerkki 2

Somaattisia porkkana-alkioita (keskimääräinen koko 460 μχη) varastoidaan 4°C:ssa esimerkissä 1 kuvatulla menetelmällä.

20 Alkiot varastoidaan osittain pimeässä ja vertailun vuoksi osittain 200 luxin valossa.

Alkioiden koon kehittymistä tarkkaillaan varastointijakson aikana.

25 ; Saadaan seuraavat tulokset:

Alkioiden koko (μπι)

Varastointiaika (päivää) 30 _0 18 29 46 61 81 95

Happivajaus öljyssä pimeässä 460 596 601 701 625 545 554 35 Happivajaus öljyssä 2200 lux 460 610 603 659 547 651 548

Vertailu, pimeässä 460 999 1325 2811 3644 7454 11670 40 Vertailu, 200 lux 460 1120 1508 2493 4634 7602 9941 96375 13

Voidaan todeta, että happivajauksen alaisena öljyssä pidettyjen alkioiden koko ei ole juuri lainkaan kehittynyt riippumatta siitä, varastoidaanko ne valossa tai pimeässä.

5 Alkion joutuminen valolle alttiiksi varastoinnin aikana ei näytä heikentävän sen elinvoimaisuutta. Valon puuttuminen ei vaikuta lainkaan kasvun estymisasteeseen, jonka aiheuttaa öljyn muodostaman happivajauksen ja alhaisen lämpötilan yhdistelmä.

10

Esimerkki 3

Kehittyneellä torpedoasteella (keskimääräinen koko 1590 μπι) olevia kahvipuun, Coffea arabica, somaattisia alkioita 15 pestään ja sijoitetaan viljelylautaselle esimerkissä 1 kuvatulla menetelmällä.

Kolme ryhmää (A), (B) ja (C) alkioita päällystetään steri loidulla nestemäisellä parafiiniöljykerroksella määrän 20 ollessa noin 1 ml öljyä 5-8 alkiota kohti. Kolme vertailuryhmää alkioita päällystetään nestemäisellä Murashige- ja Skoog-väliaineella.

Yksi ryhmä (A) öljyn muodostamassa happivajauksessa olevia 25 alkioita varastoidaan 4°C:ssa, toinen ryhmä (b) 10°C:ssa ja kolmas ryhmä (C) 15°C:ssa. Ensimmäinen vertailuryhmä varastoidaan 4°C:ssa, toinen 10°C:ssa ja kolmas 15°C:ssa.

Ryhmät pidetään pimeässä yksi kuukausi ja palautetaan sen 30 jälkeen ympäröivään lämpötilaan. Alkiot pestään esimerkissä , 1 kuvatulla menetelmällä ja viljellään sen jälkeen puoli- kiinteässä Murashige- ja Skoog-väliaineessa. 1

Saadaan seuraavat tulokset: päivän viljelyn jälkeen määritellään alkioiden elinvoi-35 maisuustaso.

14 96375

Elinvoimaisuustaso (uudelleenkasvu, %)

Ryhmä A (4°C) 0

Ryhmä B (10°C) 0 vertailu 5 Ryhmä C (15°C) 80

Vertailu (4°C) 0

Vertailu (10°C) 0 vertailu

Vertailu (15°C) 84 10 Voidaan todeta, että 4°C:ssa tai 10°C:ssa varastoidut alkiot muuttuvat ruskeiksi ja kuolevat riippumatta siitä, ovatko ne öljyn aiheuttamassa happivajauksessa tai nestemäisessä kasvualustassa.

15 Kahvipuun alkiot säilyvät hyvin 15°C lämpötilassa.

On siis tärkeätä ottaa huomioon kyseessä olevien lajien kylmäherkkyyskynnys minimivarastointilämpötilan määrittelemiseksi .

20

Esimerkki 4

Kehittyneellä torpedoasteella (keskimääräinen koko 1590 μπι) olevia somaattisia kahvipuun alkioita varastoidaan 15°C:ssa 25 öljyn aiheuttamassa happivajauksessa esimerkissä 1 kuvatulla menetelmällä.

1 tai 2 kuukauden varastoinnin jälkeen alkiot lämmitetään uudelleen ympäröivään lämpötilaan ja pestään.

30

Alkioiden koon kehittymistä varastointijakson aikana tarkkaillaan.

Saadaan seuraavat tulokset: <B 1 SO ! IMI I t t Iti 35 96375 15

Alkioiden koko (μπι)

Varastointiaika _0_1 kuukausi 2 kuukautta 5 Öljyn aiheuttamassa happi- vajauksessa olevat alkiot 1590 1680 1710

Vertailualkiot 1590 2780 2590 10 Voidaan havaita, että öljyn aiheuttamassa happivajauksessa olevat alkiot kasvavat paljon hitaammin kuin vertailualki-ot.

Alkioiden elinvoimaisuus määritellään puolikiinteässä 15 väliaineessa tapahtuneen 10 päivän viljelyn jälkeen. Se on 70 % öljyn aiheuttamassa happivajauksessa 2 kuukautta varastoitujen alkioiden kohdalla 84 % nestemäisessä kasvualustassa 2 kuukautta varastoitujen vertailualkioiden kohdalla. Alkioiden päällystäminen öljykerroksella mahdol-20 listaa siis niiden kasvun tehokkaan estämisen heikentämättä vakavasti niiden elinvoimaisuutta.

Esimerkki 5 25 Kehittyneellä sydänasteella (keskimääräinen koko 1100 μιη) tai torpedoasteella (keskimääräinen koko 1320 μτη) olevia . somaattisia kahvipuun alkioita varastoidaan pimeässä 15°C:ssa 1 kuukauden ajan joko parafiiniöljyn aikaansaamassa happivajauksessa tai nestemäisessä kasvualustassa esi-30 merkissä 1 kuvatulla menetelmällä.

Varastoinnin jälkeen alkiot lämmitetään uudelleen ympä-. röivään lämpötilaan ja pestään. Alkioiden koon kehittymistä varastointijakson aikana tarkkaillaan.

35

Saadaan seuraavat tulokset: 16 96375

Alkioiden koko (μτη)

Varastointiaika __0_1 kuukausi'

Kehittyneen svdänalkiot 5 Öljyn aiheuttama happivajaus 1100 1300

Vertailu 1100 2470

Torpedoalkiot Öljyn aiheuttama happivajaus 1320 1750 10 Vertailu 1320 2790

Esimerkin 4 tapaan voidaan todeta, että öljyn aiheuttamassa happivajauksessa olevat alkiot kasvavat hitaammin kuin ver-tailualkiot.

15

Alkioita viljellään 10 päivää puolikiinteässä Murashige- ja Skoog-väliaineessa, minkä jälkeen määritellään elinvoimai-suustaso.

20 Saadaan seuraavat tulokset:

Elinvoimaisuustaso (%)

Kehittyneet svdänalkiot - Öljyn aiheuttama happivajaus 76 25 - Vertailu 84

Torpedoalkiot - Öljyn aiheuttama happivajaus 71 - Vertailu 95 30 il i au i *i*i i.i tn*

Claims (7)

17 96375

1. Menetelmä kasvialkioiden säilyttämiseksi, tunnet -t u siitä, että alkiot pidetään happivajauksessa päällys- 5 tämällä ne öljykerroksella, minkä jälkeen ne jäähdytetään ja varastoidaan lämpötilassa, joka on 1 - 10°C kyseisten alkioiden kylmäherkkyyskynnyksen yläpuolella.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet -10 t u siitä, että öljy on mineraaliöljy, kasvisalkuperää oleva öljy tai synteettinen öljy.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että öljy on nestemäinen parafiiniöljy. 15

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että alkiot ovat somaattisia porkkana-alkioita ja ne varastoidaan lämpötilassa 2 - 8°C.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet - t u siitä, että alkiot ovat somaattisia kahvipuun alkioita ja ne varastoidaan lämpötilassa 12 - 20°C. 1 Menetelmä kasvialkioiden säilyttämiseksi, tunnet -25 t u siitä, että alkioiden happivajauksessa pitämiseksi . öljyllä päällystetyt alkiot kapseloidaan luonnon- tai keinopolymeereihin ennenkuin ne jäähdytetään ja varastoidaan lämpötilassa, joka on 1 - 10°C kyseisten alkioiden kylmä-herkkyyskynnyksen yläpuolella, tai kapselointi suori-30 tetaan jäähdyttämisen jälkeen. « ( .· 7. Keinosiemen, tunnettu siitä, että se on muodos tettu patenttivaatimuksen 6 mukaisesti. 96375