CN110301434A - 一种水稻幼苗超低温保存方法 - Google Patents

一种水稻幼苗超低温保存方法 Download PDF

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张金梅
陈晓玲
卢新雄
黄斌
辛霞
尹广鹍
何娟娟
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N3/00—Preservation of plants or parts thereof, e.g. inhibiting evaporation, improvement of the appearance of leaves or protection against physical influences such as UV radiation using chemical compositions; Grafting wax

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Abstract

本发明公开了一种水稻幼苗超低温保存方法。本发明保护一种水稻幼苗超低温保存方法，依次包括如下步骤：(1)将水稻幼苗浸没于预培养液，静置；(2)将水稻幼苗浸没于装载液，静置；(3)将水稻幼苗浸没于低温的玻璃化溶液，低温静置；所述玻璃化溶液为含4‑8mmol/L ASA的PVS2溶液；(4)将水稻幼苗浸没于玻璃化溶液，液氮冻存。本发明的发明人发现，在玻璃化溶液中添加4‑8mmol/L的外源ASA可以显著提高超低温保存后的存活率和成苗率。本发明提供的方法，程序简单，易于操作，提高效果显著，是提高水稻种质高含水量的幼苗超低温成活率的一条有效途径，具有重大的应用价值。

Description

一种水稻幼苗超低温保存方法
技术领域
本发明涉及一种水稻幼苗超低温保存方法。
背景技术
水稻研究背景清晰，水稻高含水量的萌发幼苗可作为基础研究、尤其是各种抗逆机制研究的良好材料。
超低温液氮保存是指将生物材料保存在-150℃～-196℃以下的技术。生物材料在经过一系列处理后，放置于液氮保存条件，经过恢复培养后可正常存活再生。高含水量的植物材料无法在直接液氮冷冻处理后存活，因此需要对组织进行脱水处理降低组织含水量，减少冻存、化冻过程中冰晶的产生。同时，采用乙二醇、甘油、二甲基亚砜等物质进行低温保护处理可以使植物细胞内溶液在冻存过程中形成玻璃态转变，避免冰晶形成的过程，从而使植物材料在超低温保存后能够保持生活力，并恢复生长。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻幼苗超低温保存方法。
本发明保护一种水稻幼苗超低温保存方法，依次包括如下步骤：
(1)将水稻幼苗浸没于预培养液，静置；
(2)将水稻幼苗浸没于装载液，静置；
(3)将水稻幼苗浸没于低温的玻璃化溶液，低温静置；所述玻璃化溶液为含4-8mmol/L ASA的PVS2溶液；
(4)将水稻幼苗浸没于玻璃化溶液，液氮冻存。
所述水稻幼苗为萌发72小时的水稻幼苗、萌发66小时的水稻幼苗、萌发48小时的水稻幼苗或萌发24小时的水稻幼苗。
所述玻璃化溶液为含6mmol/L ASA的PVS2溶液。
所述步骤(1)中，所述静置为25℃、黑暗条件下静置36-48小时。
所述步骤(1)中，所述静置为25℃、黑暗条件下静置36小时。
所述步骤(2)中，所述静置为室温静置10-20分钟。
所述步骤(2)中，所述静置为室温静置20分钟。10分钟时更换新的装载液。
所述步骤(3)中，所述低温的玻璃化溶液为2-6℃的玻璃化溶液，具体为4℃的玻璃化溶液。
所述步骤(3)中，所述低温静置为冰浴静置10-20分钟。
所述步骤(3)中，所述低温静置为冰浴静置10分钟。
本发明还保护一种水稻幼苗超低温保存方法，依次包括如下步骤：
将脱水处理后的水稻幼苗浸没于低温的玻璃化溶液，低温静置；然后，将水稻幼苗浸没于玻璃化溶液，液氮冻存。
所述玻璃化溶液为含6mmol/L ASA的PVS2溶液。
所述玻璃化溶液为含4-8mmol/L ASA的PVS2溶液。
本发明还保护一种水稻幼苗超低温保存方法，其特征在于：玻璃化处理时采用如下玻璃化溶液：含4-8mmol/L ASA的PVS2溶液。
所述玻璃化溶液为含6mmol/L ASA的PVS2溶液。
本发明还保护一种水稻幼苗超低温保存方法，其特征在于：
玻璃化处理时采用如下溶液：4-8mmol/L ASA的PVS2溶液；
冻存时采用如下溶液：4-8mmol/L ASA的PVS2溶液。
所述玻璃化溶液为含6mmol/L ASA的PVS2溶液。
本发明还保护ASA作为玻璃化溶液的添加剂在水稻超低温保存中的应用。
ASA作为玻璃化溶液的添加剂的使用浓度为4-8mmol/L，优选为6mmol/L。
以上任一所述水稻具体可为水稻品种“9311”。
以上任一所述PVS2溶液：含4-5g/L MS培养基粉、25-35g/100mL甘油、10-20g/100mL乙二醇、10-20g/100mL二甲基亚砜、0.3-0.5mol/L蔗糖，余量为水。
以上任一所述PVS2溶液：含4.43g/L MS培养基粉、30g/100mL甘油、15g/100mL乙二醇、15g/100mL二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖，余量为水。
以上任一所述装载液：含4-5g/L MS培养基粉、1.5-2.5mol/L甘油、0.3-0.5mol/L蔗糖，余量为水。
以上任一所述装载液：含4.43g/L MS培养基粉、2mol/L甘油、0.4mol/L蔗糖，余量为水。
以上任一所述预培养液：含0.4-0.6mol/L蔗糖的液体MS培养基。
以上任一所述预培养液：含0.5mol/L蔗糖的液体MS培养基。
本发明的发明人发现，在玻璃化溶液中添加4-8mmol/L的外源ASA可以显著提高超低温保存后的存活率和成苗率。本发明提供的方法，程序简单，易于操作，提高效果显著，是提高水稻种质高含水量的幼苗超低温成活率的一条有效途径，具有重大的应用价值。
附图说明
图1为水稻萌发72h的幼苗经超低温保存后恢培14d的生长情况。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中的光照培养的光强均为700lx。如无特殊说明，实施例中的水均为蒸馏水。
实施例中所用的水稻为水稻品种“9311”。
MS培养基粉末：Phyto Technology Laboratories,LLCTM，M 519。
液体MS培养基：含4.43g/L MS培养基粉末和30g/L蔗糖，余量为水；pH5.8。
固体MS培养基：含4.43g/L MS培养基粉末、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，余量为水；pH5.8。
PVS2溶液：含4.43g/L MS培养基粉、30g/100mL甘油、15g/100mL乙二醇、15g/100mL二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖，余量为水。
装载液：含4.43g/L MS培养基粉、2mol/L甘油、0.4mol/L蔗糖，余量为水。
卸载液：含1.2mol/L蔗糖的液体MS培养基。
ASA，全称为抗坏血酸，购自北京梦怡美商贸中心，货号为MA7631-25g。
GSH，全称为谷胱甘肽，购自北京拜尔迪生物技术有限公司，货号为DE-V900363-1G。
实施例1、
一、获得水稻幼苗
取水稻种子，先去除颖壳，然后进行无菌处理，然后置于固体MS培养基平板上进行培养。培养条件：25℃、16h光照/8h黑暗。
二、进行超低温保存
水稻幼苗分别为萌发72小时的水稻幼苗、萌发48小时的水稻幼苗或萌发24小时的水稻幼苗。
玻璃化溶液：含6mmol/L ASA的PVS2溶液。
1、取水稻幼苗，浸没于预培养液，25℃、黑暗条件下静置36小时。
预培养液：含0.5mol/L蔗糖的液体MS培养基。
2、完成步骤1后，将水稻幼苗浸没于装载液并室温静置10分钟，然后浸没于新的装载液并室温静置10分钟。
3、完成步骤2后，将水稻幼苗浸没于4℃的玻璃化溶液，冰浴静置10分钟。
4、完成步骤3后，将水稻幼苗转移到装有1ml玻璃化溶液的1.8ml的冷冻管中，将冷冻管投入液氮罐中进行保存。
三、恢复培养
1、复苏
从液氮中取出冻存管，置于38℃温水浴中150s。
2、洗涤
完成步骤1后，将幼苗取出，浸没于卸载液中并室温静置10分钟，然后浸没于新的卸载液中并室温静置10分钟。
3、恢复培养
完成步骤2后，将幼苗置于含30g/L蔗糖的固体MS培养基平板上，此时开始计天数，先暗培养3天，然后进行光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)，培养温度为25℃。
培养10天后，统计存活率。幼苗恢复绿色，判断为存活幼苗。幼苗存活率＝存活的幼苗个数/总幼苗数×100％。进行三次重复试验，每次重复试验25-30株幼苗。
培养20天后统计再生率。幼苗芽恢复生长，判断为再生植株。再生率＝再生的植株数/总幼苗数×100％。进行三次重复试验，每次重复试验25-30株幼苗。
萌发72小时的水稻幼苗，平均存活率为55％，平均再生率为42％。
萌发48小时的水稻幼苗，平均存活率为93％。
萌发24小时的水稻幼苗，平均存活率为95％。
萌发72小时的水稻幼苗经超低温保存然后恢复培养14d后的照片见图1的b。
对比例1、
玻璃化溶液为PVS2溶液，其他同实施例1。
萌发72小时的水稻幼苗，平均存活率为8％，平均再生率为0％。
萌发48小时的水稻幼苗，平均存活率为85％。
萌发24小时的水稻幼苗，平均存活率为88％。
萌发72小时的水稻幼苗经超低温保存然后恢复培养14d后的照片见图1的a。
实施例2、
一、获得水稻幼苗
取水稻种子，先去除颖壳，然后进行无菌处理，然后置于固体MS培养基平板上进行培养。培养条件：25℃、16h光照/8h黑暗。
二、试验一
玻璃化溶液：PVS2溶液。
预培养液：含0.5mol/L蔗糖的液体MS培养基。
1、取萌发66小时的水稻幼苗，浸没于预培养液，25℃、黑暗条件下静置36小时。
2、完成步骤1后，将水稻幼苗浸没于装载液并室温静置10分钟，然后浸没于新的装载液并室温静置10分钟。
3、完成步骤2后，将水稻幼苗浸没于4℃的玻璃化溶液，冰浴静置10分钟。
4、完成步骤3后，将水稻幼苗转移到装有1ml玻璃化溶液的1.8ml的冷冻管中，将冷冻管投入液氮罐中进行保存。
5、复苏
从液氮中取出冻存管，置于38℃温水浴中150s。
6、洗涤
完成步骤5后，将幼苗取出，浸没于卸载液中并室温静置10分钟，然后浸没于新的卸载液中并室温静置10分钟。
7、恢复培养
完成步骤6后，将幼苗置于含30g/L蔗糖的固体MS培养基平板上，此时开始计天数，先暗培养3天，然后进行光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)，培养温度为25℃。
培养10天后，统计存活率。幼苗恢复绿色，判断为存活幼苗。幼苗存活率＝存活的幼苗个数/总幼苗数×100％。进行三次重复试验，每次重复试验25-30株幼苗。
平均存活率为25％。
三、试验二
玻璃化溶液：含0.5、1、2、4、6或8mmol/L ASA的PVS2溶液。
其他同步骤二。
当玻璃化溶液中含有0.5、1、2、4、6或8mmol/L ASA时，平均存活率依次为26％、27％、27％、49％、67％或33％。玻璃化溶液中含有6mmol/L ASA时，效果最好。
四、试验三
玻璃化溶液：含0.1、0.2、0.4、0.6、0.8或1.0mmol/L GSH的PVS2溶液。
其他同步骤二。
当玻璃化溶液中含有0.1、0.2、0.4、0.6、0.8或1.0mmol/L GSH时，平均存活率依次为14％、18％、14％、21％、26％或7％。
五、试验四
预培养液：含0.5mol/L蔗糖和ASA的液体MS培养基。预培养液中，ASA的浓度分别为0.5、1、2、4、6或8mmol/L。
其他同步骤二。
当预培养液中含有0.5、1、2、4、6或8mmol/L ASA时，平均存活率依次为21％、36％、26％、24％、52％或26％。预培养液中含有6mmol/L ASA时，效果最好。在预培养液中添加ASA的效果劣于在玻璃化溶液中添加ASA。
六、试验五
恢复培养时，将幼苗置于含30g/L蔗糖和ASA的固体MS培养基平板上。ASA的浓度分别为0.5、1、2、4、6或8mmol/L。
其他同步骤二。
当恢复培养时采用0.5、1、2、4、6或8mmol/L ASA时，平均存活率为8％-14％之间。
七、试验六
预培养液：含0.5mol/L蔗糖和GSH的液体MS培养基。预培养液中，GSH的浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8或1.0mmol/L。
其他同步骤二。
当预培养液中含有0.1、0.2、0.4、0.6、0.8或1.0mmol/L GSH时，平均存活率依次为16％、23％、10％、12％、20％或27％。
八、试验七
恢复培养时，将幼苗置于含30g/L蔗糖和GSH的固体MS培养基平板上。GSH的浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8或1.0mmol/L。
其他同步骤二。
当恢复培养时采用0.1、0.2、0.4、0.6、0.8或1.0mmol/L GSH时，平均存活率依次为29％、4％、12％、6％、5％或25％。

Claims (10)

1.一种水稻幼苗超低温保存方法，依次包括如下步骤：
(1)将水稻幼苗浸没于预培养液，静置；
(2)将水稻幼苗浸没于装载液，静置；
(3)将水稻幼苗浸没于低温的玻璃化溶液，低温静置；所述玻璃化溶液为含4-8mmol/LASA的PVS2溶液；
(4)将水稻幼苗浸没于玻璃化溶液，液氮冻存。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述水稻幼苗为萌发72小时的水稻幼苗。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述静置为25℃、黑暗条件下静置36-48小时。
4.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述静置为室温静置10-20分钟。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述低温的玻璃化溶液为2-6℃的玻璃化溶液。
6.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述低温静置为冰浴静置10-20分钟。
7.一种水稻幼苗超低温保存方法，依次包括如下步骤：
将脱水处理后的水稻幼苗浸没于低温的玻璃化溶液，低温静置；然后，将水稻幼苗浸没于玻璃化溶液，液氮冻存；
所述玻璃化溶液为含4-8mmol/L ASA的PVS2溶液。
8.一种水稻幼苗超低温保存方法，其特征在于：玻璃化处理时采用如下玻璃化溶液：含4-8mmol/L ASA的PVS2溶液。
9.一种水稻幼苗超低温保存方法，其特征在于：
玻璃化处理时采用如下溶液：4-8mmol/L ASA的PVS2溶液；
冻存时采用如下溶液：4-8mmol/L ASA的PVS2溶液。
10.ASA作为玻璃化溶液的添加剂在水稻超低温保存中的应用。
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