CN104273119A - 一种提高拟南芥幼苗保存效果的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高拟南芥幼苗保存效果的方法，为采用含有碳纳米材料的玻璃化溶液处理拟南芥幼苗以提高其保存效果，具体包括：装载液处理、玻璃化溶液处理和液氮保存步骤，其中所述玻璃化溶液含有0.1~0.5g/L碳纳米管。本发明中公开的方法对拟南芥幼苗的保存效果优化显著，通过添加碳纳米管作为外源物质对植物玻璃化超低温保存起到促进作用。
Description
技术领域
本发明涉及植物或其局部的保存领域，具体涉及一种提高拟南芥幼苗保存效果的方法。
背景技术
超低温保存是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术。通常在液氮中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的生物学状态，达到长期保存种质的目的，超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期保存方式。玻璃化法超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻璃化态，并以这种玻璃态在低温下保存。玻璃化法因操作简单快捷，成本低，适宜保存种类广泛，保存材料遗传性稳定，保存效果好等优点，是近十年来用于优良种质资源中长期保存的首选方法。
在植物及其组织的玻璃化超低温保存的方法中，采用一些保存方法时，植物及其组织恢复培养后成活率不高或者根本不能成活；另外采用相同的保存方法时候，不同的植物及其组织恢复培养后是否能成活及成活率的高低也不尽相同。现有技术中添加一定的外源物质有利于提高超低温保存成活率，但是对于特定的植物和组织选择何种外源物质才能提高其保存效果却是未知的。
拟南芥属于被子植物门，双子叶植物纲，其为两年生草本，拟南芥作为模式植物的优点是植株小、结子多，其还为自花受粉植物，基因高度纯合。在超低温保存领域的研究中，拟南芥具有重要的地位和研究意义。拟南芥幼苗是非常好的研究材料，在已有的研究中发现，拟南芥萌发60h幼苗可以筛选不同的外源添加物质对于超低温保存效果的影响，同时可以作为保存材料研究超低温保存过程中的分子机理，是一种很重要的生理学和分子生物学研究材料。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种新的提高拟南芥保存效果的方法，以克服现有技术中拟南芥幼苗超低温保存恢复生长率低的缺点，进一步地完善其为植物玻璃化法超低温保存过程中的生理生化响应提供研究基础
为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现的。
一种提高拟南芥幼苗保存效果的方法，其特征在于，采用玻璃化超低温保存的方法对拟南芥幼苗进行保存，具体步骤如下：
1)装载液处理：室温下，将拟南芥幼苗在装载液中浸泡处理20～30分钟后移除装载液；
2)玻璃化溶液处理：在0～25℃下使用玻璃化溶液浸泡处理拟南芥幼苗40～60分钟；
3)液氮保存：保持拟南芥幼苗在玻璃化溶液中浸泡的状态，并置于液氮中保存；
所述玻璃化溶液为含有0.1～0.5g/L碳纳米管的玻璃化冷冻保护液。
本发明中所述MS培养液含有1900mg/L KNO3，1650mg/L NH4NO3，170mg/L KH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，37.3mg/L Na2-EDTA，27.8mg/LFeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，余量为水。所述MS培养液的pH为5.8。
优选地，所述拟南芥幼苗为拟南芥种子在预培养基上培养1-5天的拟南芥幼苗。
更优选地，所述拟南芥幼苗为拟南芥种子在预培养基培养60h的拟南芥幼苗。
优选地，所述拟南芥幼苗为在MS固体培养基上培养60h后的拟南芥幼苗，在MS培养基上培养的方法为：将拟南芥种子置于MS固体培养基上，每天先进行光照培养8～12h，光强100～200μmol/m2，温度20～27℃，每天光照培养剩余时间进行黑暗培养，黑暗培养温度为20～25℃，循环每天光照培养和黑暗培养至60h。
本发明中所述MS固体培养基含有1900mg/L KNO3，1650mg/L NH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，37.3mg/L Na2-EDTA，27.8mg/LFeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素， 2mg/L甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，30g/L蔗糖，10g/L琼脂粉，余量为水。所述MS固体培养基的pH为5.8。
本发明中所述拟南芥幼苗在MS培养基上培养的方法为每天采用光照培养和黑暗培养交替的形式直至达60h。如，每天先进行8h的光照培养，然后进行16h的黑暗培养，如此循环直至第三天再培养12h，第三天的12h为光照培养。
优选地，室温下，将拟南芥幼苗在装载液中浸泡处理20分钟后移除装载液。
优选地，在0℃下使用玻璃化溶液浸泡处理拟南芥幼苗50分钟。
更优选地，所述拟南芥幼苗在MS培养基上培养的方法为：先进行8h光照培养，光强100～200μmol/m2，温度25℃；再进行16h黑暗培养，黑暗培养温度为20℃。更优选地，光强为150μmol/m2。
优选地，所述拟南芥种子为先经春化处理过的拟南芥种子，所述春化处理为将所述拟南芥种子在0～10℃下放置24～72h。
优选地，所述春化处理为将所述拟南芥种子在4～6℃下放置40～50h。
更优选地，所述春化处理为将所述拟南芥种子在4℃下放置48h。
优选地，所述拟南芥种子在春化处理前先经消毒处理，消毒处理工艺为：将拟南芥种子用65～75％乙醇浸泡10～30s，再使用无菌水冲洗，然后使用含15～25wt％的NaClO和0～0.03wt％的吐温20的水溶液浸泡5～15分钟，并使用无菌水冲洗。本发明中所述的65～75％乙醇是指含乙醇的水溶液，其中的百分含量为体积百分含量。
更优选地，所述消毒处理工艺为：将拟南芥种子用70％乙醇消毒15s，无菌水冲洗4～6遍，然后使用含15～25wt％的NaClO和0～0.03wt％的吐温20的水溶液浸泡10分钟，并使用无菌水冲洗5～6遍。
更优选地，所述消毒处理工艺为：将拟南芥种子用70％乙醇消毒15s，无菌水冲洗4遍，然后使用含20wt％的NaClO和0.01wt％的吐温20的水溶液浸泡10分钟，并使用无菌水冲洗6遍。
优选地，所述装载液为含有1～2mol/L丙三醇和0.3～0.5mol/L蔗糖的MS培养液。
更优选地，所述装载液为含有1～2mol/L丙三醇和0.3～0.5mol/L蔗糖的MS培养液。
本发明中所述拟南芥种子可以为现有技术中所有类型的拟南芥种子类型。
优选地，所述拟南芥种子为哥伦比亚生态型拟南芥种子，如：Arabidopsis thaliana ecotype Col-0型。
优选地，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖和0.1～0.5g/L碳纳米管的MS培养液。
更优选地，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖和0.1～0.3g/L碳纳米管的MS培养液。
更优选地，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖和0.1g/L碳纳米管的MS培养液，或所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖和0.3g/L碳纳米管的MS培养液。
本发明还公开了一种拟南芥幼苗的解冻及再培养方法，所述拟南芥幼苗为采用上述所述方法保存的拟南芥幼苗，所述拟南芥幼苗的解冻及再培养方法为将拟南芥幼苗从液氮中取出，先水浴解冻，然后去除玻璃化溶液后用洗涤液洗涤，最后转入MS固体培养基中恢复培养。
优选地，水浴解冻的条件为在30～40℃的水浴中解冻60～120s，用洗涤液洗涤的工艺为：用洗涤液在室温下浸泡30～50分钟，并每隔5～10分钟换一次洗涤液，所述洗涤液为含有1.0～1.5mol/L蔗糖的MS培养液。
更优选地，水浴解冻的条件为在40℃的水浴中解冻90s，用洗涤液洗涤的工艺为：用洗涤液在室温下浸泡40分钟，并每隔10分钟换一次洗涤液，所述洗涤液为含有1.2mol/L蔗糖的MS培养液。
优选地，所述恢复培养工艺为将拟南芥幼苗每天先光照培养8～12h，光强100～200μmol/m2，培养温度为20～27℃，每天中剩余时间采用黑暗培养，黑暗培养温度为20～25℃。
更优选地，所述恢复培养工艺为将拟南芥幼苗每天先光照培养8h，光强150μmol/m2，培养温度为25℃，每天中剩余时间采用黑暗培养，黑暗培养温度为20℃
更优选地，为了证明本发明中方法的保存效果，采用恢复生长率来统计，具体地，在恢复培养的第15天统计成活的拟南芥幼苗的数量，并计算恢复生长率，所述恢复生长率为：成活的幼苗数量/幼苗总数量×100％。
根据纳米科学原理，向冷冻保护剂中添加纳米材料能够有效提高冷冻保护剂的粘度和热导率，改变冰晶的形成状况、减少对细胞的伤害。本发明对拟南芥幼苗，特别是拟南芥种子萌发60h幼苗的在玻璃化超低温条件下保存，先用装载液处理，然后采用玻璃化溶液处理，最后在液氮中超低温保存，其中玻璃化溶液又为添加了碳纳米管的玻璃化溶液，这种外源物质的添加配合方法中的其他工艺，能够有效的提高拟南芥幼苗的保存效果。按照本发明公开的保存方法，采用浓度为0.1～0.5g/L的碳纳米管作为外源物质使用时，将60h拟南芥幼苗玻璃化超低温保存后的恢复生长率显著提高，本发明中公开的方法对拟南芥幼苗的保存效果优化显著，通过添加碳纳米管作为外源物质对植物玻璃化超低温保存起到促进作用。
附图说明
图1为实验组和对照组中60h拟南芥幼苗超低温保存恢复生长照片。
其中，图1中：
左列为对照组中60h拟南芥幼苗超低温保存恢复生长照片；
右列为实验组中60h拟南芥幼苗超低温保存恢复生长照片；
第一排到第三排中玻璃化溶液中添加的碳纳米管的含量分别为0.1g/L、0.3g/L和0.5g/L。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明实施例中所用的拟南芥种子为拟南芥哥伦比亚生态型种子，Arabidopsis thaliana ecotype Col-0型。
本发明实施例中所用实验试剂的配方为：
1)MS培养液为：MS培养液含有1900mg/L KNO3，1650mg/L NH4NO3，170mg/L KH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，37.3mg/L Na2-EDTA，27.8mg/L FeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，余量为水，所述MS培养液的pH为5.8。
2)MS固体培养基为：MS固体培养基含有1900mg/L KNO3，1650mg/L NH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，37.3mg/L Na2-EDTA，27.8mg/LFeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，30g/L蔗糖，10g/L琼脂粉，余量为水，所述MS固体培养基的pH为5.8。
3)装载液为：含有2mol/L丙三醇和0.4mol/L蔗糖的MS培养液。
4)玻璃化溶液为：含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖和0.1～0.5g/L碳纳米管的MS培养液。
5)洗涤液为含有1.2mol/L蔗糖的MS培养液。
实施例1
1)拟南芥幼苗的获得：将拟南芥种子用70％乙醇消毒15s，无菌水冲洗4遍后再用含20wt％NaClO和0.01wt％Tween20的水溶液消毒10min，无菌水冲洗6遍；然后将消毒后的种子在4℃春化48h，置于MS固体培养基上培养，培养条件为每天光照培养8h，光强150μmol/m2，培养温度25℃；然后黑暗培养16h，培养温度为20℃，总共将种子培养60h，获得60h苗龄的拟南芥幼苗。
2)将60h拟南芥幼苗分为实验组和对照组，每个组分别设3个平行实验，将50株幼苗放入装有1mL装载液的2mL冷冻管中，室温处理20min；将装载液吸除，加入玻璃化溶液，0℃处理50min；将冷冻管投入液氮中保存1h。
实验组的玻璃化溶液中分别含有0.1g/L、0.3g/L、0.5g/L的碳纳米管。
具体地，实验组组1的玻璃化溶液中含有0.1g/L的碳纳米管。
实验组组2的玻璃化溶液中含有0.3g/L的碳纳米管。
实验组组3的玻璃化溶液中含有0.5g/L的碳纳米管。
对照组中不同之处在于玻璃化溶液不含有碳纳米管，其他与实验组相同。
3)冷冻管于液氮中保存1h后，取出冷冻管，快速放入40℃水浴锅中，解冻90s，并不时轻轻摇动；将玻璃化溶液吸除，加入洗涤液，室温处理40min，每隔10min换一次洗涤液；洗涤后的幼苗移到MS固体培养基中，放入植物培养箱，培养箱各项参数同种子萌发条件，即每天光照培养8h，光强150μmol/m2，培养温度25℃；然后黑暗培养16h，培养温度为20℃；拟南芥幼苗恢复培养第15天，计算并比较实验组和对照组内60h拟南芥幼苗的恢复生长率。
实验组与对照组60h苗龄的拟南芥幼苗的恢复生长率见表1。
表1
3.实验结果
由表1可知，将浓度为0.1g/L、0.3g/L、0.5g/L的碳纳米管添加到萌发60h拟南芥幼苗超低温保存的玻璃化溶液中，分别使60h拟南芥幼苗恢复生长率由25.54％变为到48.97％、36.31％和26.31％。其中以浓度为0.1g/L的碳纳米管的改善效果最为显著，具体见图1。
实施例2
本实施例主要是对拟南芥幼苗在各个阶段的参数进行测试分析，从而论证外源碳纳米管对拟南芥60h幼苗超低温保存过程中膜损伤及氧化应激的调控作用。
1)实验材料：组1中材料为：拟南芥按照本发明中实施例1记载方法萌发60h的幼苗
组2中材料为：实施例1中玻璃化溶液处理后的幼苗；
组3为：实施例1中方法玻璃化超低温保存后解冻后的幼苗；
组4为实施例1中经洗涤液洗涤后幼苗；
组5为实施例1中恢复培养处理后的幼苗。
2)测试方法：
1、拟南芥60h幼苗超低温保存过程中相对电导率的测定
取上述5个组中的拟南芥幼苗，每组3个。分别用重蒸馏水冲洗数次，然后用滤纸吸干表面水分，装入50mL烧杯，加入50mL重蒸馏水在25℃下浸泡2h，用Thermo Orion FE30型电导仪测其电导R。测毕，将各烧杯用塑料薄膜封口，置于沸水浴中煮沸15min后取出冷却至25℃，摇匀，测电导值R0，根据下列公式计算相对电导率：
2、拟南芥60h幼苗超低温保存过程中MDA测定
称取0.2g上述各组材料放入预冷的研钵中，加入5mL10％三氯乙酸TCA研磨至匀浆，倒入10mL离心管中5000rpm离心10min，上清液为MDA待测液。吸取上清液2mL加入2mL0.6％硫代巴比妥酸TBA溶液，混匀后于沸水浴中反应30min，迅速冷却后5000rpm离心10min，在600nm、532nm、450nm波长下分别比色测定。以2mL蒸馏水调零。
提取液中MDA浓度C(μmoL/L)＝6.45(OD532–OD600)–0.56OD450，换算成每克材料中MDA的含量为：
3、拟南芥60h幼苗超低温保存过程中过氧化氢含量的测定
按照南京建成过氧化氢含量测定试剂盒说明书测定。
3)实验结果
利用相对电导率、丙二醛和过氧化氢含量研究了外源碳纳米管对60h拟南芥幼苗超低温保存过程中的细胞膜损伤、膜脂过氧化和氧化胁迫的调控作用。实验结果显示，添加0.1g/L碳纳米管材料后显著降低了超低温保存过程中的细胞膜损伤程度，有效降低了过氧化氢含量，从而减弱了膜脂过氧化程度。从生理生化和细胞学角度印证了0.1g/L碳纳米管对60h拟南芥幼苗超低温保存过程中的保护作用。具体结果见表2、表3和表4。其中表2、表3 和表4中对照组即为实施例1中对照组，实验组为实施例1中添加0.1g/L碳纳米管的实验组。
表2对照组与实验组相对电导率的变化
| 相对电导率(％) | 组1 | 组2 | 组3 | 组4 | 组5 |
| 对照组 | 29.78 | 80.09 | 86.78 | 84.23 | 83.72 |
| 实验组 | 29.78 | 72.48 | 77.48 | 75.69 | 74.33 |
表3对照组与实验组丙二醛含量的变化
| 丙二醛含量(μmol/L) | 组1 | 组2 | 组3 | 组4 | 组5 |
| 对照组 | 5.33 | 7.54 | 8.95 | 7.23 | 6.34 |
| 实验组 | 5.33 | 6.67 | 7.4 | 6.54 | 5.96 |
表4对照组与实验组过氧化氢含量的变化
| 过氧化氢含量(μmol/g) | 组1 | 组2 | 组3 | 组4 | 组5 |
| 对照组 | 307 | 434.91 | 577.44 | 550.44 | 522.03 |
| 实验组 | 307 | 378.63 | 504.35 | 493.61 | 465.21 |
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种提高拟南芥幼苗保存效果的方法，其特征在于，采用玻璃化超低温保存的方法对拟南芥幼苗进行保存，具体步骤如下：
1)装载液处理：室温下，将拟南芥幼苗在装载液中浸泡处理20～30分钟后移除装载液；
2)玻璃化溶液处理：在0～25℃下使用玻璃化溶液浸泡处理拟南芥幼苗40～60分钟；
3)液氮保存：保持拟南芥幼苗在玻璃化溶液中浸泡的状态，并置于液氮中保存；
所述玻璃化溶液为含有0.1～0.5g/L碳纳米管的玻璃化冷冻保护液。
2.如权利要求1所述提高拟南芥幼苗保存效果的方法，其特征在于，所述拟南芥幼苗为在MS固体培养基上培养60h后的拟南芥幼苗，在MS培养基上培养的方法为：将拟南芥种子置于MS固体培养基上，每天先进行光照培养8～12h，光强100～200μmol/m2，温度20～27℃，每天光照培养剩余时间进行黑暗培养，黑暗培养温度为20～25℃，循环每天光照培养和黑暗培养至60h。
3.如权利要求2所述提高拟南芥幼苗保存效果的方法，其特征在于，所述拟南芥种子为先经春化处理过的拟南芥种子，所述春化处理为将所述拟南芥种子在0～10℃下放置24～72h。
4.如权利要求3所述提高拟南芥幼苗保存效果的方法，其特征在于，所述春化处理为将所述拟南芥种子在4～6℃下放置40～50h。
5.如权利要求3所述提高拟南芥幼苗保存效果的方法，其特征在于，所述拟南芥种子在春化处理前先经消毒处理，消毒处理工艺为：将拟南芥种子用65～75％乙醇浸泡10～30s，再使用无菌水冲洗，然后使用含15～25wt％的NaClO和0～0.03wt％的吐温20的水溶液浸泡5～15分钟，并使用无菌水冲洗。
6.如权利要求1所述提高拟南芥幼苗保存效果的方法，其特征在于，所述装载液为含有1～2mol/L丙三醇和0.3～0.5mol/L蔗糖的MS培养液。
7.如权利要求1所述提高拟南芥幼苗保存效果的方法，其特征在于，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖和0.1～0.5g/L碳纳米管的MS培养液。
8.一种拟南芥幼苗的解冻及再培养方法，所述拟南芥幼苗为采用如权利要求1～7任一权利要求所述方法保存的拟南芥幼苗，所述拟南芥幼苗的解冻及再培养方法为将拟南芥幼苗从液氮中取出，先水浴解冻，然后去除玻璃化溶液后用洗涤液洗涤，最后转入MS固体培养基中恢复培养。
9.如权利要求8所述解冻及再培养方法，其特征在于，水浴解冻的条件为在30～40℃的水浴中解冻60～120s，用洗涤液洗涤的工艺为：用洗涤液在室温下浸泡30～50分钟，并每隔5～10分钟换一次洗涤液，所述洗涤液为含有1.0～1.5mol/L蔗糖的MS培养液。
10.如权利要求8所述解冻及再培养方法，其特征在于，所述恢复培养工艺为将拟南芥幼苗每天先光照培养8～12h，光强100～200μmol/m2，培养温度为20～27℃，每天中剩余时间采用黑暗培养，黑暗培养温度为20～25℃。
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