CN102823581A - 一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及玻璃化超低温保存领域，具体涉及一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法，为以拟南芥幼苗为实验对象，将外源物质添加到玻璃化溶液中用于拟南芥幼苗的玻璃化超低温保存，以不添加外源物质处理的拟南芥幼苗为对照，通过恢复生长率的比较评价外源物质的效果。本发明为促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法，结果准确，可重复性强，应用范围广，可成批量进行筛选，效率高，为外源物质的筛选提供了一条有效途径，为玻璃化超低温保存技术的优化提供了技术保证，将对植物种质资源保存起到指导作用。

Description

一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法

技术领域

本发明涉及玻璃化超低温保存领域，具体涉及一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法。

背景技术

种质资源（Germplasm resources）是决定生物种性并将其丰富的遗传信息从亲代传给子代的遗传物质的总称，是物种进化、遗传学研究和植物育种的物质基础。实现种质资源保存是我国社会、生态及经济发展的战略需求。

超低温保存（Cryopreservation）是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术。通常在液氮中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的生物学状态，达到长期保存种质的目的，超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期保存方式。

玻璃化法（Vitrification）超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液（Plant Vitrification Solutions，PVS）中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻璃化态，并以这种玻璃态在低温下保存。玻璃化法因操作简单快捷，成本低，适宜保存种类广泛，保存材料遗传性稳定，保存效果好等优点，是近十年来用于优良种质资源中长期保存的首选方法。

国内外先后对200多种植物的不同外植体进行了超低温保存技术研究，但有些植物（如热带植物或者含水量高的植物）恢复培养后成活率不高或根本不能成活，添加一定的外源物质有利于提高超低温保存成活率，但如何从众多可添加的外源物质中筛选出效果较好的几种，一般离体组织筛选外源物质，组织或细胞超低温保存后活性检测手段不够直接，并存在一定误差，而直接观察恢复生长情况又较慢，并且很多进行超低温保存的材料为珍稀濒危保护植物，不能用大量材料消耗去筛选有效的外源物质建立超低温保存体系，以上原因大大制约了有效外源物质筛选及超低温保存体系建立的效率。而拟南芥幼苗的玻璃化法超低温保存研究发现了一套超低温保存标准体系，用于筛选外源物质及作为研究对象进行深入的超低温保存机理研究，可为植物超低温保存技术体系的建立及优化提供科学的理论依据，最终实现快速高效的优良植物种质资源中长期离体保存。

发明内容

本发明的目的在于针对现有超低温保存体系的上述不足，提供一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法，为有效外源物质的筛选提供了一条新途径，对植物种质资源保存起到了指导的作用。

本发明首先公开了一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法，为以拟南芥幼苗为实验对象，将外源物质添加到玻璃化溶液中用于拟南芥幼苗的玻璃化超低温保存，以不添加外源物质处理的拟南芥幼苗为对照，通过恢复生长率的比较评价外源物质的效果。

较优的，所述筛选方法具体步骤如下：

1）拟南芥幼苗的获得：将拟南芥种子春化处理后，培养0～72h，获得不同苗龄的拟南芥幼苗；

2）将不同苗龄的拟南芥幼苗分为实验组和对照组进行玻璃化超低温保存，实验组的玻璃化溶液中添加外源物质，对照组不添加；

3）将实验组和对照组玻璃化超低温保存后的幼苗解冻、恢复培养后，比较实验组和对照组内苗龄相同的拟南芥幼苗的恢复生长率。

较优的，步骤1）所述拟南芥种子是经过消毒的拟南芥种子，所述消毒的方法为用65～75%乙醇消毒10～30s，无菌水冲洗2～4遍后再用含15～25wt%NaClO及0～0.03wt%Tween20的水溶液消毒5～15min，无菌水冲洗5～6遍。

更优的，步骤1）所述拟南芥种子是经过消毒的拟南芥种子，所述消毒的方法为用70%乙醇消毒15s，无菌水冲洗4遍后再用含20wt%NaClO及0.01wt%Tween 20的水溶液消毒10min，无菌水冲洗6遍。

较优的，步骤1）所述春化条件为0～10℃，春化处理时间为24～72h。

更优的，步骤1）所述春化条件为4℃，春化处理时间为48h。

较优的，步骤1）所述培养是在MS固体培养基上，每天先光照培养8～12h，光强100～200μmol m^-2，培养温度20～27℃；然后黑暗培养，培养温度为20～25℃。

更优的，步骤1）所述培养是在MS固体培养基上，每天先光照培养8h，光强150μmolm^-2，培养温度25℃；然后黑暗培养，培养温度为20℃。

春化后的种子在MS固体培养基上的培养，按一天（24h）为单位，先进行光照培养，光照后，当天剩余的时间进行黑暗培养，一天结束后，再进行第二天的光照培养，这样光照培养与黑暗培养交替进行。例如先光照培养8h，然后黑暗培养的时间为16h，如此交替进行。

较优的，步骤1)获得的拟南芥幼苗的苗龄分别为0、48、51、54、57、60、63、66、69、72h。

更优的，步骤1）获得的拟南芥幼苗的苗龄分别为60、63、66、69、72h。

最优的，步骤1）获得的拟南芥幼苗的苗龄分别为60h和72h。

较优的，步骤2）所述玻璃化超低温保存方法为：将拟南芥幼苗放入装载液中，室温处理20～30min；将装载液吸除后，加入玻璃化溶液0℃处理40～60min；将置于玻璃化溶液中的拟南芥幼苗放入液氮中保存0.5～2h。

更优的，步骤2）所述玻璃化超低温保存方法为：将拟南芥幼苗放入装载液中，室温处理20min；将装载液吸除后，加入玻璃化溶液0℃处理50min；将置于玻璃化溶液中的拟南芥幼苗放入液氮中保存1h。

较优的，步骤2）所述装载液为含有2M甘油，0.4M蔗糖的MS培养液；所述玻璃化溶液为含有30%w/v甘油，15%w/v乙二醇，15%w/v二甲基亚砜和0.4M蔗糖的MS培养液。

上述玻璃化溶液为对照组使用的，不包括外源物质的玻璃化溶液；实验组所使用的玻璃化溶液还需要在上述玻璃化溶液的基础上，加入待筛选的外源物质。

较优的，步骤3）所述解冻方法为：将超低温保存的拟南芥幼苗从液氮中取出，35～40℃水浴解冻60～120s；将玻璃化溶液吸除，加入洗涤液室温处理30～50min，每隔5～10min换一次洗涤液；所述洗涤液为含有1.0～1.2M蔗糖的MS培养液。

更优的，步骤3）所述解冻方法为：将超低温保存的拟南芥幼苗从液氮中取出，40°C水浴解冻90s；将玻璃化溶液吸除，加入洗涤液室温处理40min，每隔10min换一次洗涤液，所述洗涤液为含有1.2M蔗糖的MS培养液。

冷冻管于水浴锅中解冻时需要不时轻轻摇动。

步骤3）拟南芥幼苗的恢复培养条件范围同步骤1）拟南芥种子的培养条件，具体如下：

较优的，步骤3）所述恢复培养为将洗涤后的幼苗移到MS固体培养基中，每天先光照培养8～12h，光强100～200μmol m^-2，培养温度20～27℃；然后黑暗培养，培养温度为20～25℃。

更优的，步骤3）所述恢复培养为将洗涤后的幼苗移到MS固体培养基中，每天先光照培养8h，光强150μmol m^-2，培养温度25℃；然后黑暗培养，培养温度为20℃。

较优的，步骤3）在拟南芥幼苗恢复培养的第15天统计成活的拟南芥幼苗的数量，计算恢复生长率，所述恢复生长率=成活的幼苗数量/幼苗总数量×100%。

本发明筛选方法的标准为：比较苗龄相同的拟南芥幼苗未添加外源物质处理（对照组）和添加外源物质处理（实验组）后，恢复生长率的变化，使对照组和实验组恢复生长率变化较大的外源物质为有效的外源物质。较优的，比较60h苗龄的拟南芥幼苗未添加外源物质处理（对照组）和添加外源物质处理（实验组）的恢复生长率变化，60h苗龄拟南芥幼苗对照组的恢复生长率小于等于25%，添加外源物质处理后，使拟南芥幼苗恢复生长率增大到大于等于50%的外源物质为有效的外源物质。

较优的，本发明所使用的拟南芥为拟南芥哥伦比亚生态型（Arabidopsis thalianaecotype Col-0）。

较优的，步骤2）实验组和对照组内，苗龄相同的拟南芥幼苗分别设3～5个重复。

本发明所使用的MS固体培养基为1L培养基中含有1900mg KNO₃，1650mg NH₄NO₃，170mgKH₂PO₄，370mg MgSO₄·7H₂O，440mg CaCl₂·2H₂O（以上5种成分为大量元素），37.3mg Na₂-EDTA，27.8mg FeSO₄·7H₂O，100mg肌醇，0.5mg烟酸，0.5mg盐酸吡哆醇，0.1mg盐酸硫胺素，2mg甘氨酸，0.83mgKI，6.2mg H₃BO₃，22.3mg MnSO₄·4H₂O，8.6mg ZnSO₄·7H₂O，0.25mg Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg CuSO₄·5H₂O，0.025mg CoCl₂·6H₂O，30g蔗糖，10g琼脂粉，余量为水，调整培养基pH为5.8。

本发明所使用的MS培养液为1L培养基中含有1900mg KNO₃，1650mg NH₄NO₃，170mg KH₂PO₄，370mg MgSO₄·7H₂O，440mg CaCl₂·2H₂O（以上5种成分为大量元素），37.3mg Na₂EDTA，27.8mgFeSO₄·7H₂O，100mg肌醇，0.5mg烟酸，0.5mg盐酸吡哆醇，0.1mg盐酸硫胺素，2mg甘氨酸，0.83mgKI，6.2mg H₃BO₃，22.3mg MnSO₄·4H₂O，8.6mg ZnSO₄·7H₂O，0.25mg Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg CuSO₄·5H₂O，0.025mg CoCl₂·6H₂O，余量为水，调整培养基pH为5.8。

本发明第二方面还公开了抗坏血酸（VC）、脱落酸（ABA）、甜菜碱（GB）或还原型谷胱甘肽（GSH）在玻璃化超低温保存中的应用。

较优的，所述应用具体为抗坏血酸（VC）、脱落酸（ABA）、甜菜碱（GB）或还原型谷胱甘肽（GSH）作为玻璃化溶液外源物质的应用。

更优的，所述抗坏血酸的浓度为1mM、所述脱落酸的浓度为1μM、所述甜菜碱的浓度为10mM、所述还原型谷胱甘肽的浓度为0.16mM。

本发明筛选方法筛选到的外源物质能够有效提高拟南芥幼苗的恢复生长率，在拟南芥幼苗的玻璃化超低温保存中，将苗龄60h的拟南芥幼苗的恢复生长率提高2倍左右，或者将苗龄72h的拟南芥幼苗的恢复生长率从0提高到0以上，最高可以提高到14.3%。并且本发明以拟南芥作为研究对象，筛选得到了具有广泛超低温保存效果的外源物质，不仅可应用于拟南芥的超低温保存，还可以应用于其他植物物种的超低温保存，例如亚热带植物(大苞鞘石斛)或者热带植物（百子莲），或者还可以应用于不同植物外植体（例如胚性愈伤组织、原球茎等）的超低温保存，应用范围广。

可见，本发明的促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法，结果准确，可重复性强，应用范围广，可成批量进行筛选，效率高，为外源物质的筛选提供了一条有效途径，为玻璃化超低温保存技术的优化提供了技术保证，将对植物种质资源保存起到指导作用。

附图说明

图1：对照组拟南芥不同苗龄幼苗超低温保存恢复生长率变化趋势图

图2：对照组拟南芥不同苗龄幼苗超低温保存恢复生长照片

图3：不同外源物质对拟南芥萌发60h幼苗超低温保存后恢复生长率的影响（CK为未添加外源物质的超低温保存体系）

图4：不同外源物质对拟南芥萌发72h幼苗超低温保存后恢复生长率的影响

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

实施例1

1.实验材料

实验对象：拟南芥哥伦比亚生态型（Arabidopsis thaliana ecotype Col-0）。

实验试剂：

1）装载液：含有2M甘油，0.4M蔗糖的MS培养液；

2）玻璃化溶液：含有30%w/v甘油，15%w/v乙二醇，15%w/v二甲基亚砜和0.4M蔗糖的MS培养液；

3）洗涤液：添加有1.2M蔗糖的MS培养液和添加有1.0M蔗糖的MS培养液；

4）MS固体培养基：1L培养基中含有1900mg KNO₃，1650mg NH₄NO₃，170mg KH₂PO₄，370mgMgSO₄·7H₂O，440mg CaCl ₂·2H₂O，37.3mg Na₂-EDTA，27.8mg FeSO₄·7H₂O，100mg肌醇，0.5mg烟酸，0.5mg盐酸吡哆醇，0.1mg盐酸硫胺素，2mg甘氨酸，0.83mgKI，6.2mg H₃BO₃，22.3mgMnSO₄·4H₂O，8.6mg ZnSO₄·7H₂O，0.25mg Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg CuSO₄·5H₂O，0.025mg CoCl ₂·6H₂O，30g蔗糖，10g琼脂粉，余量为水，调整培养基pH为5.8；

5）MS培养液：1L培养基中含有1900mg KNO₃，1650mg NH₄NO₃，170mg KH₂PO₄，370mg MgSO₄·7H₂O，440mg CaCl₂·2H₂O，37.3mg Na₂-EDTA，27.8mg FeSO₄·7H₂O，100mg肌醇，0.5mg烟酸，0.5mg盐酸吡哆醇，0.1mg盐酸硫胺素，2mg甘氨酸，0.83mgKI，6.2mg H₃BO₃，22.3mg MnSO₄·4H₂O，8.6mg ZnSO₄·7H₂O，0.25mg Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg CuSO₄·5H₂O，0.025mg CoCl₂·6H₂O，余量为水，调整培养基pH为5.8。

2.筛选方法

1）拟南芥幼苗的获得：将拟南芥种子用70%乙醇消毒15s，无菌水冲洗4遍后再用含20wt%NaClO和0.01wt%Tween 20的水溶液消毒10min，无菌水冲洗6遍；然后将消毒后的种子在4℃春化48h，置于MS固体培养基上培养，培养条件为每天光照培养8h，光强150μmol m^-2，培养温度25℃；然后黑暗培养16h，培养温度为20℃，将种子培养0～72h（本实施例具体选取了培养0h、48h、51h、54h、57h、60h、63h、66h、69h、72h），获得不同苗龄的拟南芥幼苗。

2）将不同苗龄的拟南芥幼苗分为实验组和对照组，实验组和对照组同一苗龄的幼苗设3个平行，将50株幼苗放入装有1ml装载液的2ml冷冻管中，室温处理20min；将装载液吸除，加入玻璃化溶液，0°C处理50min；将冷冻管投入液氮中保存1h。

实验组的玻璃化溶液中添加有外源物质（1μM脱落酸Abscisic acid，ABA；1mM CaCl₂；10mM KNO₃；6mM硫辛酸Lipoic acid；0.16mM还原型谷胱甘肽GSH；1mM抗坏血酸VC；10mM甜菜碱Glycine betaine，GB；6mM聚乙烯吡咯烷酮PVP；0.1μM褪黑素Melatonin，见表1）。

3）冷冻管于液氮中保存1h后，取出冷冻管，快速放入35～40°C水浴锅中，解冻90s，并不时轻轻摇动；将玻璃化溶液吸除，加入洗涤液，室温处理30～40min，每隔5～10min换一次洗涤液；洗涤后的幼苗移到MS固体培养基中，放入植物培养箱，培养箱各项参数同种子萌发条件（每天光照培养12h，光强100μmol m^-2，培养温度20℃；然后黑暗培养12h，培养温度为25℃）；拟南芥幼苗恢复培养15天后，计算实验组和对照组内拟南芥幼苗的恢复生长率，并比较实验组和对照组内苗龄相同的拟南芥幼苗的恢复生长率。

对照组0～72h苗龄的拟南芥幼苗的恢复生长率曲线如图1所示。实验组60h苗龄和72h苗龄的拟南芥幼苗的恢复生长率见表2。

表1实验组玻璃化溶液中添加的外源物质

种类

ABA

CaCl2

KNO3

硫辛酸

GSH

VC

GB

PVP

褪黑素

浓度

1μM

1mM

10mM

6mM

0.16mM

1mM

10mM

6mM

0.1μM

表2不同组别和苗龄的拟南芥幼苗的恢复生长率

苗龄	组别	VC	ABA	GB	GSH
						60h	实验组恢复生长率	58.33%	58.16%	48.53%	45.96%
60h	对照组恢复生长率	23.21%	23.21%	23.21%	23.21%
						72h	实验组恢复生长率	4.5%	3%	7%	14.3%
72h	对照组恢复生长率	0	0	0	0

3.实验结果

（1）由图1对照组0～72h不同苗龄拟南芥幼苗的玻璃化法超低温保存后恢复生长率曲线可知，超低温保存恢复生长率随苗龄的增加而降低，多次重复试验后发现为标准的S型曲线。

（2）由图1可知，对照组60h苗龄拟南芥幼苗的恢复生长率为23.21%。在超低温保存的玻璃化溶液中分别添加外源物质（1μM脱落酸Abscisic acid，ABA；1mM CaCl₂；10mM KNO₃；6mM硫辛酸Lipoic acid；0.16mM还原型谷胱甘肽GSH；1mM抗坏血酸VC；10mM甜菜碱Glycinebetaine，GB；6mM聚乙烯吡咯烷酮PVP；0.1μM褪黑素Melatonin，见表1）后，统计实验组的恢复生长率，发现GSH、VC、GB、ABA、褪黑素和CaCl₂均使实验组60h苗龄的拟南芥幼苗恢复生长率有了不同程度的提高，经过多次重复实验验证得出VC、ABA、GB和GSH分别使未添加外源物质（对照组）的2.513、2.506、2.091和1.98倍。恢复生长率实验结果见表2，实验图片见图3。

（3）如表2可知，将4种外源物质1mM VC、1μM ABA、10mM GB和0.16mM GSH添加到萌发72h幼苗超低温保存的玻璃化溶液中，GSH、GB、VC和ABA分别使恢复生长率由0提高到14.3%、7%、4.5%和3%，在组合外源物质优化实验中，以减半浓度添加的VC+GSH组合改善效果最为显著（见图4）。

实施例2外源物质促进玻璃化超低温保存的验证实验

1.实验对象

1）百子莲（Agapanthus praecox ssp.orientalis）胚性愈伤组织、大苞鞘石斛（Dendrobiumwardianum）原球茎。

2）外源物质：1mM VC、1μM ABA、10mM GB和0.16mM GSH。

3）1/2MS固体培养基为将MS固体培养基成分中的大量元素减半，其余成分不变的固体培养基。

4）1/2MS培养液为将MS培养液成分中的大量元素减半，其余成分不变的培养液。

2.实验方法

2.1外源物质促进大苞鞘石斛原球茎玻璃化超低温保存的验证实验

2.1.1大苞鞘石斛原球茎的制备

大苞鞘石斛原球茎的获取：取大苞鞘石斛授粉后6个月（成熟）且未开裂的蒴果（材料由中国林业科学研究院花卉中心提供）。

大苞鞘石斛原球茎的处理：用75%酒精擦拭果实表面，洗洁精清洗30min后自来水冲洗1h，移置于超净工作台上，用75%酒精消毒1min，0.1%HgCl₂溶液消毒15min，并经常摇动，无菌水清洗5次，无菌滤纸吸干表面水分，在靠近果实基部切开一小口，把粉末状的种胚均匀铺撒于含0.2mg/L的6-BA，0.2mg/L的NAA，2wt%蔗糖的1/2MS固体培养基上，培养室温度25±1℃，光照强度2336lux，光照时间16h/d。30d后将种子萌发产生的原球茎转移至含有0.2mg/L的6-BA，0.2mg/L的NAA，2wt%蔗糖的1/2MS原球茎增殖培养固体培养基上，每隔30d继代1次，连续继代2次（60d）后，取直径大小约2-3mm原球茎为试验材料，进行超低温保存试验研究。

2.1.2大苞鞘石斛原球茎超低温保存实验（对照组）：

在含有0.8M蔗糖的1/2MS固体培养基上4℃低温锻炼6d，转至装载液中室温下高渗预处理40min，所述装载液为含有2M甘油，0.4M蔗糖的1/2MS培养液，高渗预处理后吸除装载液；在0℃下采用玻璃化溶液对预处理后的球茎再次脱水40min，除去玻璃化溶液（所述玻璃化溶液为含有30%w/v甘油，15%w/v乙二醇，15%w/v二甲基亚砜和0.4M蔗糖的1/2MS培养液），转入装有1/2体积新鲜玻璃化溶液的冷冻管中并迅速投入液氮。液氮保存1h后在40℃水浴中快速解冻1min，利用含1.2M蔗糖的1/2MS培养液洗涤3次，每次10min。原球茎在恢复培养基培养30d后统计恢复生长率，所述恢复培养基为含有0.2mg/L的6-BA，0.5mg/L的NAA，2wt%蔗糖的1/2MS固体培养基。

2.1.3大苞鞘石斛原球茎超低温保存实验（实验组）：

其它过程不变，在玻璃化溶液中添加外源物质，外源物质的种类、在玻璃化溶液中的浓度分别为1mM VC、1μM ABA、10mM GB和0.16mM GSH。

2.2外源物质促进玻百子莲胚性愈伤组织璃化超低温保存的验证实验

2.2.1百子莲胚性愈伤组织的获取：

百子莲胚性愈伤组织的制备方法参考文献：蓝百合快速繁殖技术的研究（范现丽，上海交通大学硕士学位论文，2009）中记载方法，获得百子莲胚性愈伤组织。

2.2.2百子莲胚性愈伤组织超低温保存实验：（对照组）

将继代培养20d，易碎、松散的胚性愈伤组织在装载液室温处理40min，装载液为含有2M丙三醇、0.4M蔗糖、10mM KNO₃的MS培养液；再转入装有玻璃化溶液的冷冻管中0℃条件下脱水处理40min，玻璃化溶液为含有30%w/v甘油，15%w/v乙二醇，15%w/v二甲基亚砜和0.4M蔗糖的MS培养液迅速投入液氮进行超低温保存。液氮保存1h后在40℃水浴解冻1min，用含有1.2M蔗糖和10mM KNO₃的1/2MS培养液洗涤3次，每次10min，在恢复培养基中培养30d后统计恢复生长率，恢复培养基为含有1.5mg/L毒莠定（PIC）和3wt%蔗糖的MS培养基。

2.2.3百子莲胚性愈伤组织超低温保存实验：（实验组）

其它过程不变，在玻璃化溶液中添加外源物质，外源物质的种类、在玻璃化溶液中的浓度分别为1mM VC、1μM ABA、10mM GB和0.16mM GSH。

对照组和实验组各设3组平行试验。

3.实验结果

表3不同植物外植体超低温保存的恢复生长率

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (11)

1.一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法，其特征在于，为以拟南芥幼苗为实验对象，将外源物质添加到玻璃化溶液中用于拟南芥幼苗的玻璃化超低温保存，以不添加外源物质处理的拟南芥幼苗为对照，通过恢复生长率的比较评价外源物质的效果。

2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）拟南芥幼苗的获得：将拟南芥种子春化处理后，培养0～72h，获得不同苗龄的拟南芥幼苗；

2）将不同苗龄的拟南芥幼苗分为实验组和对照组进行玻璃化超低温保存，实验组的玻璃化溶液中添加外源物质，对照组不添加；

3）将实验组和对照组玻璃化超低温保存后的幼苗解冻、恢复培养后，比较实验组和对照组内苗龄相同的拟南芥幼苗的恢复生长率。

3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤1）所述春化条件为0～10℃，春化处理时间为24～72h。

4.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤1）所述培养是在MS固体培养基上，每天先光照培养8～12h，光强100～200μmol m^-2，培养温度20～27℃；然后黑暗培养，培养温度为20～25℃。

5.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)获得的拟南芥幼苗的苗龄分别为0、48、51、54、57、60、63、66、69、72h。

6.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤2）所述玻璃化超低温保存方法为：将拟南芥幼苗放入装载液中，室温处理20～30min；将装载液吸除后，加入玻璃化溶液0℃处理40～60min；将置于玻璃化溶液中的拟南芥幼苗放入液氮中保存0.5～2h。

7.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤2）所述装载液为含有2M甘油，0.4M蔗糖的MS培养液；所述玻璃化溶液为含有30%w/v甘油，15%w/v乙二醇，15%w/v二甲基亚砜和0.4M蔗糖的MS培养液。

8.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤3）所述解冻方法为：将超低温保存的拟南芥幼苗从液氮中取出，35～40℃水浴解冻60～120s；将玻璃化溶液吸除，加入洗涤液室温处理30～50min，每隔5～10min换一次洗涤液；所述洗涤液为含有1.0～1.2M蔗糖的MS培养液。

9.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤3）所述恢复培养为将洗涤后的幼苗移到MS固体培养基中，每天先光照培养8～12h，光强100～200μmol m^-2，培养温度20～27℃；然后黑暗培养，培养温度为20～25℃。

10.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，在拟南芥幼苗恢复培养的第15天统计成活的拟南芥幼苗的数量，计算恢复生长率，所述恢复生长率=成活的幼苗数量/幼苗总数量×100%。

11.权利要求1-10任一权利要求所述筛选方法筛选获得的抗坏血酸、脱落酸、甜菜碱、还原型谷胱甘肽之任一在玻璃化超低温保存中的应用。

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