CN109566606A - 一种利用蛋白酶抑制剂提高拟南芥幼苗玻璃化法冻存效果的方法 - Google Patents

一种利用蛋白酶抑制剂提高拟南芥幼苗玻璃化法冻存效果的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用蛋白酶抑制剂提高拟南芥幼苗玻璃化法冻存效果的方法，为采用从百子莲中克隆到的基因，表达存化提取相应蛋白SPI(Serpin丝氨酸蛋白酶抑制剂)，此蛋白具有抗胁迫保护的作用，用此蛋白酶抑制剂的玻璃化溶液处理拟南芥幼苗以提高其保存效果，具体包括：预培养、装载液处理、玻璃化溶液处理和液氮保存步骤，其中所述玻璃化溶液含有0～25μL/mL SPI。本发明中公开的方法对植物超低温玻璃化保存效果优化显著，通过添加SPI蛋白作为外源物质对植物玻璃化超低温保存起到促进作用。

Description

一种利用蛋白酶抑制剂提高拟南芥幼苗玻璃化法冻存效果的 方法
技术领域
本发明涉及植物或其局部的保存技术领域，具体涉及一种利用蛋白酶抑制剂提高拟南芥幼苗玻璃化法冻存效果的方法。
背景技术
超低温保存是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术。通常在液氮中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的生物学状态，达到长期保存种质的目的，超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期保存方式。玻璃化法超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻璃化态，并以这种玻璃态在低温下保存。玻璃化法因操作简单快捷，成本低，适宜保存种类广泛，保存材料遗传性稳定，保存效果好等优点，是近十年来用于优良种质资源中长期保存的首选方法。
丝氨酸蛋白酶是最大的一类蛋白酶家族,广泛参与植物的衰老、细胞分化、超敏反应、蛋白质降解和加工等生理过程。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)属于十字花科拟南芥属一年生草本植物。拟南芥作为植物界公认的模式植物，其优势在于生长期短、植株小、结子多、自花受粉，保证基因高度纯合。在已有的超低温保存研究中发现，拟南芥萌发60h幼苗可以作为筛选不同的外源添加物质超低温保存效果的模型，同时由于基因组已知，可以作为研究植物超低温保存过程中的分子机理的首选材料。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种利用蛋白酶抑制剂提高拟南芥幼苗玻璃化法冻存效果的方法，以克服现有技术中植物及其组织中长期保存难以实现，以及超低温保存的植物或其组织恢复生长率低的缺点。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种利用蛋白酶抑制剂提高拟南芥幼苗玻璃化法冻存效果的方法，采用玻璃化超低温保存的方法对拟南芥幼苗进行保存，具体步骤如下：
A、预培养：将拟南芥种子播在预培养基上，进行春化，然后光照培养；
B、装载液处理：室温下，将步骤A处理后的拟南芥幼苗放置在装载液中浸泡处理40～60分钟后，去除装载液；
C、玻璃化溶液处理：将步骤B处理后的拟南芥幼苗在0～25℃下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理40～60分钟；
D、液氮保存：经步骤C处理后，保持拟南芥幼苗浸泡在玻璃化溶液中的状态，并将其置于液氮中保存；
所述玻璃化溶液中添加浓度0～25μL/mL的SPI；所述SPI的添加浓度不为0μL/mL。
本发明采用从百子莲中克隆到的基因，表达存化提取相应蛋白SPI(Serpin丝氨酸蛋白酶抑制剂)，此蛋白SPI具有抗胁迫保护的作用。
优选地，所述玻璃化溶液中添加浓度为5-25μL/mL的SPI；更优选玻璃化溶液中添加浓度为20μL/mL的SPI。
优选地，步骤A中，所述预培养基为含有0.4～0.8mol/L蔗糖的MS固体培养基。
更优选地，所述预培养培养基为含有0.5mol/L蔗糖的MS固体培养基。
优选地，步骤A中，所述春化条件包括：0～10℃下春化2-4天；所述光照培养的条件包括：20-30℃下光照培养50-70h。
更优选地，所述所述春化条件包括：4℃下春化3天；所述光照培养的条件包括：250℃下光照培养60h。
优选地，步骤B中，所述装载液为含有1～2mol/L丙三醇、0.3～0.5mol/L蔗糖的MS培养液。
更优选地，所述装载液为含有2mol/L丙三醇、0.4mol/L蔗糖的MS培养液。
优选地，步骤C中，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖的MS培养液。
更优选地，步骤B中，所述浸泡处理时间为40分钟；
步骤C中，所述浸泡脱水处理时间为50分钟。
优选地，所述步骤D中，保存温度为-196℃。
优选地，所述MS培养液配方采用(Murashige and Skoog，1962)含有1900mg/LKNO3，1650mg/L NH4NO3，170mg/L KH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，37.3mg/L Na2-EDTA，27.8mg/L FeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，余量为水。所述MS培养液的pH为5.6-6.2。
优选地，所述MS固体培养基含有1900mg/L KNO3，1650mg/L NH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，37.3mg/L Na2-EDTA，27.8mg/LFeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，30g/L蔗糖，10g/L琼脂粉，余量为水。所述MS固体培养基的pH为5.8。
本发明还提供了一种拟南芥幼苗的解冻及再培养方法，包括如下步骤：
将采用前述方法保存的拟南芥幼苗从液氮中取出，先水浴解冻，然后去除玻璃化溶液后用洗涤液洗涤，最后转入恢复培养基中恢复培养。
优选地，所述水浴解冻的条件为在40℃的水浴中解冻90s。
优选地，所述洗涤液为含有1.0～1.5mol/L蔗糖的MS培养液，所述洗涤方法为：用洗涤液在室温下将拟南芥幼苗浸泡10～40分钟。
更优选地，所述洗涤方法为：用洗涤液在室温下将拟南芥幼苗浸泡40分钟，每10分钟更换一次洗涤液。
优选地，所述恢复培养基为含有30g/L蔗糖的MS培养基。
为了证明本发明中方法的保存效果，采用相对成活率来统计，具体地，更优选地，为了证明本发明中方法的保存效果，采用恢复生长率来统计。具体地，在恢复培养的第15d统计拟南芥萌发60h幼苗的成活数量，并计算恢复生长率，所述恢复生长率为：成活的幼苗数量/幼苗总数量×100％。
本研究运用植物中提取纯化的丝氨酸蛋白酶抑制剂可以有效的降低PCD的发生，从而提高超低温冻存后的存活率。且相比于其他蛋白酶抑制剂如半胱氨酸蛋白酶抑制剂等，有更加明显的作用。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明向冷冻保护剂中添加蛋白酶抑制剂能够有效提高冷冻保护剂的保护效果，改变冰晶的形成状况，减少对细胞的伤害。本发明对拟南芥幼苗，特别是拟南芥种子萌发60h幼苗在玻璃化法超低温保存中，先用装载液处理，然后采用玻璃化溶液处理，最后在液氮中超低温保存，其中玻璃化溶液又为添加了SPI蛋白酶抑制剂的玻璃化溶液，这种外源物质的添加配合方法中的其他工艺，能够有效地提高拟南芥萌发60h幼苗的保存效果，将成活率由不添加时的48.19％提高至82.30％。本发明中公开的方法对拟南芥萌发60h幼苗的保存效果优化显著，通过添加SPI蛋白酶抑制剂作为外源物质对植物玻璃化超低温保存起到促进作用。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1中实验组和对照组中拟南芥幼苗超低温保存恢复生长照片；其中，图1a为对照组中拟南芥萌发60h幼苗超低温保存恢复生长照片；图1b为实验组组3中拟南芥萌发60h幼苗超低温保存恢复生长照片；
图2为实施例1中添加SPI蛋白酶抑制剂对拟南芥萌发60h幼苗冻存率的影响；其中实验组为实验组组3。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明实施例中实验试剂的配方如下：
1)MS培养液为：MS培养液含有1900mg/L KNO3，1650mg/L NH4NO3，170mg/L KH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，37.3mg/L Na2-EDTA，27.8mg/L FeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，余量为水，所述MS培养液的pH为5.8。
2)MS固体培养基为：MS固体培养基含有1900mg/L KNO3，1650mg/L NH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，37.3mg/L Na2-EDTA，27.8mg/LFeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，30g/L蔗糖，10g/L琼脂粉，余量为水，所述MS固体培养基的pH为5.8。
3)预培养基为含有0.5mol/L蔗糖的MS培养基。
4)装载液为：含有2mol/L丙三醇、0.4mol/L蔗糖的MS培养液。
5)玻璃化溶液为：含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖的MS培养液。
6)洗涤液为含有1.2mol/L蔗糖的MS培养液。
7)恢复培养基为含30g/L蔗糖的MS培养基。
实施例1
1)将拟南芥种子播在预培养基上，放置在4℃冰箱中春化3d，然后放置于25℃光照培养箱，连续光照培养60h；
2)转至装载液中室温浸泡处理40分钟；
3)转入玻璃化溶液中在0℃条件下脱水处理50分钟；
4)最后置于液氮中超低温保存。
步骤3)结束后，无需除去玻璃化溶液，直接将浸泡于玻璃化溶液中的拟南芥幼苗置于液氮中超低温保存。
按照上述步骤将拟南芥幼苗分为实验组和对照组。
实验组的玻璃化溶液中分别含有5μL/mL、10μL/mL、20μL/mL、25μL/mL的SPI抑制剂。
具体地，实验组组1的玻璃化溶液中含有5μL/mL的SPI抑制剂；
实验组组2的玻璃化溶液中含有10μL/mL的SPI抑制剂；
实验组组3的玻璃化溶液中含有20μL/mL的SPI抑制剂；
实验组组4的玻璃化溶液中含有25μL/mL的SPI抑制剂；
对照组中不同之处在于玻璃化溶液中不含有SPI，其他与实验组相同。
在液氮中保存1小时后取出，快速放入40℃水浴锅中，解冻90s，并不时轻轻摇动；将玻璃化溶液吸除，加入洗涤液，室温处理40min，每隔10min换一次洗涤液；洗涤后的拟南芥幼苗移到恢复培养基培养14天后，计算并比较实验组和对照组内拟南芥幼苗的相对成活率。
实验组与对照组中拟南芥幼苗的相对成活率见表1。
表1
实验结果：
由表1可知，将浓度为5μL/mL、10μL/mL、20μL/mL和25μL/mL的SPI抑制剂添加到拟南芥幼苗超低温保存的玻璃化溶液中，可使拟南芥幼苗恢复生长率由48.19％提高到76.24％、78.02％、82.30％和77.05％。其中，以添加20μL/mL的SPI提高效果最为显著，具体效果见图1和图2。
对比例1
本对比例提供了一种拟南芥幼苗玻璃化法冻存的方法，与实施例1的方法基本相同，不同之处仅在于：本对比例采用半胱氨酸蛋白酶抑制剂(5μL/mL)代替SPI抑制剂。复苏后的拟南芥幼苗的相对成活率仅为70.86％。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (9)

1.一种利用蛋白酶抑制剂提高拟南芥幼苗玻璃化法冻存效果的方法，其特征在于，采用玻璃化超低温保存的方法对拟南芥幼苗进行保存，具体步骤如下：
A、预培养：将拟南芥种子播在预培养基上，进行春化，然后光照培养；
B、装载液处理：室温下，将步骤A处理后拟南芥幼苗放置在装载液中浸泡处理40～60分钟后去除装载液；
C、玻璃化溶液处理：将步骤B处理后的拟南芥幼苗在0～25℃下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理40～60分钟；
D、液氮保存：经步骤C处理后，保持拟南芥幼苗浸泡在玻璃化溶液中的状态，并将其置于液氮中保存；
所述玻璃化溶液中添加0～25μL/mL的SPI；所述SPI的添加浓度不为0μL/mL。
2.如权利要求1所述利用蛋白酶抑制剂提高拟南芥幼苗玻璃化法冻存效果的方法，其特征在于，步骤A中，所述预培养基为含有0.4～0.8mol/L蔗糖的MS固体培养基。
3.如权利要求1所述利用蛋白酶抑制剂提高拟南芥幼苗玻璃化法冻存效果的方法，其特征在于，步骤A中，所述春化条件包括：0～10℃下春化2-4天；所述光照培养的条件包括：20-30℃下光照培养50-70h。
4.如权利要求1所述利用蛋白酶抑制剂提高拟南芥幼苗玻璃化法冻存效果的方法，其特征在于，步骤B中，所述装载液为含有1～2mol/L丙三醇、0.3～0.5mol/L蔗糖的MS培养液。
5.如权利要求1所述利用蛋白酶抑制剂提高拟南芥幼苗玻璃化法冻存效果的方法，其特征在于，步骤C中，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖的MS培养液。
6.一种拟南芥幼苗的解冻及再培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
将采用权利要求1～5任一项所述方法保存的拟南芥幼苗从液氮中取出，先水浴解冻，然后去除玻璃化溶液后用洗涤液洗涤，最后转入恢复培养基中恢复培养。
7.如权利要求6所述的拟南芥幼苗的解冻及再培养方法，其特征在于，所述水浴解冻的条件为在40℃的水浴中解冻90s。
8.如权利要求6所述的拟南芥幼苗的解冻及再培养方法，其特征在于，所述洗涤液为含有1.0～1.5mol/L蔗糖的MS培养液，所述洗涤方法为：用洗涤液在室温下将拟南芥幼苗浸泡40分钟。
9.如权利要求6所述的拟南芥幼苗的解冻及再培养方法，其特征在于，所述恢复培养基为含有30g/L蔗糖的MS培养基。
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