CN109258464A - 一种通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法，包括新疆雪莲愈伤组织在黑暗环境中预处理，然后将预处理得到的新疆雪莲愈伤组织在低气压环境中进行光照培养。本发明通过对环境因子的控制获得较高的褪黑素含量，该方法避免了使用野生材料受原料获取难或者季节限制等因素，可以常年累月的生产褪黑素，而且为以后人工调控褪黑素生物合成提供原料和初步的工艺。

Description

一种通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法。
背景技术
褪黑素是一种吲哚类色胺，化学名称为N-乙酰-5-甲氧基色胺，在动物中由松果体合成与分泌，参与动物的昼夜节律的调节。由于褪黑素最早是在松果体里发现的，很长一段时间内人们都认为褪黑素是动物专有的一种神经激素。其实在植物中很早就发现了褪黑素的存在，只是一直未引起人们的重视。早在1969年Jackson就在绣球百合的胚乳细胞中检测出褪黑素。到1995年为止，不同学者在不同国家和地区的被子植物中应用高效液相色谱和放射免疫法检测出褪黑素。至今研究表明，褪黑素几乎存在于所有的植物和植物产品中。例如，褪黑素普遍存在于蔬菜水果、中草药、多种经济作物(如玉米，大米，小麦，大麦，燕麦)等高等植物的根、茎、叶、果实、种子等各种组织器官中。黑素在植物中的含量较低，为ng/g的水平，但是发现一些药用植物中褪黑素的含量很高，其种子中褪黑素含量甚至达到了μg/g的水平。在植物的不同种、不同品种间褪黑素的含量差异巨大，且与植物的生长阶段、地理位置、器官及收获时间密切相关。但是目前有关褪黑素在植物中的功能研究还不是很多。已有的研究表明褪黑素在植物中可能的作用有调节光周期、参与生长调节、清除活性氧、提高抗氧化酶活性等。
对于植物中褪黑素的合成途径和动物中相类似这种说法，到目前为止仍存在争议。最近研究发现，在水稻中褪黑素合成的前两步与动物中的合成途径是相反的：第一步酶促反应产物并不是5-羟色氨酸，而是色胺，其是由色氨酸脱羧酶催化形成的，随后色胺在色胺-5-梭化酶的作用下形成5-羟色胺。由此可见，植物中褪黑素的合成途径比动物中更复杂，有待于进一步的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法，以新疆雪莲愈伤组织为原料，采用一系列环境处理手段，从而获取植物来源褪黑素，为合成褪黑素提供新的途径。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法，其特征在于，包括新疆雪莲愈伤组织在黑暗环境中预处理，然后将预处理得到的新疆雪莲愈伤组织在低气压环境中进行光照培养。
进一步地，所述的黑暗环境中预处理温度为5-20℃。
进一步地，所述的黑暗环境中预处理时间为2-8天。
进一步地，所述的低气压为40-70kpa。
更进一步地，所述的光照强度为1500-3500Lux。
更进一步地，所述的光照周期为每24h给光4-16h。
优选的，通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法具体为：新疆雪莲愈伤组织在黑暗环境中预处理，处理的温度为15℃，处理的时间为4天；然后将预处理得到的新疆雪莲愈伤组织在大气压力值为50kPa，光周期为每24h给光8h，光照强度为2000Lux的环境中进行光照培养。
具体地，所述的新疆雪莲愈伤组织是由新疆雪莲种子萌发后的子叶作为外植体，在培养基上进行培养即得。
具体地，所述的培养基包含2.5mg/L的a-萘乙酸和0.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS培养基。
更具体地，所述的培养温度为25℃±2℃，光照强度为3000Lux、光周期16h。
本发明进行蛇足石杉插条生根的方法，具有以下优点：
本发明通过新疆雪莲愈伤组织生物合成褪黑素，通过对环境因子的控制获得较高的褪黑素含量。方法避免了使用野生材料受原料获取难或者季节限制等因素，可以常年累月的生产褪黑素，而且为以后人工调控褪黑素生物合成提供原料和初步的工艺。
具体实施方式
以下所述的MS液体培养基也称MS培养基。MS培养基是常用的基本培养基，是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。
采用HPLC法检测新疆雪莲愈伤组织中褪黑素的含量，具体操作：在液氮冷却下用研磨机将新疆雪莲愈伤组织磨成冻干粉,冷冻干燥机进行72h冷冻干燥。称取0.5g冻干粉,置于10mL离心管中,加入5mL色谱级甲醇,涡旋振荡后浸提10h。然后用超声波清洗机低温超声15min,随后在4℃、16 099.2×g下离心15min,收集上清液并用0.22μm滤膜过滤,置于新离心管中。再加入5mL色谱级甲醇到原离心管中,涡旋混匀进行二次离心。将两次上清液混合,低温旋转蒸发(≤30℃)。将蒸干物用3mL 5％的甲醇水溶液重新溶解,涡旋振荡,过0.22μm有机滤膜。然后进行固相萃取,将过滤好的上清液过C18(Agilent Bond Elut)固相萃取小柱,按活化、平衡、上样、淋洗、洗脱的顺序分别分5次加入共5mL的甲醇、超纯水、样品、5％甲醇溶液和90％甲醇溶液,速度控制在1mL·min-1,最后将洗脱液定容到1mL,过0.22μm的有机滤膜后加入到一次性的液相进样管中,使用三重四级杆高效液相色谱质谱联用仪检测。
以下结合实施例和对比例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
1、新疆雪莲愈伤组织的获取
取适量新疆雪莲种子，将种子浸泡于0.1％HgCl2中8分钟，然后取出后，用无菌水冲洗5次进行表面灭菌，再转接到MS培养基上并放于培养室中进行萌发；将萌发后长出的子叶作为外植体，切割成0.3cm2大小，然后接到含2.5mg/L的a-萘乙酸和0.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS培养基上进行培养，培养室萌发的条件与MS培养基的培养条件相同，均为：温度25℃±2℃，光照强度为3000Lux、光周期16小时；培养16天后获得新疆雪莲愈伤组织用于褪黑素的合成。
2、褪黑素的合成
将预处理得到的新疆雪莲愈伤组织放置在黑暗的环境中预处理，处理的温度为5-20℃，处理的时间为4天；然后取出后放置在大气压力值为50KPa，温度与预处理的温度一致的环境中进行褪黑素的诱导合成，光周期为每24h给光8h，光照强度为2000Lux。3天后新疆雪莲愈伤组织中褪黑素的含量如表1。
表1 不同处理温度对新疆雪莲愈伤组织褪黑素生物合成的影响
处理温度(℃) 5 10 15 20
褪黑素含量(ng/g鲜重) 106 117 180 156
实施例2：
1、新疆雪莲愈伤组织的获取
同实施例1。
2、褪黑素的合成
同实施例1，但与实施例1不同的是：预处理和褪黑素的合成的温度为15℃，褪黑素的合成时间为2-8天；检测新疆雪莲愈伤组织中褪黑素的含量如表2。
表2 不同黑暗处理时间对新疆雪莲愈伤组织褪黑素生物合成的影响
处理时间(天) 2 4 6 8
褪黑素含量(ng/g鲜重) 135 180 176 112
实施例3：
1、新疆雪莲愈伤组织的获取
同实施例1。
2、褪黑素的生物合成
同实施例2，但与实施例2不同的是：褪黑素的合成时间为4天；大气压力值为40-70KPa，检测新疆雪莲愈伤组织中褪黑素的含量如表3。
表3 不同大气压力压力对新疆雪莲愈伤组织褪黑素生物合成的影响
大气压力(kPa) 40 50 60 70
褪黑素含量(ng/g鲜重) 121 180 169 143
实施例4：
1、新疆雪莲愈伤组织的获取
同实施例1。
2、褪黑素的生物合成
同实施例3，但与实施例3不同的是：大气压力值为50KPa，光周期为每24h给光4-16h，检测新疆雪莲愈伤组织中褪黑素的含量如表4。
表4 不同光周期对新疆雪莲愈伤组织褪黑素生物合成的影响
光周期(小时) 4 8 12 16
褪黑素含量(ng/g鲜重) 158 180 133 94
实施例5：
1、新疆雪莲愈伤组织的获取
同实施例1。
2、褪黑素的合成
同实施例4，但与实施例4不同的是：光周期为每24h给光8h，光照强度为1500-3500Lux，检测新疆雪莲愈伤组织中褪黑素的含量如表4。
表4 不同光照强度对新疆雪莲愈伤组织褪黑素生物合成的影响
处理光照强度(Lux) 1000 1500 2000 2500
褪黑素含量(ng/g鲜重) 166 180 145 137

Claims (10)

1.一种通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法，其特征在于，包括新疆雪莲愈伤组织在黑暗环境中预处理，然后将预处理得到的新疆雪莲愈伤组织在低气压环境中进行光照培养。
2.如权利要求1所述的通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法，其特征在于，所述的黑暗环境中预处理温度为5-20℃。
3.如权利要求1所述的通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法，其特征在于，所述的黑暗环境中预处理时间为2-8天。
4.如权利要求1所述的通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法，其特征在于，所述的低气压为40-70kpa。
5.如权利要求1所述的通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法，其特征在于，所述的光照强度为1500-3500Lux。
6.如权利要求1所述的通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法，其特征在于，所述的光照周期为每24h给光4-16h。
7.如权利要求1所述的通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法，其特征在于，所述的合成褪黑素方法具体为：
新疆雪莲愈伤组织在黑暗环境中预处理，处理的温度为15℃，处理的时间为4天；然后将预处理得到的新疆雪莲愈伤组织在大气压力值为50kPa，光周期为每24h给光8h，光照强度为2000Lux的环境中进行光照培养。
8.如权利要求1所述的通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法，其特征在于，所述的新疆雪莲愈伤组织是由新疆雪莲种子萌发后的子叶作为外植体，在培养基上进行培养即得。
9.如权利要求8所述的通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法，其特征在于，所述的培养基包含2.5mg/L的a-萘乙酸和0.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS培养基。
10.如权利要求8所述通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法，其特征在于，所述的培养温度为25℃±2℃，光照强度为3000Lux、光周期16h。
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