CN1500880A - 一种通过细胞培养生产雪莲多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
一种雪莲多糖的细胞培养生产方法，该方法步骤涉及：采用雪莲外植体(如叶、花、茎)或用种子萌发幼苗在MS或MP培养基上诱导愈伤组织，该愈伤组织细胞用于生产雪莲多糖；产雪莲多糖细胞的固体或悬浮培养使用的培养基是MS或MP培养基；用石油醚、NaHCO3和醋酸铅进行雪莲细胞培养物多糖类化合物的分离、提取和制备。试验证明用本方法其细胞培养物中总多糖类化合物的含量为细胞干重的7～10％，总多糖生产率为1～2g/升。
Description
技术领域
本发明属于植物细胞工程领域，具体地说涉及一种高产多糖的雪莲细胞系的细胞培养方法，还包括多糖的分离、提取、制备工艺方法。
背景技术
雪莲花又名雪莲，是我国三类珍稀植物，早在《西北域记》和《相园小识》中，就有关于雪莲的记载，并把二者合而为一，统称雪莲花。作为雪莲花，原生植物名称随产地而别，如西藏等地用三指雪兔子S.tridactylaSch.Bip.；四川、云南等地用绵头雪兔子S.lanicps Hand.-Mazz.；甘肃、青海等地用水母雪莲S.medusa Maxim；青海也用雪兔子S.gossypiphora D.Don.；新疆用天山雪莲(雪荷花)S.involucrata Kar.et Kir，等，但均属于菊科风毛菊属Saussurea雪兔子亚属Subgen Eriocorye植物，且一般分布于海拔4,000米以上的高山流石滩上。
雪莲花是生长在海拔4000米以上的高山雪线附近的民间常用的一类名贵药用植物，属多年生草本植物。雪莲花性温，味微苦，入肝、脾、肾三经。具有散寒除湿，活血通经、强筋助阳、抗炎、镇痛、收缩子宫等功能，民间用于治疗风湿性关节炎，延缓衰老、动脉硬化、终止妊娠，妇女小腹冷痛、闭经、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、阳萎等症。雪莲花原生植物种类较多，虽然据中药文献记载均可同等入药，但其品质有优劣之分。如雪兔子为大体型的雪莲，产量较大；绵头雪兔子(又称绵头雪莲花)也是一种较大体型的雪莲，产量大；水母雪兔子(又称水母雪莲花)为一种小体型的雪莲；三指雪兔子(又称三指雪莲花)也为一种小体型的雪莲。据有关报道，在以上几种雪莲中销售量最大的是新疆天山雪莲(雪荷花)S.involucrata Kar.et Kir.和水母雪莲S.medusa Maxim。
雪莲为多年生草本植物，自然生长缓慢，采集野生雪莲入药对野生资源具有严重的破坏而且还会造成对资源生态环境的破坏。为此，我国早已将雪莲列为国家三级保护植物。野生雪莲中有效成分——多糖类化合物含量低，通常只有干重的0.7％左右。为此，迫切需要解决药用雪莲资源问题。然而，通过人工培育解决雪莲资源问题是一种有效的途径，可是目前尚未见到有关用细胞培养高产雪莲多糖类化合物这方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种雪莲高产多糖细胞系的细胞培养生产方法，该方法步骤涉及：
1.雪莲愈伤组织诱导及细胞系的建立：
采集雪莲外植体，如叶、花、茎或用种子萌发幼苗，在含有激素的1/2 MS培养基上诱导愈伤组织。
愈伤组织在含激素的MS培养基上继代培养。 通过目视法分别获得的黄色和红色愈伤组织细胞系为高产雪莲多糖的细胞系。
2.雪莲高产多糖细胞系的细胞固体或悬浮液体培养生产多糖类化合物：
雪莲细胞接种于如表4所示的含有激素MS或MP培养基中，pH值在5.2～5.8，接种量为1.5～5.0％(W/V，g.fw/ML)；接种后放入光或暗培养室中培养12～14天，温度为20～27℃；进行培养。实验证明在固体或悬浮培养条件下，用本发明提供的细胞系和培养基，其细胞生长速率可达18～25g干重/升，多糖类化合物的含量可达培养物干重的7～10％。
3.本发明的目的还在于提供一种雪莲细胞培养物多糖类化合物的分离、提取、制备工艺。
雪莲细胞培养物置于干燥器中，60℃烘干后，用粉碎机粉碎成20目的粗粉。用石油醚进行脱色、脱脂。然后，加入NaHCO3，用微波低火浸提10分钟，60℃水浴处理1小时。将所得滤液减压浓缩至原体积的1/5，加入10％醋酸铅进行沉淀，除去酚性物质、蛋白质、鞣质等杂质，用10％Na2SO4除去多余的铅离子。再加入4％活性炭(m/v)，60℃下水浴脱色1小时。加入无水乙醇、丙酮反复沉淀，离心，低温真空干燥，得到多糖。
本发明较已有技术相比具有如下优点及积极效果：
(1)雪莲为国家保护植物，利用植物细胞大量培养生产雪莲多糖化合物，走工业化生产的途径，可有限地保护野生资源，保护生态环境。
(2)应用细胞大量培养生产多糖类化合物，与栽培和野生的植物相比，可获得稳定的质量和产量，不受自然条件的限制的影响。
(3)不占用耕地面积，只需要占用有限的厂房和培养室。
(4)通过人工调节与控制细胞的生长和次生产物的合成；可极大地提高多糖类化合物的产量
(5)该项技术，不使用光照，在暗中进行细胞培养，故可节省电力，减少成本价格。产量与含量稳定，污染率极低。
具体实施方式
为了更好理解本发明，通过如下实施例予以进一步说明，但并非是对本发明的限定。
实施例1：雪莲愈伤组织诱导及细胞系的建立
本发明对多种雪莲进行了愈伤组织的细胞培养，其结果如表1所示。本实施例是优选水母雪莲(Saussurea medusa)为例对本技术予以说明，同时，本技术方案也适用于其他雪莲的细胞培养。
采集雪莲外植体，如叶、花、茎或用种子萌发幼苗诱导愈伤组织。外植体先用自来水冲洗数小时，然后用杀菌剂浸泡杀菌，用无菌水洗5-6次，每次2-3分钟，消毒后接种于如表4所示的含激素的1/2MS培养基上，置于24-26℃光照培养。经两周培养后，即可在外植体的切口部位形成愈伤组织。愈伤组织在于如表4所示的含激素的MS培养基上继代培养，培养温度为24-26℃，在有光照条件下可以获得雪莲高产多糖细胞系，但是在暗培养条件下，获得的雪莲高产多糖细胞系效果更好，结果如表1，2所示。继代培养为15d转代一次，选取黄色和红色愈伤组织细胞系为高产雪莲多糖的细胞系，结果如表2所示。
实施例2：雪莲高产多糖细胞系的细胞固体或悬浮液体培养物多糖类化合物的分离、提取、制备工艺：
雪莲细胞接种于如表4所示的含有激素的MS或MP培养基中，pH值在5.2～5.8，固体培养时，培养基中加入0.7-1.0％琼脂。培养基高压消毒后，接种，接种量为1.5～5.0％(W/V，g.fw/ML)；接种后放入光或暗培养室中培养12～14天，温度为20～27℃；进行培养。收集雪莲细胞培养物，置于干燥器中，60℃烘干后，用粉碎机粉碎成20目的粗粉。用石油醚进行萃取，得到脱色、脱脂后的雪莲细胞粉。
然后以1∶30(g∶ml)的比例加入1％的NaHCO3提取液，在微波条件下，低火浸提10分钟。60℃水浴处理1小时。反复提取至无碱溶性多糖为止，过程中用Molisch反应检测提取的完全程度。将所得滤液合并，减压浓缩至原体积的1/5，加入等体积的Sevag试剂(氯仿∶正丁醇＝5∶1)去除游离的蛋白。再加入4％活性炭(w/v)，60℃下水浴脱色1小时。先后加入7倍体积的无水乙醇、丙酮反复沉淀，离心。低温真空干燥，得到总多糖。多糖含量用蒽酮-浓硫酸法测定。
实验证明在固体或悬浮培养条件下，用本发明提供的细胞系和培养基，其细胞生长速率可达18～25g干重/升，多糖类化合物的含量可达培养物干重的7～10％。
按本发明使用MS或MP培养基，蔗糖浓度为10～40g/L(最佳30g/L)，调pH值为5.8，琼脂浓度为0.7％。用100ml三角瓶，每瓶装培养液30ml。高压消毒，压力为1.0kg/CM2，20min。接入高产多糖细胞系，接种量为3.0％，放入暗培养室培养，温度为24±1℃。培养15天后每瓶鲜重可达10g，(悬浮培养12天，每瓶鲜重可达8g)。细胞培养物中的多糖经分离提取后，并与天然植株中提取的多糖类化合物进行对照结果如下：
表1 几种雪莲愈伤组织细胞生长及多糖含量的比较：
| 愈伤组织 | 细胞生长量(干重，g/L) | 多糖产量(g/L) | 多糖含量(％)a | ||||
| 光照培养 | 暗培养 | 光照培养 | 暗培养 | 光照培养 | 暗培养 | 野生 | |
| 天山雪莲(S.involucrata)水母雪莲(S.medusa)雪兔子(S.gossypiphora)三指雪兔子(S.ridactyla)绵头雪兔子(S.anicps) | 11.514.814.514.714.2 | 11.714.714.414.814.5 | 0.560.720.580.570.49 | 0.800.980.870.870.91 | 4.924.874.043.833.44 | 5.706.726.045.916.33 | 0.810.710.680.700.69 |
a％愈伤组织干重.
表2 水母雪莲细胞黄色系与红色系、白色系及天然植株多糖含量及特征性的比较
| 培养物 | 细胞生长量(干重，g/L) | 多糖产量(g/L) | 多糖含量(％)a | ||||
| 光照培养 | 暗培养 | 光照培养 | 暗培养 | 光照培养 | 暗培养 | ||
| 天然植株白色系黄色系红色系 | 10.1523.8017.13 | 10.0323.3316.73 | 0.080.891.19 | 0.081.371.82 | 0.745.205.00 | 0.768.217.80 | 0.71 |
a％愈伤组织干重
表3 水母雪莲细胞黄色系与红色系、白色系愈伤组织特征性的比较
愈伤系 特征
白色系 结构松软，色泽淡白，水渍状，生长快，培养后期出现轻微褐化
黄色系 培养前期结构松散，生长快；培养后期结构略致密，质地略硬
本系有时黄色与绿色互变，黄酮形成的最高峰在培养的第10-20d
红色系 培养前期结构较松散，生长快；培养后期结构较致密，质地较硬
表4.MS、MP二种培养基成分组成
MS MP
mg/L mg/L
NH4NO3 1,650 800
KNO3 1,900 1,000
KH2PO4 170 170
MgSO4·7H2O 370 370
CaCl2·2H2O 440 220
FeSO4·7H2O 27.85 13.7
Na2-EDTA 37.25 18.5
MnSO4·4H2O 22.3 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6 10
H3BO3 6.2 6.2
KI 0.83 --
NaMoO4·2H2O 0.25 0.25
CuSO4·5H2O 0.025 0.2
CoCl2·6H2O 0.025 --
蔗糖 30,000 45,000
葡萄糖 --- 15,000
甘氨酸 2 1
盐酸硫胺素 0.4 0.4
烟酸 0.5 0.5
肌醇 100 100
pH 5.2-5.8 5.2-5.8
注：1、MP培养基是从MS培养基修饰得到的。对多糖的生产，MP培养基优于MS培养基
2、用来诱导愈伤组织，在1/2MS培养基上添加的激素，采用NAA，IAA，2，4-D，KT，BA，它们可以在0.01-3.0mg/L范围内以不同浓度分别组合，实验证明0.05-0.1mg/L BA与0.5-1mg/L NAA的组合为最佳。
3、用来培养愈伤组织，在MS或MP培养基上添加的激素，采用NAA，IAA，2，4-D，KT，BA它们可以在0.01-3.0mg/L范围内以不同浓度分别组合，实验证明0.5-1mg/L BA与1-2mg/L NAA的组合为最佳。
4、用来培养细胞，在MS或MP培养基上添加的激素，采用NAA，IAA，2，4-D，KT，BA它们可以在0.01-3.0mg/L范围内以不同浓度分别组合，实验证明0.2-0.4mg/L BA与2-3mg/L NAA的组合为最佳。
Claims (8)
1.一种雪莲多糖的细胞培养生产方法，该方法步骤涉及：
采用雪莲外植体(如叶、花、茎)或用种子萌发幼苗在含激素的MS培养基上诱导愈伤组织，该愈伤组织用于细胞培养生产雪莲多糖；产雪莲多糖细胞的固体或悬浮培养使用的培养基是MS或MP培养基；用石油醚、NaHCO3和醋酸铅进行雪莲细胞培养物多糖类化合物的分离、提取和制备。
2.根据权利要求1所述的方法，在含激素的MS培养基上诱导愈伤组织是指在1/2MS培养基上添加的激素，激素有NAA，IAA，2，4-D，KT，BA，它们使用的浓度范围在0.01-3.0mg/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其中诱导愈伤组织采用的激素，优选0.05-0.1mg/L BA与0.5-1mg/L NAA的组合。
4.根据权利要求1所述的方法，愈伤组织用于细胞培养生产雪莲多糖，其中愈伤组织细胞是指继代培养在含激素的MP培养基上诱导产生的黄色和红色的愈伤组织细胞，培养基中使用的激素和其浓度为0.5-1mg/LBA与1-2mg/L NAA的组合。
5.据权利要求1所述的方法，MS或MP培养基的组成分如表4所示。
6.根据权利要求1所述的方法，其中产雪莲多糖细胞的固体或悬浮培养的条件是：在MS或MP培养基中含有0.2-0.4mg/L BA与2-3mg/LNAA激素的组合，pH值为5.2～5.8；接种量为1.5～5.0％(W/V，g.fw/ML)；培养温度为20～27℃；培养时间12～14天，接种后细胞培养置入有光或暗室中培养，
7.根据权利要求1所述的方法，其中用石油醚、NaHCO3和醋酸铅进行雪莲细胞培养物多糖类化合物的分离、提取和制备，具体方法步骤是：将雪莲细胞培养物置于干燥器中，60℃烘干；用石油醚萃取，得到脱色、脱脂后的雪莲细胞粉。然后以1∶30(g∶ml)的比例加入1％的NaHCO3提取液，在微波条件下，低火浸提10分钟，60℃水浴处理1小时，将所得滤液减压浓缩至原体积的1/5，加入等体积的Sevag试剂(氯仿∶正丁醇＝5∶1)去除游离的蛋白。再加入4％活性炭(w/v)，60℃下水浴脱色1小时。先后加入7倍体积的无水乙醇、丙酮沉淀，离心，低温真空干燥，得到总多糖。
8.根据权利要求1，2，3，4和5所述的方法，任选一项或多项在细胞培养制备药用雪莲多糖中的应用。
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