CN103484422B - 一种生产富含黃酮和多糖的雪莲培养物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产富含黃酮和多糖的雪莲培养物的方法，包括以下步骤：先将雪莲外植体用自来水冲洗，然后用杀菌剂浸泡杀菌，再用无菌水冲洗，然后接种于含植物激素的1/2MS培养基上24～26℃培养12～15d，即在外植体的切口部位形成愈伤组织，将愈伤组织在基本培养基上经过继代培养，每12～15d转代一次，选取浅红色愈伤组织的细胞系为高产雪莲多糖的细胞系；将所述细胞系在添加秋水仙碱的基本培养基中进行培养获得多倍体细胞系；将所述雪莲多倍体细胞系接种于合成培养基中培养得到富含雪莲次生代谢产物的细胞。本发明可稳定实现含黃酮和多糖等雪莲次生代谢产物的工业化生产，生产成本低，培养周期短，不受自然条件的影响。

Description

一种生产富含黃酮和多糖的雪莲培养物的方法

技术领域

本发明涉及一种生产雪莲次生代谢产物的方法，具体地，涉及一种生产富含黃酮和多糖的雪莲培养物的方法。

背景技术

雪莲(SaussureamedusaMaxim)，是我国一种名贵植物药材，产于我国甘肃、青海、西藏、新疆等地的高海拔山区的雪域之中，具有散寒除湿、壮阳补血、抗炎镇痛等作用，民间用于治疗风湿性关节炎、阳萎、妇女月经不调、高山不适应症等。药理研究证明，雪莲具有抗风湿镇痛、强心、终止妊娠、清除自由基及抗疲劳、解痉、降压和平喘、抑制病毒复制、抑制染色体损伤、促进辐射损伤修复、促创面愈合抗炎等作用。最近日本研究人员发现，从雪莲提取的木质体(lignan)类化合物，具有抗HIV、抗肿瘤和降血压的作用。在新疆，雪莲药材每年的需求量在百吨以上，而天然雪莲资源已经严重匮乏，人工栽培还未成功，造成雪莲药材严重供不应求。为保护国家珍稀植物，中国已在2001年明令禁止采挖天然雪莲、肉苁蓉等植物，更造成了雪莲药材的短缺。

野生雪莲中有效成分—多糖类化合物含量低，通常只有干重的0.7％左右。为此，迫切需要解决药用雪莲资源问题。然而，通过人工培育解决雪莲资源问题是一种有效的途径，可是目前尚未见到有关用细胞培养高产雪莲多糖类化合物这方面的文献报道。

中国发明专利申请(公开号CN1340611A，公开日2002年03月20日，申请号00123740.3)公开了一种水母雪莲高产黄酮细胞系，用本发明提供的细胞系和培养基，其细胞生长速率为35～40g干重/升/月，黄酮类化合物的含量为培养物干重的6～7％，虽然具有较好的细胞生长特性和较高的生物合成黄酮的能力，但仍存在以下不足：(1)黄酮含量还较低；(2)细胞聚集培养尺寸大于Smm就可能导致黄酮含量的下降；(3)细胞的遗传稳定性较差。

中国发明专利申请(公开号CN1424395A，公开日2003年06年18日，申请号02156868.5)公开了一种建立稳定高产次级代谢产物黄酮的雪莲细胞系的方法，其利用60Co-γ射线照射、紫外光线照射等手段诱变处理原始雪莲细胞系，以提高雪莲细胞中黄酮的含量，获得了一株稳定高产雪莲细胞系，可连续传代50代，细胞的培养密度和黄酮含量一直维持在20g(干重)/L和12％左右，该细胞系适应能力强，可以在18℃～30℃环境中生长，最适培养温度范围为20℃～25℃，但是该专利文献未说明细胞聚集生长对黄酮合成的影响。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种生产富含黃酮和多糖的雪莲培养物的方法。本发明可稳定实现含黃酮和多糖等雪莲次生代谢产物的工业化生产，生产成本低，培养周期短，不受自然条件的影响。

本发明的目的通过以下技术方案实现，一种富含黃酮和多糖的雪莲培养物的生产方法，包括以下步骤：

步骤(1)，雪莲种子经过萌发获得雪莲植株，将所述雪莲植株作为外植体，先用自来水冲洗，然后用杀菌剂浸泡杀菌，再用无菌水冲洗，然后接种于含植物激素的1/2MS培养基上24～26℃培养，经12～15d培养后，即可在外植体的切口部位形成愈伤组织，将所述愈伤组织在基本培养基上经过继代培养，每12～15d转代一次，选取浅红色愈伤组织的细胞系为高产雪莲黃酮和多糖的细胞系；

步骤(2)，将所述细胞系在添加秋水仙碱的基本培养基中进行培养获得雪莲多倍体细胞系；

步骤(3)，将所述雪莲多倍体细胞系接种于合成培养基中培养得到富含雪莲黃酮和多糖的细胞，即得；

步骤(1)中，所述植物激素为生长素和/或细胞分裂素，所述生长素为2,4-二氯苯氧乙酸或萘乙酸，所述细胞分裂素为6-苄基腺嘌呤或激动素。

优选的，步骤(1)中，所述1/2MS培养基上24～26℃培养为无光照的暗培养。

更优选的，步骤(1)中，所述无菌水冲洗的次数为5～6次，每次2～3分钟。

更优选的，步骤(2)和步骤(3)之间还包括以下步骤：将所述雪莲多倍体细胞系进行扩增培养。

在本发明中，在有光照条件下可以获得雪莲高产多糖细胞系，但是在暗培养条件下，获得的雪莲高产多糖细胞系效果更好。

本发明的雪莲细胞系具有以下特征：颜色为粉红色，结构紧密，黄酮含量为细胞干重的15～20％左右，细胞聚集生长的大小为5～30mm，细胞的培养密度可达23～25g(干重)/L培养基，黄酮产量一般为2.5～3.Og/L培养基，该细胞系可用于制各中药原料药雪莲黄酮和多糖等雪莲次生代谢产物。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)雪莲是国家保护植物，而且雪莲资源有限，生长条件苛刻，人工引种难度极大，且植种周期极长，用工厂化的雪莲细胞培养技术，可有效保护环境和资源；

(2)雪莲细胞培养不受自然条件限制，生长快，产量与含量稳定，产品质量可控性好，符合现代中药的发展趋势；

(3)本发明建立的雪莲细胞系黄酮产量大，黄酮含量占细胞干重的15～20％左右，培养密度高，可达23～25g(干重)/L培养基，而且培养周期短；

(4)遗传特性稳定，在连续传代培养过程中，细胞合成黄酮的能力不退化；

(5)应用细胞大量培养生产黃酮和多糖类化合物，通过人工调节与控制细胞的生长和次生产物的合成，可极大地提高多糖类化合物和黄酮化合物的产量，与栽培和野生的植物相比，质量和产量稳定；

(6)可不使用光照，在暗中进行细胞培养，可节省电力，降低成本。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1、

本实施例涉及一种富含黃酮和多糖的雪莲培养物的生产方法，包括以下步骤：

步骤(1)，雪莲种子经过萌发获得雪莲植株，将雪莲植株作为外植体，先用自来水冲洗，然后用杀菌剂浸泡杀菌，再用无菌水冲洗5次，每次2分钟，然后接种于含2,4-二氯苯氧乙酸的1/2MS培养基上24℃光照培养，经12d培养后，即可在外植体的切口部位形成愈伤组织，将愈伤组织在基本培养基上经过继代培养，每15d转代一次，选取浅红色愈伤组织的细胞系为高产雪莲多糖的细胞系；

步骤(2)，将上述细胞系在添加秋水仙碱的基本培养基中进行培养获得多倍体细胞系；

步骤(3)，将上述雪莲多倍体细胞系接种于合成培养基中培养得到富含雪莲次生代谢产物的细胞，即得。

实施例2、

本实施例涉及一种富含黃酮和多糖的雪莲培养物的生产方法，包括以下步骤：

步骤(1)，雪莲种子经过萌发获得雪莲植株，将雪莲植株作为外植体，先用自来水冲洗，然后用杀菌剂浸泡杀菌，再用无菌水冲洗6次，每次3分钟，然后接种于含6-苄基腺嘌呤的1/2MS培养基上25℃光照培养，经13d培养后，即可在外植体的切口部位形成愈伤组织，将愈伤组织在基本培养基上经过继代培养，每14d转代一次，选取浅红色愈伤组织的细胞系为高产雪莲多糖的细胞系；

步骤(2)，将上述细胞系在添加秋水仙碱的基本培养基中进行培养获得多倍体细胞系；

步骤(3)，将上述雪莲多倍体细胞系接种于合成培养基中培养得到富含雪莲次生代谢产物的细胞，即得。

实施例3、

本实施例涉及一种富含黃酮和多糖的雪莲培养物的生产方法，包括以下步骤：

步骤(1)，雪莲种子经过萌发获得雪莲植株，将雪莲植株作为外植体，先用自来水冲洗，然后用杀菌剂浸泡杀菌，再用无菌水冲洗5次，每次2分钟，然后接种于含萘乙酸的1/2MS培养基上26℃暗培养，经14d培养后，即可在外植体的切口部位形成愈伤组织，将愈伤组织在基本培养基上经过继代培养，每13d转代一次，选取浅红色愈伤组织的细胞系为高产雪莲多糖的细胞系；

步骤(2)，将上述细胞系在添加秋水仙碱的基本培养基中进行培养获得多倍体细胞系；

步骤(3)，将上述雪莲多倍体细胞系接种于合成培养基中培养得到富含雪莲次生代谢产物的细胞，即得。

实施例4、

本实施例涉及一种富含黃酮和多糖的雪莲培养物的生产方法，包括以下步骤：

步骤(1)，雪莲种子经过萌发获得雪莲植株，将雪莲植株作为外植体，先用自来水冲洗，然后用杀菌剂浸泡杀菌，再用无菌水冲洗6次，每次3分钟，然后接种于含6-苄基腺嘌呤的1/2MS培养基上25℃暗培养，经15d培养后，即可在外植体的切口部位形成愈伤组织，将愈伤组织在基本培养基上经过继代培养，每12d转代一次，选取浅红色愈伤组织的细胞系为高产雪莲多糖的细胞系；

步骤(2)，将上述细胞系在添加秋水仙碱的基本培养基中进行培养获得多倍体细胞系；

步骤(3)，将上述雪莲多倍体细胞系接种于合成培养基中培养得到富含雪莲次生代谢产物的细胞，即得。

实施例5、

本实施例涉及一种富含黃酮和多糖的雪莲培养物的生产方法，包括以下步骤：

步骤(1)，雪莲种子经过萌发获得雪莲植株，将雪莲植株作为外植体，先用自来水冲洗，然后用杀菌剂浸泡杀菌，再用无菌水冲洗冲洗5次，每次2分钟，然后接种于含激动素的1/2MS培养基上24℃暗培养，经12d培养后，即可在外植体的切口部位形成愈伤组织，将愈伤组织在基本培养基上经过继代培养，每14d转代一次，选取浅红色愈伤组织的细胞系为高产雪莲多糖的细胞系；

步骤(2)，将上述细胞系在添加秋水仙碱的基本培养基中进行培养获得多倍体细胞系，再将上述雪莲多倍体细胞系进行扩增培养；

步骤(3)，将步骤(2)中经扩增培养后的雪莲多倍体细胞系接种于合成培养基中培养得到富含雪莲次生代谢产物的细胞，即得。

实施效果的评价

通过上述实施例获得黃酮和多糖雪莲次生代谢产物，不受自然条件限制，产品质量可控性好；黄酮含量占细胞干重的15～20％左右，雪莲细胞系黄酮产量大，培养密度高，可达23～25g(干重)/L培养基，生长快，培养周期短；遗传特性稳定，在连续传代培养过程中，细胞合成黄酮的能力不退化；与栽培和野生的植物相比，可获得稳定的质量和产量；在有光照条件下可以获得雪莲高产多糖细胞系，但是在暗培养条件下，获得的雪莲高产多糖细胞系效果更好，而且，在不使用光照的暗中进行细胞培养，可节省电力，降低成本。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (4)

1.一种富含黃酮和多糖的雪莲培养物的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)，雪莲种子经过萌发获得雪莲植株，将所述雪莲植株作为外植体，先用自来水冲洗，然后用杀菌剂浸泡杀菌，再用无菌水冲洗，然后接种于含植物激素的1/2MS培养基上24～26℃培养，经12～15d培养后，即可在外植体的切口部位形成愈伤组织，将所述愈伤组织在基本培养基上经过继代培养，每12～15d转代一次，选取浅红色愈伤组织的细胞系为高产雪莲黃酮和多糖的细胞系；

步骤(2)，将所述细胞系在添加秋水仙碱的基本培养基中进行培养获得雪莲多倍体细胞系；

步骤(3)，将所述雪莲多倍体细胞系接种于合成培养基中培养得到富含雪莲黃酮和多糖的细胞，即得；

步骤(1)中，所述植物激素为生长素和/或细胞分裂素；

所述生长素为2,4-二氯苯氧乙酸或萘乙酸；

所述细胞分裂素为6-苄基腺嘌呤或激动素。

2.根据权利要求1所述的的生产方法，其特征在于，步骤(1)中，所述1/2MS培养基上24～26℃培养为无光照的暗培养。

3.根据权利要求2所述的的生产方法，其特征在于，步骤(1)中，所述无菌水冲洗的次数为5～6次，每次2～3分钟。

4.根据权利要求2所述的的生产方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)之间还包括以下步骤：将所述雪莲多倍体细胞系进行扩增培养。