CN106577279B - 一种诱导西藏绵头雪莲愈伤组织产生花青素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导西藏绵头雪莲愈伤组织产生花青素的方法。本发明以西藏绵头雪莲种子为材料，通过组织培养技术诱导愈伤组织，筛选得到花青素高产且遗传稳定细胞系。本发明筛选的绵头雪莲愈伤组织细胞系在常温下生长快，遗传特性稳定，继代培养15‑20天即可获得大量增殖细胞，在改变培养条件的情况下可诱导西藏绵头雪莲愈伤组织产生花青素，实现了常温大量培养与诱导花青素相结合的二段式培养方式，不仅解决了细胞生长与次生代谢产物积累的矛盾问题，也解决了花青素生产的原料问题，可实现雪莲花青素的工业化生产，并且生产成本低，培养周期短，不受自然环境及气候的影响，可以实现周年生产，具有重要理论意义及广阔的市场应用前景。

Description

一种诱导西藏绵头雪莲愈伤组织产生花青素的方法
技术领域
本发明属于细胞工程领域，涉及植物愈伤组织诱导花青素方法，特别涉及西藏绵头雪莲愈伤组织诱导、继代繁殖、细胞系筛选及花青素的诱导方法。
背景技术
雪莲，属菊科(Compositae)风毛菊属(Saussurea DC.)多年生草本药用观赏植物，主要分布于我国西北高寒山区3600-5750m高山流石滩、高山草甸及悬崖峭壁上，在国外很少有分布。雪莲是西北地区非常重要的藏药植物资源，以花或全草入药。化学成分研究表明，雪莲含有黄酮类、生物碱、内酯、甾醇、多糖及挥发油，其主要次生代谢产物为黄酮类化合物，这些化合物具有清除自由基、抗衰老、抗辐射、抗癌、抗风湿、镇痛、调节心血管系统、终止妊娠和增强机体免疫力等功能。由于雪莲药用价值高、资源贫乏，已被列为国家三级保护渐危植物。雪莲生长周期一般为5-6年，在7-8月初花时采集药效最好，此时果实正在或刚刚形成，基本没有繁殖能力，而雪莲是靠种子进行繁殖，掠夺性采挖已造成这种珍稀植物濒临灭绝和对生态平衡的严重破坏。因此，利用雪莲种子通过组织培养技术获得愈伤组织细胞是保存种质资源进而解决雪莲资源濒危的有效途径。
青藏高原(Qinghai-Tibet Plateau，QTP)被称为“世界第三极”，是我国最大、世界上海拔最高的高原，具有寒冷、干燥、缺氧、太阳总辐射高和紫外线强的独特高原气候，高山雪线藏药植物雪莲在如此恶劣环境下生存繁衍至今，必定塑造了其特殊的抗性机制。
花青素又称花青素苷(anthocyanin)，是植物新陈代谢过程中产生的类黄酮类(flavonoid)物质，是决定被子植物花、果实、种皮等颜色的重要色素之一。同时，花青素苷还是一种安全、无毒的天然食用色素，是迄今为止所发现的最强效的自由基清除剂。由世界卫生组织和联合国粮农组织组成的食品添加剂联合专家委员会(JECFA)考察了花青素的毒理学资料，认为花青素活性功能广泛，副作用小，是一类安全的天然植物色素。目前，花青素已广泛应用于食品、药品、化妆品和保健产品等领域，具有较高研究价值和一定的市场应用潜力。
目前，花青素苷的利用主要局限于资源植物如葡萄、蓝莓、紫薯、紫甘蓝等材料，关于愈伤组织或细胞培养产生花青素的报道还比较少见，而已有研究主要集中在愈伤组织培养中花青素含量的测定以及悬浮细胞培养等方面。存在的主要问题是没有真正建立一个生长状态良好且能长期继代保持的稳定的花青素苷高产细胞系。在环境污染日益严重、人类面临能源危机和资源短缺的情况下，研究与利用植物细胞培养生产次生代谢产物具有重要意义。采用细胞工程进行植物细胞培养具有不受季节影响、生长周期短、产物均一可控、活性物质成分高、无污染等优点。但细胞增殖生长加快，则次生代谢产物积累量少；而细胞生长较慢，有利于次生代谢产物的积累，因此细胞增殖与次生代谢产物累积的矛盾一直是困扰这一产业的主要问题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种雪莲愈伤组织细胞系的制备方法。
本发明的雪莲愈伤组织细胞系的制备方法包括如下步骤：
(1)将雪莲的外植体在愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，得到愈伤组织；
(2)将所述愈伤组织在愈伤组织继代培养基上进行继代培养，得到雪莲愈伤组织细胞系。
上述方法中，所述愈伤组织诱导培养基和所述愈伤组织继代培养基中的溶质均包括6-BA和NAA。
上述方法中，所述愈伤组织诱导培养基中的6-BA和NAA的质量比为1：(1.5-2)。
上述方法中，所述愈伤组织继代培养基中的6-BA和NAA的质量比为0.5：(1.5-2)。
上述方法中，所述继代培养的方法为将所述愈伤组织在培养温度不断提高的条件下进行温度梯度驯化培养，所述温度梯度具体为22℃、24℃、26℃、28℃和30℃。
在实际应用中，可通过如下不断提高培养温度的方法对愈伤组织进行温度梯度驯化培养：在22℃的条件下在愈伤组织继代培养基中培养所述愈伤组织，每3年提高2℃，培养12年(第三年、第六年、第九年和第十二年的培养温度分别为24℃、26℃、28℃、30℃)。培养过程中，不断淘汰温度适应能力差的愈伤组织，最终得到对环境温度适应能力强且增殖迅速的呈乳白色的西藏绵头雪莲愈伤组织细胞系。
上述方法中，所述愈伤组织诱导培养基和所述愈伤组织继代培养基均是将基础培养基、6-BA、NAA、蔗糖、凝固剂和水混匀得到的培养基；
所述6-BA在所述愈伤组织诱导培养基中的浓度为1-1.5mg/L；
所述NAA在所述愈伤组织诱导培养基中的浓度为1.5-2mg/L；
所述6-BA在所述愈伤组织继代培养基中的浓度为0.5-1.0mg/L；
所述NAA在所述愈伤组织继代培养基中的浓度为1.5-2mg/L；
所述蔗糖在愈伤组织诱导培养基和所述愈伤组织继代培养基中的浓度均为25-30g/L；
所述琼脂在愈伤组织诱导培养基和所述愈伤组织继代培养基中的浓度均为6.5-7.0g/L。
上述方法中，所述凝固剂为琼脂；
所述6-BA在所述愈伤组织诱导培养基中的浓度为1mg/L；
所述NAA在所述愈伤组织诱导培养基中的浓度为1.5mg/L；
所述6-BA在所述愈伤组织继代培养基中的浓度为0.5mg/L；
所述NAA在所述愈伤组织继代培养基中的浓度为1.5mg/L；
所述蔗糖在愈伤组织诱导培养基和所述愈伤组织继代培养基中的浓度均为30g/L；
所述琼脂在愈伤组织诱导培养基和所述愈伤组织继代培养基中的浓度均为6.5g/L。
上述方法中，所述培养基的pH均为5.7-5.9。
所述诱导培养的条件为：21-23℃、黑暗；
所述继代培养的条件为：避光。
上述方法中，所述基础培养基为MS培养基。
上述方法中，所述诱导培养基中的水为去离子水或双蒸馏水或超纯水。
上述方法中，所述雪莲的外植体为雪莲的根、茎或叶片。
上述方法中，所述雪莲为西藏绵头雪莲。
本发明的另一个目的是提供由上述方法制备得到的细胞系。
上述愈伤组织诱导培养基或愈伤组织继代培养基也属于本发明的保护范围。
本发明还有一个目的是提供一种用于制备雪莲愈伤组织细胞系的试剂盒。
本发明提供的用于制备雪莲愈伤组织细胞系的试剂盒包括上述愈伤组织诱导培养基和/或上述愈伤组织继代培养基。
本发明还有一个目的是提供上述愈伤组织诱导培养基或上述愈伤组织继代培养基或上述细胞系或上述试剂盒的新用途。
本发明提供了上述愈伤组织诱导培养基或上述愈伤组织继代培养基或上述细胞系或上述试剂盒在产生或制备花青素中的应用。
本发明的最后一个目的是提供一种产生花青素的方法。
本发明提供的产生花青素的方法包括诱导培养上述细胞系的步骤。
上述方法中，所述诱导培养的条件为低温、黑暗，所述低温具体为4℃。
本发明以西藏绵头雪莲种子为材料，通过组织培养技术诱导愈伤组织，筛选得到花青素高产且遗传稳定细胞系。本发明筛选的绵头雪莲愈伤组织细胞系在常温下生长快，遗传特性稳定，继代培养15-20天即可获得大量增殖细胞，在改变培养条件的情况下可诱导西藏绵头雪莲愈伤组织产生花青素，实现了常温大量培养与诱导花青素相结合的二段式培养方式，解决了细胞生长与次生代谢产物积累的矛盾问题。利用本发明的花青素高产且遗传稳定细胞系生产雪莲花青素，也解决了花青素生产的原料问题，可实现雪莲花青素的工业化生产，并且生产成本低，培养周期短，不受自然环境及气候的影响，可以实现周年生产，具有重要理论意义及广阔的市场应用前景。
附图说明
图1为西藏绵头雪莲成熟植株及诱导产生的愈伤组织。a为西藏绵头雪莲成熟植株；b为花序；c和d为种子；e为种子无菌苗；f、g、h为愈伤组织。
图2为西藏绵头雪莲成熟植株及低温诱导种子无菌苗和愈伤组织产生的花青素。a和b为绵头雪莲成熟植株的茎：b为a局部放大，示紫色茎；c-f为种子无菌苗：c左1-2、d右为常温种子无菌苗，c右1-2、d左为黑暗4℃处理1个月种子无菌苗，已产生花青素；e-f示显微镜下种子无菌苗茎表皮细胞：e为d左4℃处理1个月种子无菌苗茎表皮细胞，f为d右常温种子无菌苗茎表皮细胞；g与h中1-2为黑暗4℃低温处理愈伤组织10、5天，g与h中3为常温培养的愈伤组织。
图3为花青素提取液的光谱扫描曲线。a、b、c分别为绵头雪莲愈伤组织低温诱导细胞系、紫甘蓝和紫薯花青素提取液光谱扫描曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的MS培养基配方：
大量元素：KNO3 1.9g/L、NH4NO3 1.65g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L和MgSO4·7H2O 0.37g/L；
微量元素：MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L和CoCl2·6H2O 0.025mg/L；
铁盐：FeSO4·7H2O 25-30mg/L和Na2EDTA·2H2O 35-40mg/L；
有机成分：盐酸硫胺素VB1 0.1mg/L、烟酸VB5或VPP 0.5mg/L、盐酸吡哆醇VB60.5mg/L、甘氨酸2mg/L、肌醇100mg/L。
下述实施例中的6-苄基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA、2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D和激动素KT均是北京拜尔迪生物技术有限公司的产品。
实施例1、一种诱导西藏绵头雪莲愈伤组织产生花青素的方法
一、外植体的制备
1、将西藏绵头雪莲(Saussurea.laniceps Hand.-Mazz.)种子(图1a-d，来自西藏林芝市药材市场)用体积分数为70％的酒精浸润1min，无菌水冲洗3次后，再放入含有效氯2.5％(质量分数)的次氯酸钠溶液中灭菌15min，无菌水冲洗三次后，得到灭菌种子；
2、将灭菌种子放入MS培养基中，置于22℃光照条件(16h/8h，光照/黑暗)下生长培养1个月，培养成为无菌苗(图1e)。并以无菌苗的根、茎、叶片作为外植体。
二、愈伤组织的诱导培养
将步骤一获得的外植体转入装有愈伤组织诱导培养基的三角瓶(40ml培养基)中进行诱导培养，根据培养基中激素浓度的不同，分为12组不同的愈伤组织诱导培养基，各个培养基的pH值均为5.8。每个三角瓶中外植体个数为5个，每种培养基接种10瓶，培养条件为22℃、黑暗，诱导培养20天，分别得到绵头雪莲愈伤组织。12组不同的愈伤组织诱导培养基如下：
1)MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
2)MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
3)MS+6-BA 1.5.mg/L+NAA 1.5.mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
4)MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
5)MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
6)MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
7)MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
8)MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
9)MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
10)MS+2,4-D 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
11)MS+2,4-D 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
12)MS+KT 0.05mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L。
诱导培养结果表明：外植体(无菌苗图1e中的根、茎、叶)在上述各组培养基中诱导培养后均可诱导形成愈伤组织，但第6)组培养基诱导率最高，可达100％(图1f)，因此，愈伤组织诱导培养基的配方优选为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L。
三、愈伤组织的继代培养及愈伤组织细胞系的筛选
1、愈伤组织的继代培养
将步骤二获得的绵头雪莲愈伤组织(第6)组培养基诱导得到的绵头雪莲愈伤组织)在愈伤组织继代培养基中进行继代培养，根据培养基中激素浓度的不同，分成10组不同的愈伤组织继代培养基，各个培养基的pH值均为5.8。培养条件为22℃、避光，继代时间为20-25天。10组不同的愈伤组织继代培养基如下：
1)MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
2)MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
3)MS+6-BA 1.5.mg/L+NAA 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
4)MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
5)MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
6)MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
7)MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
8)MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
9)MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；
10)MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L。
经过2年的不断继代培养，愈伤组织在上述10组培养基中均由绿转黄，由坚硬到松软(图1f、g、h)，得到疏松、长势一致的乳白色愈伤组织细胞系(图1h)。但在第5)、8)和9)组的愈伤组织继代培养基中生长较快，其中，第9)组愈伤组织继代培养基生长最快，且细胞分化少。因此愈伤组织继代培养基的配方优选为MS+6-BA0.5mg/L+NAA 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L。
按照上述步骤二中第6)组愈伤组织诱导培养基和步骤三第9)组愈伤组织继代培养基及培养方法分别对新疆大苞雪莲和青海水母雪莲的愈伤组织进行继代培养，得到新疆大苞雪莲愈伤组织细胞系和青海水母雪莲愈伤组织细胞系。
2、愈伤组织细胞系的温度驯化培养
通过不断提高培养环境的温度对上述步骤1获得的绵头雪莲乳白色愈伤组织细胞系(第9)组愈伤组织继代培养基继代培养获得的愈伤组织细胞系)继续进行继代培养，每3年提高2℃，培养12年(第三年、第六年、第九年和第十二年的环境温度分别为24℃、26℃、28℃、30℃)。培养过程中，不断淘汰温度适应能力差的愈伤组织。
经过12年不断提高温度的驯化培养，筛选出对环境温度适应能力强且增殖迅速的呈乳白色的西藏绵头雪莲愈伤组织细胞系，将其记作驯化培养后的绵头雪莲愈伤组织细胞系(图2中g3和h3)。
按照上述温度驯化培养的方法分别对步骤1获得的新疆大苞雪莲、青海水母雪莲的愈伤组织进行温度驯化培养，筛选得到驯化培养后的新疆大苞雪莲愈伤组织细胞系和驯化培养后的青海水母雪莲愈伤组织细胞系。
3、愈伤组织细胞系的最适培养温度
将步骤2获得的驯化培养后的绵头雪莲愈伤组织细胞系、驯化培养后的新疆大苞雪莲愈伤组织细胞系和驯化培养后的青海水母雪莲愈伤组织细胞系分别在如下不同温度：15℃、18℃、20℃、22℃、25℃、26℃、28℃、30℃的环境中进行培养，观察其生长情况。
结果表明：驯化培养后的绵头雪莲愈伤组织细胞系可在15-30℃环境中生长，最适培养温度范围为20-25℃，高于26℃生长缓慢，但仍能存活；而驯化培养后的新疆大苞雪莲愈伤组织细胞系和驯化培养后的青海水母雪莲愈伤组织细胞系在高于22℃生长较慢，高于25℃不能生长。说明经过温度驯化培养方法得到的西藏绵头雪莲愈伤组织细胞系对环境温度适应能力更强。
四、诱导西藏绵头雪莲愈伤组织产生花青素
1、诱导西藏绵头雪莲愈伤组织产生花青素
将步骤三获得的驯化培养后的绵头雪莲愈伤组织细胞系经转接继代培养15-20天，使愈伤组织的生长处于对数期(此时期细胞活力较强)(图2中g3和h3)，将愈伤组织置于低温(4℃)、黑暗条件下进行花青素诱导，经过3-5天愈伤组织由乳白色变成粉红色，7-10天转为深红色，得到诱导后的愈伤组织，该诱导后的愈伤组织含有花青素(图2中g1和g2、h1和h2)。
2、花青素的验证
取1g诱导后的愈伤组织，在液氮下研磨，加入2mL的0.1％盐酸甲醇提取液(将100mL甲醇溶液与0.28mL体积分数为36％的浓盐酸混匀得到)，4℃静置3h，低温离心，收集上清液。用普析通用分光光度计(TU-1810PC)对上清液进行光谱扫描。
扫描结果如图3a所示。在528nm有最大吸收峰，说明诱导后的愈伤组织中产生大量花青素(花青素苷)。

Claims (6)

1.一种雪莲愈伤组织细胞系的制备方法，包括如下步骤：
(1)将雪莲的外植体在愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，得到愈伤组织；
(2)将所述愈伤组织在愈伤组织继代培养基上进行继代培养，得到雪莲愈伤组织细胞系；
所述雪莲为西藏绵头雪莲；
所述愈伤组织诱导培养基和所述愈伤组织继代培养基中的溶质均包括6-BA和NAA；
所述6-BA在所述愈伤组织诱导培养基中的浓度为1-1.5mg/L；
所述NAA在所述愈伤组织诱导培养基中的浓度为1.5-2mg/L；
所述6-BA在所述愈伤组织继代培养基中的浓度为0.5-1.0mg/L；
所述NAA在所述愈伤组织继代培养基中的浓度为1.5-2mg/L；
所述继代培养的方法为将所述愈伤组织在培养温度不断提高的条件下进行温度梯度驯化培养，所述温度梯度为22℃、24℃、26℃、28℃和30℃，每个温度培养3年。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述愈伤组织诱导培养基和所述愈伤组织继代培养基均是将基础培养基、6-BA、NAA、蔗糖、凝固剂和水混匀得到的培养基；
所述凝固剂为琼脂；
所述蔗糖在愈伤组织诱导培养基和所述愈伤组织继代培养基中的浓度均为25-30g/L；
所述琼脂在愈伤组织诱导培养基和所述愈伤组织继代培养基中的浓度均为6.5-7.0g/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述6-BA在所述愈伤组织诱导培养基中的浓度为1mg/L；
所述NAA在所述愈伤组织诱导培养基中的浓度为1.5mg/L；
所述6-BA在所述愈伤组织继代培养基中的浓度为0.5mg/L；
所述NAA在所述愈伤组织继代培养基中的浓度为1.5mg/L；
所述蔗糖在愈伤组织诱导培养基和所述愈伤组织继代培养基中的浓度均为30g/L；
所述琼脂在愈伤组织诱导培养基和所述愈伤组织继代培养基中的浓度均为6.5g/L。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：
所述培养基的pH均为5.7-5.9；
所述诱导培养的条件为：21-23℃、黑暗；
所述继代培养的条件为：避光。
5.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述雪莲的外植体为雪莲的根、茎或叶片。
6.一种产生花青素的方法，包括诱导培养利用权利要求1-5任一所述方法制备获得的细胞系的步骤；所述诱导培养的条件为低温、黑暗；
所述低温为4℃。
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天山雪莲愈伤组织培养与次生代谢物形成的研究;贾景明等;《中药研究与信息》;20050731;第7卷(第7期);第11-15页 *
绵头雪莲花(Saussurea. Laniceps hand.-Mazz.)组织培养及其抗寒性的生理生化基础研究;陈玉珍;《中国博士学位论文全文数据库（博士）农业科技辑》;20050815(第4期);3绵头雪莲花的组织培养及植株再生，3.1 材料与方法，3.2 结果，表3.1，3.3.3 绵头雪莲花愈伤组织继试管无性系建立的意义，6.2.4 低温锻炼后绵头雪莲花多酚含量与花青素的变化，摘要 *

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