CN100998311B - 山慈姑独蒜兰人工繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
一种山慈姑独蒜兰人工繁殖方法，它通过对优良成熟种子进行低温冷处理，再在半固体酸性培养基上，25±1℃培养室中暗培养进行诱导萌发，然后在分化培养基上进行暗培养及光照继代培养至成苗；最后将成苗植株在自然光下炼苗，移栽至塑料盘中的基质上，待小苗生长至0.8-2cm时，即可。该种繁殖方法生产成本低、生长周期短、种苗成活率高，可快速成批、大量地生产出种苗，适合山慈姑独蒜兰的大面积人工种植，有利于恢复濒危药用植物山慈姑独蒜兰的自然储量，同时满足市场对山慈姑药材的巨大需求。
Description
技术领域
本发明属于植物人工繁殖技术领域，尤其属于濒危药用兰科植物山慈姑独蒜兰的人工繁殖技术领域。
背景技术
山慈姑独蒜兰是生药山慈姑的基原植物。山慈姑为常用中药，具有清热化痰、解毒、消痈散结的作用。临床上用于治疗痈肿疔毒，瘰疠痰核、淋巴结结核、恶疮、蛇虫咬伤等症。近些年来，在临床上山慈姑用于治疗胃癌等多种癌症均取得了一定疗效，因此它作为一种新的抗癌药物而倍受关注。体外实验表明，山慈姑对移植性小鼠S-180和大鼠瓦克瘤-256均有抑制作用，因而这使得它具有非常巨大的发展潜力和市场需求。山慈姑独蒜兰在所有的独蒜兰属植物中，其种子发育很不成熟，萌发非常困难；并且山慈姑独蒜兰自然储量稀少，片面追求经济效益的人们，滥采滥挖，使自然储量锐减，野生山慈姑独蒜兰资源已临枯竭而成濒危物种。为保护山慈姑独蒜兰这一珍贵的物种基因资源，能最大限度地恢复该物种的自然储量，同时满足市场对山慈姑药材的巨大需求，需要对山慈姑独蒜兰进行大面积人工种植。而进行大面积人工种植的关键，首先是要生产充足的山慈姑独蒜兰种苗。
现有的山慈姑独蒜兰种苗的繁殖方法是通过诱导山慈姑假鳞茎产生原球茎途径获得性状稳定的试管苗。由于兰科植物的种子数目众多，若能使用种子诱导萌发，相对于采用其他材料的无性快速繁殖技术，可快速成批、大量地生产出更多的种苗，具有更好的应用前景。然而，在自然状态下，山慈姑独蒜兰种子极难萌发，目前尚未找到成本低、生长周期短、成活率高的山慈姑独蒜兰种苗的人工繁殖方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种山慈姑独蒜兰种苗的人工繁殖方法，该种繁殖方法生产成本低、生长周期短、种苗成活率高，可快速成批、大量地生产出种苗，有利于恢复濒危药用植物独蒜兰的自然储量，同时满足市场对山慈姑药材的巨大需求。
本发明为实现其发明目的，所采用的技术方案是，一种山慈姑独蒜兰人工繁殖方法，包括以下步骤：
a、选材：选取性状优良的山慈姑独蒜兰植株，开花后进行人工授粉，结果后收集已呈棕黄色未开裂的果荚，用滤纸擦拭果荚表面，真空密封后放置在4℃冰箱中冷处理0.5-2个月。
b、诱导萌发：将a步的果荚从冰箱中取出进行常规灭菌，剖开果荚，将其中的粉末状种子撒播于半固体酸性培养基上；在25±1℃培养室中暗培养，使种子膨大、胚胎突破种皮，并逐渐形成白色透明的小圆球体，再转变成致密的原球体，最后逐步形成原球茎。
c、分化及成苗培养：
将b步的原球茎转移到分化培养基上诱导分化，先暗培养7天，然后进行光照培养，培养温度为25±1℃，光照2100-30001x，12h/天，原球茎逐步变绿；待幼叶突破叶鞘后，将其转移到新鲜分化培养基上进行继代培养；待植株基部分化出根后，将其转移到新鲜分化培养基上进行壮苗培养，得到分化出3-8条根的再生植株。
d、试管苗移栽：将c步的再生植株，在自然光下炼苗7-10天，从培养瓶中取出植株，洗净根部的培养基，在20％萘乙酸粉剂的0.05-0.2％溶液中浸泡10-60s，随后移植至基质底部为小碎石或仙土，中上部覆盖干苔藓基质或越西基质的带小孔的塑料盘中，保持基质疏松、湿润而透气，待小苗生长至0.8-2cm时，即完成山慈姑独蒜兰的人工繁殖。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
一、对山慈姑独蒜兰的果荚进行真空密封后放置在4℃冰箱中冷处理0.5-2个月可起到自然越冬时的低温作用，以使种子充分完成后熟作用，有助于种子的萌发。
二、绝大多数的植物胚胎都深埋于子房中，在暗环境中吸收母体营养进行生长发育直至成熟。而山慈姑独蒜兰种子，胚胎发育不成熟，在球型胚时期就停止发育。本发明在诱导萌发使种子最后形成小圆球体的约3个月时间内采用了25℃暗培养，使山慈姑独蒜兰种子在离体繁殖中，有适宜的营养、湿度和暗环境，满足其胚胎发育所需的特殊的环境要求，加速了山慈姑独蒜兰种子中胚的活化，诱导胚胎发育形成正常的原球茎。
三、分化及成苗培养中7天暗培养，使原球茎先适应分化培养基后再进行光照培养，诱导原球茎分化形成正常发育的植株。
四、光照2100-30001x、12h/天，促进原球茎的分化发育，在此光照条件下，原球茎逐渐转绿，约1个月后，原球茎开始有叶的分化，经多次继代后形成具有多条根的健壮幼苗。
总之，由于本发明的以上独特技术措施，创造出了山慈姑独蒜兰种子成苗各环节的适宜环境与条件，使其种苗成活率高，可快速成批、大量地生产出种苗。且其只需简单的实验设备，繁殖成本低，生长周期短，适合山慈姑的大面积人工种植，解决了濒危药用植物山慈姑独蒜兰的人工繁殖的技术难题，为其开发应用奠定了良好的基础。
上述的b步诱导萌发时使用的半固体酸性培养基为：在MS培养基中加入1-3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，0.5-1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)，3-5％蔗糖，0.5-1％活性碳，0.058％干酪素，0.45-0.55％琼脂，并将其pH值调至为5.0-5.5。
这种半固体酸性培养基的pH值较低、琼脂浓度较小。因而，培养基的胨力强度较常规培养基的小；这样，低凝固状态的培养基的湿度就很大，再加上偏酸性的环境，能促进种子吸涨，从而促进种胚活化，大大缩短种子萌发的时间；在培养基中，2，4-二氯苯氧乙酸能诱导种胚发育形成原球茎，大大加快个体发生和形态建成的速度；6-苄基氨基嘌呤能促进原球茎的分化和增殖。
上述的c步分化及成苗培养时使用的分化培养基为：在1/2MS基本培养基中加入0.2-1.0mg/L萘乙酸，2-3％蔗糖，0.2-1％活性炭，0.45-0.50％琼脂，并将其pH值调至5.8-6.0。
这种分化培养基能快速促进原球茎的生长发育，能迅速诱导叶片的分化，多次继代后可诱导根的生长，生长出长势良好的健壮植株；而培养基中低浓度的萘乙酸有利于原球茎的增殖与根的形成。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
实施例一
一种山慈姑独蒜兰人工繁殖方法，包括以下步骤：
a、选材：选取性状优良的山慈姑独蒜兰植株，开花后进行人工授粉，通常在120天后结果。结果后收集已呈棕黄色未开裂的果荚，用滤纸擦拭果荚表面，真空密封后放置在4℃冰箱中冷处理1个月。
b、诱导萌发：将a步的果荚从冰箱中取出进行常规灭菌，剖开果荚，将其中的粉末状种子撒播于半固体酸性培养基上；在25±1℃培养室中暗培养，使种子膨大、胚胎突破种皮，并逐渐形成白色透明的小圆球体，此过程一般需要3个月时间。一般再经半个月后转变成致密的原球体，最后逐步形成原球茎。
本例使用的半固体酸性培养基为：在MS培养基中加入2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，0.7mg/L 6-苄基氨基嘌呤，4％蔗糖，0.7％活性碳，0.05％干酪素，0.5％琼脂，并将其pH值调至5.2。
c、分化及成苗培养：
将b步的原球茎转移到分化培养基上诱导分化，先暗培养7天；然后进行光照培养，培养温度为25±1℃，光照25001x，12h/天，原球茎逐步变绿；待幼叶突破叶鞘后，将其转移到新鲜分化培养基上进行继代培养；待植株基部分化出根后，将其转移到新鲜分化培养基上进行壮苗培养，得到分化出3-8条根的再生植株。
本例分化及成苗培养时使用的分化培养基为：在1/2MS培养基中加入0.6mg/L萘乙酸，2.5％蔗糖，0.7％活性炭，0.48％琼脂，且其pH值调整为5.9。
d、试管苗移栽：将c步的再生植株，在自然光下炼苗8天，从培养瓶中取出植株，洗净根部的培养基，在20％萘乙酸粉剂的0.1％溶液中浸泡20s，随后移植至基质底部为小碎石或仙土，中上部覆盖干苔藓基质或越西基质的带小孔的塑料盘中，小碎石或仙土高度约为塑料盘1/3。保持基质疏松、湿润而透气，一周后开始生根，一月后小苗生长，待小苗生长至0.8-2cm时，即完成山慈姑独蒜兰的人工繁殖。
实施例二
一种山慈姑独蒜兰人工繁殖方法，包括以下步骤：
a、选材：选取性状优良的山慈姑独蒜兰植株，开花后进行人工授粉，结果后收集已呈棕黄色未开裂的果荚，用滤纸擦拭果荚表面，真空密封后放置在4℃冰箱中冷处理0.5个月。
b、诱导萌发：将a步的果荚从冰箱中取出进行常规灭菌，剖开果荚，将其中的粉末状种子撒播于半固体酸性培养基上；在25±1℃培养室中暗培养，使种子膨大、胚胎突破种皮，并逐渐形成白色透明的小圆球体，再转变成致密的原球体，最后逐步形成原球茎。
本例使用的半固体酸性培养基为：在MS培养基中加入1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤(6-BA)，3％蔗糖，0.5％活性碳，0.05％干酪素，0.55％琼脂，且其pH值调整为5.0。
c、分化及成苗培养：将b步的原球茎转移到分化培养基上诱导分化。先暗培养7天，然后进行光照培养，培养温度为25±1℃，光照21001x，12h/天，原球茎逐步变绿；待幼叶突破叶鞘后，将其转移到新鲜的同样的分化培养基上进行继代培养，1个月左右在植株基部分化出根，待植株基部分化出根后，将其转移到新鲜分化培养基上进行壮苗培养，得到分化出3-8条根的再生植株。
本例分化及成苗培养时使用的分化培养基为：在1/2MS中加入0.2mg/L萘乙酸，2％蔗糖，0.2％活性炭，0.50％琼脂，且其pH值调整为5.8。
d、试管苗移栽：将c步的再生植株，在自然光下炼苗7天，从培养瓶中取出植株，洗净根部的培养基，在20％萘乙酸粉剂的0.05％溶液中浸泡10s，随后移植至基质底部为小碎石或仙土，中上部覆盖干苔藓基质或越西基质的带小孔的塑料盘中，小碎石或仙土高度约为塑料盘1/3。保持基质疏松、湿润而透气，一周后开始生根，一月后小苗生长，待小苗生长至0.8-2cm时，即完成山慈姑独蒜兰的人工繁殖。
实施例三
一种山慈姑独蒜兰人工繁殖方法，包括以下步骤：
a、选材：选取性状优良的山慈姑独蒜兰植株，开花后进行人工授粉，结果后收集已呈棕黄色未开裂的果荚，用滤纸擦拭果荚表面，真空密封后放置在4℃冰箱中冷处理2个月。
b、诱导萌发：将a步的果荚从冰箱中取出进行常规灭菌，剖开果荚，将其中的粉末状种子撒播于半固体酸性培养基上；在25±1℃培养室中暗培养，使种子膨大、胚胎突破种皮，并逐渐形成白色透明的小圆球体，再转变成致密的原球体，最后逐步形成原球茎。
诱导萌发时使用的半固体酸性培养基为：在MS培养基中加入3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)，5％蔗糖，1％活性碳，0.05％干酪素，0.45％琼脂，且其pH值调整为5.5。
c、分化及成苗培养：将b步的原球茎转移到分化培养基上诱导分化，先暗培养7天，然后进行光照培养，培养温度为25±1℃，光照30001x，12h/天，原球茎逐步变绿；待幼叶突破叶鞘后，将其转移到新鲜分化培养基上进行继代培养，待植株基部分化出根后，将其转移到新鲜分化培养基上进行壮苗培养，得到分化出3-8条根的再生植株。
分化及成苗培养时使用的分化培养基为：在1/2MS中加入1.0mg/L萘乙酸，3％蔗糖，1％活性炭，0.45％琼脂，且其pH值调整为6.0。
d、试管苗移栽：将c步的再生植株，在自然光下炼苗10天，从培养瓶中取出植株，洗净根部的培养基，在20％萘乙酸粉剂的0.2％溶液中浸泡60s，随后移植至基质底部为小碎石或仙土，中上部覆盖干苔藓基质或越西基质的带小孔的塑料盘中，保持基质疏松、湿润而透气，待小苗生长至0.8-2cm时，即完成山慈姑独蒜兰的人工繁殖
本发明的试管苗移栽时使用的越西基质为攀枝花市所产的一种基质。1/2MS培养基是将MS培养基中的大量元素减少一半，微量元素和有机元素不变，而形成的培养基。
Claims (1)
1.一种山慈姑独蒜兰人工繁殖方法，包括以下步骤：
a、选材：选取性状优良的山慈姑独蒜兰植株，开花后进行人工授粉，结果后收集已呈棕黄色未开裂的果荚，用滤纸擦拭果荚表面，真空密封后放置在4℃冰箱中冷处理0.5-2个月；
b、诱导萌发：将a步的果荚从冰箱中取出进行常规灭菌，剖开果荚，将其中的粉末状种子撒播于半固体酸性培养基上；在25±1℃培养室中暗培养，使种子膨大、胚胎突破种皮，并逐渐形成白色透明的小圆球体，再转变成致密的原球体，最后逐步形成原球茎；
半固体酸性培养基为：在MS培养基中加入1-3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，0.5-1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)，3-5％蔗糖，0.5-1％活性碳，0.05％干酪素，0.45-0.55％琼脂，并将其pH值调至5.0-5.5；
c、分化及成苗培养：
将b步的原球茎转移到分化培养基上诱导分化，先暗培养7天，然后进行光照培养，培养温度为25±1℃，光照2100-30001x，12h/天，原球茎逐步变绿；待幼叶突破叶鞘后，将其转移到新鲜分化培养基上进行继代培养；待植株基部分化出根后，将其再次转移到新鲜分化培养基上进行壮苗培养，得到分化出3-8条根的再生植株；
分化培养基为：在1/2MS培养基中加入0.2-1.0mg/L萘乙酸，2-3％蔗糖，0.2-1％活性炭，0.45-0.50％琼脂，并将其pH值调至5.8-6.0；
d、试管苗移栽：将c步的再生植株，在自然光下炼苗7-10天，从培养瓶中取出植株，洗净根部的培养基，在20％萘乙酸粉剂的0.05-0.2％溶液中浸泡10-60s，随后移植至基质底部为小碎石或仙土，中上部覆盖干苔藓基质或越西基质的带小孔的塑料盘中，保持基质疏松、湿润而透气，待小苗生长至0.8-2cm时，即完成山慈姑独蒜兰的人工繁殖。
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