CN108770691A - 一种诱导樟叶越桔组培苗叶片直接生成不定根的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种诱导樟叶越桔组培苗叶片直接生成不定根的方法，其包括如下步骤：切取樟叶越桔组培苗叶片，将叶片正面划上伤口，叶片背面紧贴培养基，暗培养10～20d后，进行光培养；培养温度为25±2℃、光照强度为1500lx、光培养12h/d；接种于含有诱导剂的WPM(改良)培养基中，所述诱导剂为IBA、NAA或者IBA+NAA的混合物；其中，IBA的浓度为0.3～1.0mg/L，NAA的浓度为0.1～0.5mg/L，IBA+NAA的浓度为0.3～1.0mg/L+0.1～0.5mg/L。本发明培养根的方法不仅具备繁殖速度快、不受季节限制等诸多优点，更明显的优势是无需经过愈伤诱导环节，叶片直接产生不定根，大大缩短了培养周期。
Description
技术领域
本发明属于植物培育技术领域，具体涉及一种樟叶越桔组培苗叶片直接生成不定根的方法。
背景技术
樟叶越桔(Vaccinium dunalianum)为杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)常绿灌木，主要分布于云南西北部经滇中高原至滇南和滇东。其果实营养丰富，全株具有舒筋活络、祛风除湿等功效，具有较高的药用和保健价值。此外，樟叶越桔也是一种富含咖啡酰熊果苷类物质的特殊资源植物，其主要成分的黑色素生成抑制活性优于熊果苷，且毒性仅为熊果苷的1/2，可作为熊果苷天然替代资源加以开发利用。樟叶越桔目前仍处于野生状态，由于连年遭受破坏性采摘，导致其野生资源急剧减少，因此利用生物技术手段建立其培养体系具有重要意义。
不定根的组织培养由于生长速率快和次生代谢产物生产能力稳定而成为有效的植物组织培养方法。由于大部分药用植物产生的有用此生带产物均来源于根部且培养细胞只有达到一定的分化程度，次生代谢才被活化，所以采用不定根培养对药用植物中次生代谢产物的积累具有特殊的意义。不定根可作为培养有效次生代谢产物的可持续资源。
近年来，我国学者相继先后开展了一些药用植物如丹参(Salvia miltiorrhiza)、三七(Panax notoginseng)、苍术(Atractylodes lancea)、金铁锁(Psammosilenetunicoides)、太子参(Pseudostellaria heterophylla和轮叶党参(Codonopsislanceolata)等的不定根研究，如柴素真“柴素真.一种金铁锁不定根培养体系的建立与扩大培养方法.中国发明专利,2013,ZL201210293609.3.”通过金铁锁茎段诱导出愈伤组织，再以愈伤组织为外植体诱导不定根，发现不定根中的总皂苷含量约为金铁锁原药材的2倍。近年的文献报道发现，同属植物蓝莓的组培苗试管内生根较慢，生根率低，而组培苗试管外生根则相对延长了驯化移栽成活时间，且对技术人员要求更高，需具备更好的管理经验。宋刚等“蓝莓试管苗不定根的诱导研究.江苏农业科学,2011,39(6):89-91.”研究了暗处理对蓝莓试管苗诱导不定根的影响，其研究结果表明蓝莓组培苗瓶内生根困难，发根周期且生根率低；和加卫等“云南越桔的组织培养.植物生理通讯，2007,43(2):320.”研究表明以1/2WPM+NAA 0.05的生根培养基，5周后基本可长处2～4条1.0～1.cm长的不定根，生根率78％。
发明内容
本发明旨在提供一种诱导樟叶越桔组培苗叶片直接生成不定根的方法，该方法无需进行愈伤组织诱导，利于降低生产成本，提高效率，为樟叶越桔多种次生代谢产物的生产提供指导依据。
本发明的上述目的是以下述方法加以实现的：
一种诱导樟叶越桔组培苗叶片直接生成不定根的方法，该方法包括如下步骤：将樟叶越桔叶片的正面划上与叶脉垂直的伤口，叶片的背面紧贴培养基，接种于添加诱导剂的培养基中，先暗培养，后进行光培养，培养温度为25±2℃、光照强度为1500lx，光培养的时间为12h/d，总计培养时间为30d。
根据所述的方法，其中所述的培养基为下表所示的改良WPM，
表 改良WPM固体培养基配方
根据所述的方法，其中所述的诱导剂为IBA、NAA或者IBA与NAA的混合物。
根据所述的方法，其中所述的IBA的浓度为0.3～1.0mg/L，NAA的浓度为0.1～0.5mg/L，IBA与NAA的混合物的浓度为0.3～1.0mg/L+0.1～0.5mg/L。
根据所述的方法，接种时，樟叶越桔组培苗叶片大小为长×宽：1.5cm×1cm。
根据所述的方法，暗培养时间为10～20d。
根据所述的方法，所述的WPM培养基中，白砂糖的含量为30g/L，琼脂的含量为0.45％，pH为5.80。
根据所述的方法，该方法无需进行愈伤组织诱导处理。
与现有技术相比，本发明的优益性在于：
(1)本发明通过樟叶越桔组培苗叶片直接诱导产生不定根，不经过愈伤组织的产生，节约了工序；其次，本发明用的是组培苗叶片，该材料来源丰富，较茎段诱导的效果显著；再者，叶片直接诱导不定根，生根时间早，生长发育快，大大缩短了培养时间并降低了经济成本。
(2)樟叶越桔叶片诱导不定根，经过暗培养诱导较光培养诱导不定根效果显著，即提高了不定根的得率，又降低了用电的成本。
(3)可以为长期不定根提取次生代谢产物提供材料来源，又可减少野生资源的破坏。
(4)樟叶越桔组培苗叶片诱导不定根的生长，只需要少量的叶片就能在实验室中建立起繁殖系统，可以大量节省常规营养繁殖所需要的母体植物以及这些母体植株栽培所需的土地和人力。对于樟叶越桔还可以做到不毁坏原有的植株，并可在短期内进行大量无性繁殖。
附图说明
图1～图5为本发明的实际效果图。
具体实施方式
下面结合附图，通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
选取生长健壮的樟叶越桔无菌组培苗，在无菌条件下将健康叶片(1.5×1.0cm)取下，将叶片的正面划伤，叶片的背面紧贴培养基培养，依次接种到WPM(改良)+0.3mg/L IBA培养基，接种叶片后置于暗培养条件下分别于第0、5、10、15、20、25、30d培养观察后，置于光照条件下继续培养。上述培养基均含白砂糖30g/L，琼脂0.45％，pH为5.8，培养温度为25±2℃，光照培养(光照强度1500lx，光照时间12h/d)条件下继续培养，结果见表2。
表1 WPM(改良)固体培养基配方
表2不同暗培养处理的生根率及根鲜重
实施例2
选取生长健壮的樟叶越桔无菌组培苗，在无菌条件下将健康叶片(1.5×1.0cm)取下，将叶片的正面划伤，叶片的背面紧贴培养基培养，依次接种到WPM(改良)诱导培养基中，暗培养15d。上述培养基均含白砂糖30g/L，琼脂0.45％，pH为5.8，培养温度为25±2℃，光照培养(光照强度1000～1500lx，光照时间12h/d)条件下继续培养。激素为：不同质量浓度(0.1、0.3、0.5、1.0、2.0mg/L)生长激素(IBA和NAA)，结果见表3。
表3不同激素配比的生根率及根鲜重
实施例3
选取生长健壮的樟叶越桔无菌组培苗，在无菌条件下将健康叶片(1.5×1.0cm)取下，将叶片的正面划伤，叶片的背面紧贴培养基培养，依次接种到WPM(改良)诱导培养基中，暗培养15d。上述培养基均含白砂糖30g/L，琼脂0.45％，pH为5.8，培养温度为25±2℃，光照培养(光照强度1000～1500lx，光照时间12h/d)条件下继续培养。各培养基中IBA和NAA配比情况见表4。培养30d后的生根率和根鲜重结果如表5所示。
表4不同植物激素配比的处理号
表5不同激素配比的生根率及根鲜重
如表5所示，处理组4和处理组5所得的效果较为优异，生根率可达90％以上。
Claims (8)
1.一种诱导樟叶越桔组培苗叶片直接生成不定根的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：将樟叶越桔叶片的正面划上与叶脉垂直的伤口，叶片的背面紧贴培养基，接种于添加诱导剂的培养基中，先暗培养，后进行光培养，培养温度为25±2℃、光照强度为1500lx，光培养的时间为12h/d。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养基为下表所示的改良WPM。
表 改良WPM固体培养基配方
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的诱导剂为IBA、NAA或者IBA与NAA的混合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的IBA的浓度为0.3～1.0mg/L，NAA的浓度为0.1～0.5mg/L，IBA与NAA的混合物的浓度为0.3～1.0mg/L+0.1～0.5mg/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，接种时，樟叶越桔组培苗叶片大小为长×宽：1.5cm×1cm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，暗培养时间为10～20d。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的WPM培养基中，白砂糖的含量为30g/L，琼脂的含量为0.45％，pH为5.80。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法无需进行愈伤组织诱导处理。
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