CN101822219A

CN101822219A - 一种笃斯越桔根瘤试管内直接诱导、快繁方法

Info

Publication number: CN101822219A
Application number: CN 201010169092
Authority: CN
Inventors: 顾地周; 冯颖; 姜云天; 朱俊义; 高捍东; 陈霞
Original assignee: Tonghua Normal University
Current assignee: Tonghua Normal University
Priority date: 2010-05-12
Filing date: 2010-05-12
Publication date: 2010-09-08
Anticipated expiration: 2030-05-12
Also published as: CN101822219B

Abstract

本发明涉及一种植物繁殖，即笃斯越桔根瘤试管内直接诱导、快繁方法。其特征在于步骤如下：(1)以笃斯越桔根部分蘖的嫩芽为外植体，其适合的嫩芽根瘤诱导的培养基为：1/4MS+IAA0.80mg·L^-1+IBA0.04mg·L^-1+GA₃0.15mg·L^-1。(2)采用已产生根瘤的再生植株的茎节为材料在试管利用节增殖的方法进行快繁，将含有根瘤的试管苗于根上部留1～2叶切下，并将切下的小枝条再切割成一叶一段转接到优化后的根瘤诱导培养基中进行同时腋芽萌发、生长及根瘤再生培养。缩短了继代增殖周期，提高了增殖倍数，方法简捷，经济实用，可操作性强，达到了快繁的目标，可用于含根瘤的笃斯越桔苗的工厂化育苗。

Description

一种笃斯越桔根瘤试管内直接诱导、快繁方法

技术领域

本发明涉及一种植物繁殖，即笃斯越桔根瘤试管内直接诱导、快繁方法。

背景技术

在现有技术中，笃斯越桔(Vaccinium uliginosum Linn.)，又称笃斯、甸果、地果、龙果、讷日苏(蒙古族语)。笃斯越桔是杜鹃花科越桔属落叶小灌木，《吉林省野生动植物保护管理暂行条例》中定为省级一类重点保护植物。是野生观赏植物和珍稀濒危药用植物，主要功能为清热、收敛等。果可生食，酸甜可口，汁液丰富，做果酒、果醋、果酱、果汁及提取天然食用色素的原料，被国际粮农组织定为五大健康食品之一。其分布区甚狭，长白山区数量非常稀少，仅在长白山国家级自然保护区内有较大种群分布。野生产果量低，人工驯化栽培后生长势弱，导致果的产量极低和品质极差，开发和利用受到极大限制。

越桔根系没有根毛，吸收能力比具有根毛的根系小得多，但自然条件下几乎所有的越桔细根都有EM(Eriocdimyochrriaz，EM)内生菌根真菌的寄生，从而克服了越桔由于没有根毛而造成的对水分及营养的吸收困难，改善植株营养状况，调节宿主的代谢活性，增强植株的抗逆性，提高越桔的产量，加快移栽苗成活速度，节约农业生产成本，增加经济产量和效益。因而将越桔组培技术和菌根化技术相结合，生产生长势旺、抗逆能力强的越桔苗木是一项很有经济价值的研究项目。在国外，新西兰已经将接种菌根真菌作为促进越桔生长、提高肥料利用率、提高产量的一项有效措施。而在国内EM真菌的分离和研究几乎还是一片空白。要生产菌根化苗木的关键是选用适宜当地生态条件的优良菌种用于接种，培育出优质的菌根化越桔种苗，在生产和应用中将产生巨大的经济效益。

为了更好的开发利用这一极具经济价值的野生珍贵资源，利用植物组织培养技术在成功完成丛生芽诱导和生根的基础上，又以野生笃斯越桔根芽的嫩茎在试管内开展了直接诱导根瘤的研究，旨在建立笃斯越桔根瘤苗快繁体系，为笃斯越桔增产和提高品质提供基础保障。同时，应用均匀设计对笃斯越桔根瘤诱导培养基进行筛选，以期缩短培养基的摸索周期。目前，越桔属植物根瘤的研究大多集中在根瘤菌的分离和鉴定方面，很少达到与植物的共建并利用于栽培生产。本研究开展的笃斯越桔试管内根瘤直接诱导和含根瘤苗高效快繁的报道国内外迄今未见。

发明内容

本发明的目的是针对上述不足而提供一种技术可行的笃斯越桔根瘤试管内直接诱导、快繁方法。

本发明的技术解决方案是：笃斯越桔根瘤试管内直接诱导、快繁方法，其特征在于步骤如下：

(1)以笃斯越桔根部分蘖的嫩芽为外植体，对外植体进行处理，其适合的嫩芽根瘤诱导的培养基为：1/4MS+IAA0.80mg·L^-1+IBA0.04mg·L^-1+GA₃0.15mg·L^-1。

式中MS为1962年由Murashige和Skoog发明的一种常用培养基，IAA为吲哚乙酸，IBA为吲哚丁酸，GA₃为赤霉素。

(2)采用已产生根瘤的再生植株的茎节为材料在试管利用节增殖的方法进行快繁，将含有根瘤的试管苗于根上部留1～2叶切下，并将切下的小枝条再切割成一叶一段转接到优化后的根瘤诱导培养基中进行同时腋芽萌发、生长及根瘤再生培养，以38d为一个继代增殖周期，每瓶增殖倍数平均达70以上。

本发明的优点是：采用笃斯越桔根芽为试材进行根瘤诱导，并在试管内成功诱导出根瘤。含根瘤苗的快繁利用再生植株的茎节为材料，采取节增殖的方法，从而缩短了继代增殖周期，提高了增殖倍数，方法简捷，经济实用，可操作性强，达到了快繁的目标，可用于含根瘤的笃斯越桔苗的工厂化育苗，且均在试管内进行，同时，应用均匀设计处理、分析数据和再试验大大缩短了培养基配方的摸索周期。笃斯越桔根瘤技术可为长白山区野生资源的开发利用和中药质量标准化提供技术保障。

下面将结合附图、实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。

附图说明

图1是笃斯越桔根芽嫩茎段的萌发照片；

图2是笃斯越桔根瘤诱导初期培养照片；

图3是笃斯越桔根瘤诱导中期照片；

图4是笃斯越桔根瘤诱导后期照片；

图5是笃斯越桔含有根瘤的植株照片；

图6是笃斯越桔不含根瘤的植株照片。

具体实施方式

笃斯越桔根瘤试管内直接诱导、快繁方法包括以下步骤：

1材料与方法

1.1外植体材料的处理8月于长白山北坡海拔1400m针阔混交林林缘采矮壮且萌蘖多的笃斯越桔根芽在超净工作台上用70％酒精涮洗10s，用含3％次氯酸钠溶液浸泡3min，无菌水冲洗8次。用无菌滤纸吸干表面水分，切除被杀菌消毒剂损伤部分后切割成1～2叶1段作为外植体备用。

1.2根瘤直接诱导培养基的筛选将外植体在培养基1/4MS+KT1.50mg·L^-1上培养出腋芽，待腋芽长至2～3cm时，将腋芽从叶腋处切下转接到以1/4MS为培养基，附加不同质量浓度的IAA、IBA(由预试验可知，IAA和IBA质量浓度均控制在0.10～0.50mg·L^-1之间)和GA₃(由预试验可知，质量浓度控制在0.30～1.00mg·L^-1之间)，添加蔗糖10g·L^-1，琼脂8.30g·L^-1，调节pH值为5.5。在温度(20±2)℃，光照强度1200lx条件下培养，光照周期14h·d^-1。培养40d统计并计算出根瘤诱导率，筛选最适宜的笃斯越桔根瘤诱导培养基。

1.3根瘤苗快繁体系的建立采用已产生根瘤的再生植株的茎节为材料在试管内利用节增殖的方法进行快繁，即将含有根瘤的试管苗于根上部向下留1～2叶切下，并将切下的小枝条再切割成一叶一段转接到优化后的根瘤诱导培养基中进行同时腋芽萌发、生长及根瘤再生培养。统计并计算出增殖周期和增殖倍数。

1.4数据分析与处理为了提高笃斯越桔根瘤的诱导率，采用均匀设计法^[8-10]，选用U₁₀(10³)均匀表，每个处理数接种腋芽数为30，重复3次，同时考察了IAA、IBA和GA₃质量浓度交叉配比对根瘤诱导率的影响。数据分析与处理采用均匀设计(Uniform Design)软件。

2结果与分析

2.11/4MS培养基中不同质量浓度IAA、IBA和GA₃的交叉配比对笃斯越桔根瘤诱导的影响

试验数据(表1)经均匀设计软件处理后得回归方程Y＝75.6+45.0X₁--18.0X₂-23.1X₃，样本容量N＝10，显著性水平α＝0.05，复相关系数R＝0.9754，检验值F_t＝39.18，临界值F_{(0.05，3，6)}＝4.757F_t＞F_{(0.05，3，6)}，回归方程显著。根据回归方程求出Y的最优组合为：X₁＝0.50，X₂＝0.10，X₃＝0.30，在此组合基础上求得最优解：y＝89.3，此解为回归方程的解析解，需按公式Y＝y±u_α·s(其中y为最优组合基础上求得的最优解，u_α为正态分布的双侧分位数，s为剩余标准差)计算出优化值区间估计为Y＝89.3±7.01，即82.29％～96.31％。通过计算各方程项对回归的贡献率(U₁/U＝38.3％，U₂/U＝6.70％，U₃/U＝28.6％)可知，IAA和GA₃对笃斯越桔试管苗根瘤诱导率Y的贡献远远大于IBA，又因IAA的质量浓度与根瘤诱导率呈正相关，IBA和GA₃的质量浓度与根瘤诱导率呈负相关，猜测IAA质量浓度在0.50mg·L^-1以上，IBA质量浓度在0.50mg·L^-1以下和GA₃质量浓度在0.30mg·L^-1以下有较高根瘤诱导率的峰值，因此，又以IAA质量浓度为0.50、0.60、0.70、0.80、0.90和1.00mg·L^-1，IBA质量浓度为0.02、0.04、0.06、0.08和0.10mg·L^-1以及GA₃质量浓度为0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24、0.27和0.30mg·L^-1做了10个处理的补充试验，重复3次，发现IAA质量浓度为0.80mg·L^-1、IBA质量浓度为0.04mg·L^-1和GA₃质量浓度为0.15mg·L^-1时笃斯越桔根瘤诱导率最高且诱导速度最快。即待笃斯越桔根芽嫩茎腋芽萌发生长至2～3cm时(见图1)，将腋芽从叶腋处切下转接到附加IAA0.80mg·L^-1、IBA0.04mg·L^-1和GA₃0.15mg·L^-1的1/4MS培养基中再次进行验证试验，每个处理数接种腋芽数为30，重复3次，腋芽培养至9d时发现腋芽切口处形成大量锥形颗粒，15d后颗粒由锥形状逐渐伸长形成白色的不定根；培养至27d时，不定根基部逐渐增粗且有半木质化现象出现(见图2)，35d后在主根和侧根上产生根瘤(见图3)，继续培养至47d后主根和侧根上的根瘤逐渐增多并形成窜状(见图4)，这样的苗由发根处又发出3～5根苗形成丛生状(见图5)，较未产生根瘤的植株(见图6)矮壮、生长势旺且根和苗的形态、发育均接近于野生植株，根瘤诱导率达95.6％以上。在估计区间内，比表1所列10个处理的诱导率均高。可见，笃斯越桔根瘤诱导的最佳培养基为：1/4MS+IAA0.80mg·L^-1+IBA0.04mg·L^-1+GA₃0.15mg·L^-1。

2.2根瘤苗快繁体系的建立

采取1.3的方法，待含有根瘤的苗生长至4.00cm以上时，在超净工作台上打开培养瓶将含有根瘤的试管苗于根上部留1～2叶切下，并将切下的小枝条再切割成一叶一段转接到优化后的根瘤诱导培养基1/4MS+IAA0.80mg·L^-1+IBA0.04mg·L^-1+GA₃0.15mg·L^-1中进行同时腋芽萌发、生长及根瘤再生培养。38d为1个继代增殖周期，每瓶增殖倍数平均达70以上，随着继代次数的增加可适当降低生长素IAA、IBA和GA₃浓度。

3结论与讨论

实验证明，培养基1/4MS+IAA0.80mg·L^-1+IBA0.04mg·L^-1+GA₃0.15mg·L^-1对笃斯越桔试管苗直接诱导根瘤效果最好，速度快且诱导率高。带有根瘤的苗由发根处又发出3～5根苗形成丛生状，植株矮壮、生长势旺且根和苗的形态、发育均接近于野生植株，可能是根瘤菌产生一定量的细胞分裂素、生长素等植物生长调节物质等原因。

Claims

1.一种笃斯越桔根瘤试管内直接诱导、快繁方法，其特征在于步骤如下：

(1)以笃斯越桔根部分蘖的嫩芽为外植体，对外植体进行处理，其适合的嫩芽根瘤诱导的培养基为：1/4MS+IAA0.80mg·L^-1+IBA0.04mg·L^-1+GA₃0.15mg·L^-1；

2.按照权利要求1所述的笃斯越桔根瘤试管内直接诱导、快繁方法，其特征在于对外植体进行处理是指在超净工作台上用70％酒精涮洗10s，用含3％次氯酸钠溶液浸泡3min，无菌水冲洗8次；用无菌滤纸吸干表面水分，切除被杀菌消毒剂损伤部分后切割成1～2叶1段作为外植体备用。

3.按照权利要求1所述的笃斯越桔根瘤试管内直接诱导、快繁方法，其特征在于诱导率为95.6％。