CN103238517B - 一种白刺松散型胚性愈伤组织的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种白刺松散型胚性愈伤组织的诱导方法，步骤如下：⑴剪取白刺无菌苗两叶片间的茎段，接种到培养基上进行松散型愈伤的诱导；⑵ 2-3周后，将诱导出的松散型白刺愈伤组织接种到培养基上进行胚性愈伤组织的诱导，在从松散型愈伤组织到胚性愈伤组织的诱导过程中，每5-8天继代培养一次，继代培养过程中，转移愈伤组织块；⑶当继代培养4-5次后，松软的白刺愈伤组织开始转变为较硬的愈伤组织，而且其颜色从白色透明状逐渐过渡到乳白色、黄色，最后为嫩绿色，此时的愈伤组织从组织结构上看为许多球状体构成的松散结构。当以上特征愈伤组织出现时，就完成了白刺的胚性愈伤组织的诱导。本方法通过对白刺胚性愈伤组织的诱导，建立了标准的白刺松散型胚性愈伤组织的诱导体系。
Description
技术领域
本发明属于农业和植物育种领域，尤其是一种白刺松散型胚性愈伤组织的诱导方法。
背景技术
白刺属(Nitraria L.),灌木,蒺藜科,全世界有12个种,我国有8个种,主要分布在干旱荒漠地带，其果实富含多种维生素和氨基酸,具有较高的药用和食用价值。据调查,白刺有雄性不育现象,且种间杂交混乱,分化严重,果实在大小、色泽和味道等方面都存在着很大的差异。因此,进行白刺离体繁育技术研究,对野生白刺资源良种选育及资源开发具有十分重要的现实意义。
由于白刺受制于本物种的遗传资源，一些新的优良性状不能产生，而一般的诱变育种又效率极低，很难诱变出新的优良性状，虽然基因转化技术可以将目的基因导入到白刺基因组，但由于转基因植物很难环境释放，因此该技术也只停留在实验室阶段。白刺体细胞离体诱变克隆技术的研究可以为白刺育种提供一条新的途径，从而丰富白刺种质资源，为白刺的推广利于奠定基础。
进行体细胞诱变克隆育种的基础就是建立高效的单个体细胞离体再生体系，而胚性愈伤组织是最适合的诱变对象，其主要优势在于：一是胚性愈伤细胞处于旺盛分裂状态，细胞内的遗传物质十分活跃，极易产生变异，这种现象在外加诱变剂的条件下表现更为明显；二是胚性愈伤组织细胞在数量上有明显的优势，其每个细胞都可被看成单个的诱变对象，从而增加了诱变效率；三是胚性愈伤组织可以分散为多个独立的个体，如采用细胞液悬浮培养技术获得的每个突变植株都是由单个的独立的胚性变异细胞分裂、分化形成的，从而避免了常规诱变下出现的嵌合体现象。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种白刺松散型胚性愈伤组织的诱导方法，从而提高利用愈伤组织进行的白刺体细胞诱变克隆育种的效率。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种白刺松散型胚性愈伤组织的诱导方法，步骤如下：
⑴剪取白刺无菌苗两叶片间的茎段，接种到1/2MS+0.5-1.0mg/L 2,4-D+100mg/L Vc+20g/L蔗糖的培养基上进行松散型愈伤组织的诱导，培养条件为23-25℃，每天光照12小时，光照强度为500-1000lux；
⑵2-3周后，将诱导出的松散型白刺愈伤组织接种到MS+2.0-3.0mg/LKT+0.25-0.5mg/L 2,4-D +100mg/L Vc+30g/L蔗糖的培养基上进行胚性愈伤的诱导，培养条件为18-22℃，每天24小时光照，光照强度为1000-2000lux，在从松散型愈伤组织向胚性愈伤组织的诱导过程中，每5-8天继代一次，继代过程中，转移愈伤块；
⑶当继代4-5次后，松散的白刺愈伤组织开始转变为较硬的愈伤，而且颜色从白色透明状逐渐过渡到乳白色、黄色，最后为嫩绿色，此时的愈伤组织从结构上看由许多球状体构成，结构松散，当以上特征愈伤出现时，白刺的胚性愈伤组织诱导完成。
而且，所述转移愈伤组织块的大小控制在2-3mm3。
而且，所述愈伤组织块选择的是愈伤组织外围部位的组织作为下一次继代培养的外植体。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明采用松散型胚性愈伤组织的诱变育种方式，松散型胚性愈伤组织的优势如下：
首先，松散的胚性愈伤组织易于分离，可以直接用于悬浮的胚性愈伤细胞的培养，简化了在液体培养时通过反复的继代培养来获取分散度均匀的细胞系的程序；
其次，松散的胚性愈伤组织在进行培养、继代过程中，由于其结构松散，愈伤团细胞间留有充足的空间，可以避免愈伤组织内部细胞由于氧气及营养等供应不良而导致的提前老化，导致只有愈伤组织团块外围的少量细胞处于活跃状态，使得供试材料减少，影响下一步的试验效果；
第三，松散型胚性愈伤组织在进行诱变育种或在其它研究中，由于其细胞结构松散，使每个细胞都处于相同的的处理或生理生长状态，可以保证试验处理的均等性或同一性；
第四，松散型胚性愈伤组织从细胞数量来看，处于胚性阶段的细胞要明显多于紧密型愈伤组织，因为紧密型愈伤内部由于营养不足及气体交换的困难，使其细胞的生理状态受到严重影响，多数细胞已不具备胚性细胞的功能，如仍然以其作为诱变材料的话，只能取其愈伤组织外围的很少量的细胞进行有效的诱变及再生，其余的绝大多数细胞均老化、死亡；从而，使诱变效率降低。
2、本方法通过对白刺胚性愈伤组织的诱导，建立了标准的白刺松散型胚性愈伤组织的诱导体系，为以后采用体细胞诱变育种技术培育白刺新品种奠定了基础，也为其它植物品种胚性愈伤组织的诱导提供了参考。
附图说明：
图1为本发明诱导出的松散型白刺胚性愈伤组织；
图2为本发明松散型白刺胚性愈伤组织再生出芽；
图3为本发明初步诱导出的松散型半透明白色的白刺愈伤组织。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明进一步说明，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。
一种白刺松散型胚性愈伤组织的诱导方法
⑴取白刺实生苗一年生嫩枝，用40%的安替福民消毒处理后接种到1/2MS培养基上进行无菌苗的培养与继代；
⑵剪取白刺无菌苗两叶片间的茎段（不带叶片），接种到1/2MS+0.5mg/L（2,4-D）+100mg/L （Vc）+20g/L蔗糖的培养基上进行松散型愈伤组织的诱导，培养条件为25℃，每天光照12小时，光照强度为1000lux。
其中Vc是在培养基融化后处于50℃时加入，Vc为提前抽滤灭菌。
⑶三周后，将诱导出的松散型白刺愈伤组织接种到MS+2.0mg/L（KT）+0.25mg/L（2,4-D ）+100mg/L（Vc）+30g/L蔗糖的培养基上进行胚性愈伤组织的诱导，培养条件为18-22℃，每天24小时光照，光照强度为2000lux。在从松散型愈伤组织诱导向胚性愈伤组织诱导的过程中，每7天继代一次，继代过程中，转移愈伤组织块的大小控制在3mm3，尽量选择愈伤组织外围部位作为下一次继代培养的外植体。
⑷当继代培养4次后，松软的白刺愈伤组织开始转变为较硬的愈伤组织，而且颜色从白色透明状逐渐过渡到乳白色、黄色，最后为嫩绿色，此时的愈伤组织从结构上看基本由无数极小的球状体构成，且其结构十分松散，极易分散开来。当以上特征愈伤组织出现时，标志着诱导过程完成，即白刺的胚性愈伤组织诱导成功，可以利用其进行进一步的研究及应用。
Claims (2)
1.一种白刺松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于：步骤如下：
⑴剪取白刺无菌苗两叶片间的茎段，接种到1/2MS+0.5-1.0mg/L2,4-D+100mg/L Vc+20g/L蔗糖的培养基上进行松软型愈伤的诱导，培养条件为23-25℃，每天光照12小时，光照强度为500-1000lux；
⑵2-3周后，将诱导出的松软型白刺愈伤组织接种到MS+2.0-3.0mg/LKT+0.25-0.5mg/L2,4-D+100mg/L Vc+30g/L蔗糖的培养基上进行胚性愈伤的诱导，培养条件为18-22℃，每天24小时光照，光照强度为1000-2000lux，在从松软型愈伤诱导向胚性愈伤诱导过程中，每5-8天继代一次，继代过程中，转移愈伤块；
⑶当继代4-5次后，松软的白刺愈伤组织开始转变为较硬的愈伤，而且颜色从白色透明逐渐过渡到乳白色、黄色，最后为嫩绿色，此时的愈伤组织从结构上看由球状体构成，结构松散，当以上特征愈伤出现时，白刺的胚性愈伤组织诱导完成；
所述转移愈伤块的大小控制在2-3mm3。
2.根据权利要求1所述的白刺松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于：所述愈伤块选择愈伤组织外围部位作为下一次继代的外植体。
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