CN110663550A - 一种丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导方法，步骤如下：取不带侧芽的丝棉木新稍茎段为外植体，在含有1mg/L激素2,4‑D和30g/L蔗糖的MS培养基上诱导出松散型愈伤组织；转接到含有0.5mg/L激素BA、0.5mg/L激素2,4‑D和30g/L蔗糖的MS培养基上，经过30d培养，获得胚性愈伤组织；转接到含有0.25mg/L激素BA、0.5mg/L激素2,4‑D和30g/L蔗糖的MS培养基上，继代时将结构松散的愈伤组织转接到新的培养基上，即获得生长稳定的丝棉木松散型胚性愈伤组织。本方法为丝棉木的体细胞诱变与遗传转化研究奠定基础，该方法能够应用在在丝棉木的组培快繁或离体诱变育种方面中。

Description

一种丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导方法和应用

技术领域

本发明属于植物培养技术领域，尤其是一种丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导方法和应用。

背景技术

胚性愈伤组织在体细胞离体诱变研究和基因转化中是理想的试验材料，但在诱导过程中会遇到很多的技术问题，主要是愈伤组织胚性化过程复杂，除了激素对愈伤组织诱导影响外，还会受到继代时间、培养条件等因素的影响，除此之外，愈伤组织的结构对其应用也影响较大，松散型结构特点会提高体细胞诱变效率和基因转化效率，因此，一般在诱导胚性愈伤组织的同时要对愈伤组织结构进行选择，诱导出松散型的胚性愈伤组织。

通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

一种丝棉木组织培养的培养基及方法(CN106577283A)，提供了适用于丝棉木新品种金枝玉叶的组织培养培养基，以1/2MS培养基为基础，添加KT、NAA、TDZ和赤霉素进行愈伤组织的诱导，以MS培养基为基础，添加KT和TDZ进行丛生芽的诱导，以WPM培养基作为炼苗培养基。在本发明提供培养基的诱导下，经诱导可使增值系数提高至9.72，幼苗成活率可达93％。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导方法和应用，该方法为丝棉木的体细胞诱变与遗传转化研究奠定基础，该方法能够应用在在丝棉木的组培快繁或离体诱变育种方面中。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导方法，步骤如下：

⑴取不带侧芽的丝棉木新稍茎段为外植体，在含有1mg/L激素2,4-D和30g/L蔗糖的MS培养基上诱导出松散型愈伤组织；

⑵将松散型愈伤组织转接到含有0.5mg/L激素BA、0.5mg/L激素2,4-D和30g/L蔗糖的MS培养基上，经过30d培养，获得胚性愈伤组织；

⑶将诱导出的胚性愈伤组织转接到含有0.25mg/L激素BA、0.5mg/L激素2,4-D和30g/L蔗糖的MS培养基上，继代时将结构松散的愈伤组织转接到新的培养基上，继代时间为10d，培养温度为23℃，经过3-5次继代培养，即获得生长稳定的丝棉木松散型胚性愈伤组织。

而且，所述步骤⑴中丝棉木新稍茎段的制备步骤如下：

将丝棉木新稍在超净台中剪成小段，每个茎段上不要带有侧芽，选用没有木质化的新稍部位；将剪好的新稍茎段先在70％的乙醇中浸泡30s，取出后将其浸泡在事先配制的消毒液中进行表面消毒，消毒液为次氯酸钠水溶液，其中有效氯含量为2％，消毒时间设置为15min，将经过消毒的丝棉木茎段用灭菌后的蒸馏水反复冲洗茎段表面，将多余的消毒液洗干净，每次冲洗时间为10min，将表面消毒后的茎段用无菌滤纸吸干多余水分。

而且，所述步骤⑴中培养基灭菌前的pH值为5.8。

而且，所述步骤⑴中诱导时的条件为：25℃连续光照条件下培养，光照强度为1000Lx，培养40±2d。

而且，所述步骤⑵中将松散型愈伤组织在超净台中切成大小3-5mm的小块后再进行转接。

而且，所述步骤⑵中培养的条件为25℃连续光照，光照强度2000Lx。

而且，所述步骤⑵中⑶将诱导出的胚性愈伤组织在超净台中切成大小3mm小块再进行转接。

如上所述的丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导方法在丝棉木的组培快繁或离体诱变育种方面中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明方法为了获得丝棉木松散型胚性愈伤组织，以丝棉木茎段为外植体，在一系列培养基上进行愈伤组织、胚性愈伤组织和松散型胚性愈伤组织的诱导，并结合继代选择及显微镜镜检观察的措施，最终建立丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导体系，为丝棉木的体细胞诱变与遗传转化研究奠定基础，该方法能够应用在在丝棉木的组培快繁或离体诱变育种方面中。

2、本发明方法获得的胚性愈伤组织可以直接在无激素的培养基上直接成苗，不需要激素诱导，繁殖系数高，成苗率高。

3、本发明方法获得的松散型胚性愈伤组织因其结构松散、生理活跃可以提高定向离体诱变效率。

4本发明方法获得的松散型胚性愈伤组织生长均一，细胞间差异较小，可用于多种科学研究。

5、可以利用本发明方法获得的松散型胚性愈伤组织进行植物组织脱毒培养，可以提高脱毒效率，脱毒方法简单易行；

6、可以利用本发明方法获得的松散型胚性愈伤组织作为生物反应器进行次生代谢物的生产，因其容易分散成单个细胞，可用于液体悬浮培养，提高次生代谢物的生产效率；

7、因为松散型胚性愈伤组织在基因转化时每个细胞都可以看成是转化对象，从而提高转化效率，同时又是单细胞再生，可以避免转化嵌合体的出现；

8、松散型胚性愈伤组织分散性好，再生容易，可以利用细胞融合技术进行新品种培育。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导方法，步骤如下：

⑴取不带侧芽的丝棉木新稍茎段为外植体，在含有1mg/L激素2,4-D和30g/L蔗糖的MS培养基上诱导出松散型愈伤组织；

⑵将松散型愈伤组织转接到含有0.5mg/L激素BA、0.5mg/L激素2,4-D和30g/L蔗糖的MS培养基上，经过30d培养，获得胚性愈伤组织；

⑶将诱导出的胚性愈伤组织转接到含有0.25mg/L激素BA、0.5mg/L激素2,4-D和30g/L蔗糖的MS培养基上，继代时将结构松散的愈伤组织转接到新的培养基上，继代时间为10d，培养温度为23℃，经过3-5次继代培养，即获得生长稳定的丝棉木松散型胚性愈伤组织。

较优地，所述步骤⑴中丝棉木新稍茎段的制备步骤如下：

将丝棉木新稍在超净台中剪成小段，每个茎段上不要带有侧芽，选用没有木质化的新稍部位；将剪好的新稍茎段先在70％的乙醇中浸泡30s，取出后将其浸泡在事先配制的消毒液中进行表面消毒，消毒液为次氯酸钠水溶液，其中有效氯含量为2％，消毒时间设置为15min，将经过消毒的丝棉木茎段用灭菌后的蒸馏水反复冲洗茎段表面，将多余的消毒液洗干净，每次冲洗时间为10min，将表面消毒后的茎段用无菌滤纸吸干多余水分。

较优地，所述步骤⑴中培养基灭菌前的pH值为5.8。

较优地，所述步骤⑴中诱导时的条件为：25℃连续光照条件下培养，光照强度为1000Lx，培养40±2d。

较优地，所述步骤⑵中将松散型愈伤组织在超净台中切成大小3-5mm的小块后再进行转接。

较优地，所述步骤⑵中培养的条件为25℃连续光照，光照强度2000Lx。

较优地，所述步骤⑵中⑶将诱导出的胚性愈伤组织在超净台中切成大小3mm小块再进行转接。

如上所述的丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导方法在丝棉木的组培快繁或离体诱变育种方面中的应用。

具体地，为了建立丝棉木松散型胚性愈伤组织培养体系，本发明采用丝棉木茎段为外植体，在含有不同激素的培养基上进行愈伤组织的诱导，从中筛选出能够诱导出结构松散的愈伤组织的培养基配方；将诱导出的松散型愈伤组织转接到含有不同激素的培养基上，从中筛选出能够诱导出胚性愈伤组织的培养基配方；将诱导出的胚性愈伤组织转接到含有不同激素的培养基上，经过不同行的继代时间、温度和继代筛选，最终找到适宜的丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导的条件。试验结果显示：丝棉木茎段外植体，在MS+1mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培养基上可以诱导出松散型愈伤组织；将松散型愈伤组织转接到MS+0.5mg/LBA+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培养基上，经过30d培养，即可获得胚性愈伤组织；将诱导出的胚性愈伤组织转接到MS+0.25mg/LBA+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培养基上，继代时将结构松散的愈伤组织转接到新的培养基上，继代时间为10d，培养温度为23℃，经过3-5次继代培养即可获得生长稳定的丝棉木松散型胚性愈伤组织。本发明可用于丝棉木的组培快繁或离体诱变育种等研究。

更为具体的步骤如下：

1、材料与方法

1.1试验材料本发明所用的丝棉木外植体取自天津农学院东校区院内。在4月中旬，选取生长健壮的10年生丝棉木植株，中上部枝条，将新稍剪下备用。

1.2外植体消毒处理

将取回的丝棉木新稍在超净台中剪成小段，每个茎段上不要带有侧芽，尽可能选用没有木质化的新稍部位。将剪好的新稍茎段先在70％的乙醇中浸泡30s，取出后将其浸泡在事先配制的消毒液中进行表面消毒。消毒液为次氯酸钠水溶液，其中有效氯含量为2％，消毒时间设置为15Min，将经过消毒的丝棉木茎段用灭菌后的蒸馏水反复冲洗茎段表面，将多余的消毒液洗干净，每次冲洗时间为10Min。将表面消毒后的茎段用无菌滤纸吸干多余水分。

1.2.2丝棉木松散型愈伤组织的诱导试验

将消毒处理好的丝棉木茎段接种到事先配制的丝棉木松散型愈伤组织诱导培养基上。培养基以MS为基本培养基，其中添加不同的激素。培养基中加入30g/L蔗糖和7g/L琼脂粉，灭菌前将pH值调节到5.8。采用100ml广口三角瓶为容器，瓶中加入配好的培养基40ml。每个试验处理即每种培养基重复5瓶，每瓶中接种丝棉木茎段外植体8块。将接种好的三角瓶放到组培室中进行培养。培养条件为：25℃连续光照条件下培养，光照强度为1000Lx。每天观察外植体伤口处愈伤组织生长情况，经过大约40d时间对每个处理茎段外植体愈伤组织诱导情况进行统计记录。

1.2.3丝棉木胚性愈伤组织的诱导试验

将上一步骤诱导出的丝棉木松散性愈伤组织从外植体上切下，在超净台中将愈伤组织切成大小3-5mm的小块。将切好的丝棉木愈伤组织转接到事先配制好的丝棉木胚性愈伤组织诱导培养基上。培养基也是采用MS为基本培养基，其中加入各种激素。试验采用100ml广口三角瓶为试验容器，加入各种胚性愈伤组织诱导培养基40ml，培养基的配制与上一步骤相同。试验采用10个重复，每瓶接种8块愈伤组织。培养条件为25℃连续光照，光照强度2000Lx。接种后每天观察愈伤组织生长，并采用显微镜观察愈伤组织的胚性情况。经过大约40d培养，观察记录每个试验处理中愈伤组织生长情况。

1.2.4丝棉木松散型胚性愈伤组织的诱导试验

将上一步骤诱导出的胚性愈伤组织在超净台中切成大小3mm小块，将其接种到事先配制好的丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导培养基上，培养基也是采用MS为基本培养基，其中加入不同的激素。培养基的配制与培养与前一步骤相同，只是试验采用10d继代培养一次，每次继代时观察愈伤组织胚性变化，将结构松散、接近胚性的愈伤组织转接到新的培养基上。培养中采用23℃的培养温度。经过大约5次继代培养，记录每个处理获得的愈伤组织生长情况。

2、结果与分析

2.1丝棉木松散型愈伤组织的诱导试验结果

将丝棉木茎段接种到愈伤组织诱导培养基上，经过大约20d时间，在外植体的伤口部位长出白色的愈伤组织，每种处理愈伤组织颜色与生长速度不同，经过40d时间，不同处理出现较大差异，具体试验结果见表1.

表1丝棉木茎段外植体在不同激素的培养基上愈伤组织诱导结果

从表1可以看出，在所用培养基上都可以诱导出愈伤组织，说明丝棉木容易诱导愈伤组织，但从愈伤组织生长情况来看，在不同培养基上差异较大。具体来看，在MS培养基上，初始培养20d后就可以见到伤口部位出现愈伤组织，从愈伤组织生长速度来看，愈伤组织生长缓慢，质地坚硬，结构也是紧密型，颜色为绿色，这种愈伤组织一般很难诱导结构松散的愈伤组织。在MS附加2,4-D的培养基上，愈伤组织生长速度明显加快，在2,4-D为0.5mg/L时愈伤组织质地较硬，结构也是紧密的，当其浓度为1.0mg/L时，生长速度明显加快，结构也变得松散了。继续增加其浓度即2.0mg/L时，生长速度继续增加，只是愈伤组织的质地变得松软，白色，这种愈伤组织最终会老化褐变死亡，一般不能继续诱导胚性愈伤组织。因此在2,4-D的浓度为1.0mg/L时诱导出的愈伤组织适于继续诱导胚性愈伤组织；当在此基础上增加BA时，愈伤组织结构变得紧密，颜色转为绿色，这种愈伤组织虽然可以进一步诱导再生，但由于其结构紧密不适合进一步诱导松散型胚性愈伤组织，所以不作为理想的愈伤组织类型。综合以上试验结果选择MS+1mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培养作为丝棉木松散型愈伤组织诱导的理想培养基。

2.2丝棉木胚性愈伤组织诱导的试验结果

将上一步骤获得的丝棉木松散性愈伤组织转接到胚性愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织出现不同的变化，有的结构出现了变化，有的质地变软，结合镜检，多数在细胞组成方面出现较大差异，具体情况见表2。

表2不同培养基对丝棉木愈伤组织胚性诱导的试验结果

从表2可以看出，不同培养基上愈伤组织胚性与愈伤组织形态、生长速度都存在较大的差异，具体来看，在只是有2,4-D时，愈伤组织继续增殖生长，为白色、质地较硬的松散型愈伤组织，生长速度仍然保持较快的速度，只是愈伤组织细胞基本是非胚性的薄壁细胞；在单独使用BA时，愈伤组织很快变得坚硬，结构紧密，表面变得浓绿，生长速度变慢，经过镜检观察，愈伤组织内部出现组织化，只有表面有分生组织细胞，不具有胚性化细胞结构，这种愈伤组织已经失去薄壁细胞的特点，变成了成熟组织。当BA的使用浓度变成1.0mg/L时，这种趋势更为严重，不是理想的胚性愈伤组织诱导培养基；为此，试验采用BA与2,4-D混合使用，当采用较高的BA和较低的2,4-D时，即MS+1.0mg/LBA+0.5mg/L2,4-D时，愈伤组织结构紧密，但在愈伤组织边缘一些细胞镜检后表现为胚性细胞特性，而采用较低BA和较高2,4-D时，即MS+0.5mg/LBA+1.0mg/L2,4-D，愈伤组织结构变得松散，但胚性只有少数细胞达到，继续培养，这些胚性化的细胞会逐渐消失。而采用MS+0.5mg/LBA+0.5mg/L2,4-D培养基，愈伤组织基本为胚性细胞组成，只是结构并不松散，为此将其转接到新的培养基上，结合继代选择诱导其产生松散型胚性愈伤组织。

2.3丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导结果

为了获得丝棉木松散型胚性愈伤组织，试验将上一步骤获得愈伤组织继续在新的培养基上继代培养，通过继代时镜检及选择结构适合的培养基继代，经过5次继代，在一些试验处理中出现了生长稳定的丝棉木松散型胚性愈伤组织，具体试验结果见表3.

表3丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导结果

从表3可以看出，采用不同培养基获得的愈伤组织在胚性化、质地与结构上存在较大的差异。具体来看，在培养基不变的情况下，丝棉木结构紧密的胚性愈伤组织还是保持其胚性，只是愈伤组织结构变得越来越紧密，并在愈伤组织中部出现组织化现象，如果不进行激素的调整，这种愈伤组织最终会失去胚性，不能进行其它应用。因此必须要进行培养基的调整；当培养基中将BA去除，只加入2,4-D，愈伤组织很容易失去胚性，而且其结构也保持紧密状态，这种愈伤组织不能进行体细胞诱变和基因转化应用；当采用0.5mg/LBA+1.0mg/L2,4-D激素组合时，愈伤组织逐渐变得松散，但失去了胚性，说明高浓度2,4-D不利于胚性的保持；为此在降低2,4-D使用浓度的同时，降低BA的浓度，即采用0.25mg/LBA+0.5mg/L2,4-D组合，愈伤组织结构逐渐变得松散，每次继代时选择结构松散的愈伤组织进行转移，将结构紧密的舍弃，经过大约3次继代培养后，愈伤组织基本为松散型胚性愈伤组织。当在此基础上增加2,4-D的用量，愈伤组织松散型很容易改善，但胚性也失去很快，因此应适当调整BA与2,4-D的浓度比例才能获得理想的效果。试验中也曾改变继代时间，最终选择10d作为理想的继代时间，过长时间会导致胚性化减弱，而时间过短会增加工作量，造成愈伤组织机械损伤，不利于松散型结构愈伤组织的选择培养。综上所述，理想的丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导培养为：MS+0.25mg/LBA+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培养基。继代时将结构松散的愈伤组织转接到新的培养基上，继代时间为10d，培养温度为23℃，经过3-5次继代培养即可获得生长稳定的丝棉木松散型胚性愈伤组织。

3、讨论

3.1愈伤组织诱导中2,4-D的使用对愈伤组织结构的影响

在诱导愈伤组织过程中经常会用到2,4-D，因为2,4-D有利于植物细胞形成薄壁细胞转变为愈伤组织，但在诱导愈伤组织的同时，2,4-D的使用也影响着愈伤组织结构的变化。首先，较高浓度的2,4-D会加快愈伤组织形成，也就是加快细胞快速膨大，这样会改变原有细胞间的紧密联系，使得新生细胞之间变得不紧密，从而导致愈伤组织整体结构变得松散，如本研究中，在加入2,4-D后，愈伤组织结构变得松散。但并不是2,4-D越高越有利于愈伤组织结构松散，一般都要求2,4-D有一个适宜的用量，过高会对植物细胞起到毒害作用，还会导致愈伤组织质地变得过软，导致细胞解体死亡。其次，在2,4-D不能调节愈伤组织结构时，配合一定量的BA可以调节愈伤组织的结构。在本发明中，为了获得松散型胚性愈伤组织，试验通过加入低浓度的BA后，就可以获得松散型愈伤组织，这说明BA配合2,4-D的使用对愈伤组织结构改善有着重要作用。另外，2,4-D在使用时应配合继代时对愈伤组织的选择，将结构理想的愈伤组织进行继代，舍弃结构紧密的愈伤组织，只有每次继代时的合理选择才能在较短时间内获得理想的愈伤组织。

3.2细胞分裂素对于植物细胞胚性化的作用

为了获得胚性愈伤组织，本发明采用培养基中加入一定量的BA，配合一定浓度的2,4-D进行诱导，最终选择MS+0.5mg/LBA+0.5mg/L2,4-D培养基，获得了丝棉木的胚性愈伤组织。BA在使用中主要作用是促使植物细胞逐渐转变为胚性细胞，这在胚性愈伤组织诱导中经常会用到分裂素的原因。除了分裂素有利于胚性化之外，一些其它因素也促进胚性化，如培养过程中的逆境处理，这些都对胚性化起到重要作用，因此在诱导愈伤组织胚性化时应综合多种因素，进行胚性化的诱导。如本发明中增加了继代时的选择，通过镜检即时调整培养基配方，选择适宜的愈伤组织类型进行继代，这些都是诱导胚性愈伤组织的关键。在使用分裂素诱导愈伤组织胚性化时，要注意一些问题：首先应配合一定的2,4-D使用，因为2,4-D会维持细胞的薄壁特性，即可以保持细胞的愈伤组织特性，如果不加2,4-D，就会导致愈伤组织过早成熟化，形成结构组织，丧失愈伤组织的特性；其次，使用浓度不宜过高，否则会造成细胞失去愈伤组织特性，分化出不定芽等组织结构，还可以加快愈伤组织老化褐变。另外，在使用分裂素时应尽可能采用低浓度，因为高浓度还会导致植物细胞出现遗传变异，不能进行其它试验。

3.3继代时间与继代时适宜的选择是诱导松散型胚性愈伤组织的关键

在本发明中，为了获得丝棉木松散型胚性愈伤组织，主要通过改变培养基中的激素水平，虽然起到了关键作用，但在试验中更主要是采用适当的继代时间和继代时适宜的选择。如果单一性通过培养基诱导，也可以获得松散型胚性愈伤组织，但不注意选择，会造成一直是将胚性与非胚性愈伤组织，以及结构松散与紧密型的愈伤组织混合继代，因为愈伤组织不论在胚性上还是在结构上，都是逐渐转变的，即在一块愈伤组织中部分细胞出现变化，而另一部分则变化较慢，因此，在继代培养中，通过有目的的取舍，会加快愈伤组织转变，同时也会避免因为一些非胚性细胞的竞争优势导致已经胚性化的组织丢失。所以在继代时要结合镜检，判断哪些愈伤组织是胚性的，哪些不是，做到有目的的取舍，只有这样才能获得理想的诱导效果。

4、结论

本发明通过对丝棉木松散型胚性愈伤组织的诱导，找到了诱导过程中每个环节的关键条件，从而建立了一套高效的愈伤组织诱导体系，现将试验结果总结如下：取不带腋芽的丝棉木新稍茎段为外植体，在MS+1mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培养基上可以诱导出松散型愈伤组织；将松散型愈伤组织转接到MS+0.5mg/LBA+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培养基上，经过30d培养，即可获得胚性愈伤组织；将诱导出的胚性愈伤组织转接到MS+0.25mg/LBA+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培养基上，继代时将结构松散的愈伤组织转接到新的培养基上，继代时间为10d，培养温度为23℃，经过3-5次继代培养即可获得生长稳定的丝棉木松散型胚性愈伤组织。本发明结构可用于丝棉木的组培快繁或离体诱变育种等研究。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (8)

1.一种丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导方法，其特征在于：步骤如下：

⑴取不带侧芽的丝棉木新稍茎段为外植体，在含有1mg/L激素2,4-D和30g/L蔗糖的MS培养基上诱导出松散型愈伤组织；

⑵将松散型愈伤组织转接到含有0.5mg/L激素BA、0.5mg/L激素2,4-D和30g/L蔗糖的MS培养基上，经过30d培养，获得胚性愈伤组织；

⑶将诱导出的胚性愈伤组织转接到含有0.25mg/L激素BA、0.5mg/L激素2,4-D和30g/L蔗糖的MS培养基上，继代时将结构松散的愈伤组织转接到新的培养基上，继代时间为10d，培养温度为23℃，经过3-5次继代培养，即获得生长稳定的丝棉木松散型胚性愈伤组织。

2.根据权利要求1所述的丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导方法，其特征在于：所述步骤⑴中丝棉木新稍茎段的制备步骤如下：

将丝棉木新稍在超净台中剪成小段，每个茎段上不要带有侧芽，选用没有木质化的新稍部位；将剪好的新稍茎段先在70％的乙醇中浸泡30s，取出后将其浸泡在事先配制的消毒液中进行表面消毒，消毒液为次氯酸钠水溶液，其中有效氯含量为2％，消毒时间设置为15min，将经过消毒的丝棉木茎段用灭菌后的蒸馏水反复冲洗茎段表面，将多余的消毒液洗干净，每次冲洗时间为10min，将表面消毒后的茎段用无菌滤纸吸干多余水分。

3.根据权利要求1所述的丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导方法，其特征在于：所述步骤⑴中培养基灭菌前的pH值为5.8。

4.根据权利要求1所述的丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导方法，其特征在于：所述步骤⑴中诱导时的条件为：25℃连续光照条件下培养，光照强度为1000Lx，培养40±2d。

5.根据权利要求1所述的丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导方法，其特征在于：所述步骤⑵中将松散型愈伤组织在超净台中切成大小3-5mm的小块后再进行转接。

6.根据权利要求1所述的丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导方法，其特征在于：所述步骤⑵中培养的条件为25℃连续光照，光照强度2000Lx。

7.根据权利要求1至6任一项所述的丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导方法，其特征在于：所述步骤⑵中⑶将诱导出的胚性愈伤组织在超净台中切成大小3mm小块再进行转接。

8.如权利要求1至7任一项所述的丝棉木松散型胚性愈伤组织诱导方法在丝棉木的组培快繁或离体诱变育种方面中的应用。