CN100998316B - N-苯基-n′-1,2,3-噻二唑-5-脲在天山雪莲快速繁殖中的应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，特别涉及植物生长调节剂N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲在天山雪莲快速繁殖中的应用方法。通过使用新型植物生长调节剂TDZ获得具有强分化能力的天山雪莲脱分化组织，这种组织可在TDZ培养基上多次继代，当移入无激素培养基上，经过20～40的培养，可产生大量的芽。经过低温处理可强化这种组织的分化能力。将产生的芽移到生根培养基上诱导生根，两周以后，生根率可达95％。本发明利用新型生长调节剂对天山雪莲的形态发生进行调控，结合低温处理，建立了天山雪莲种苗可持续化生产的新型工艺。与传统的利用外植体一次性诱导再生的方法相比较，具有材料利用率高、生产效率高、节省了人力、物力等优点。

Description

N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲在天山雪莲快速繁殖中的应用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及新型植物生长调节剂TDZ(N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲)在天山雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.exMaxim)快速繁殖中的应用方法。
背景技术
天山雪莲属菊科(Compositae)菜蓟族(Trib.Cynareae Less.)凤毛菊属(Saussurea sp.)植物，是我国高山地区民间常用的一类名贵中草药。雪莲性温、味微苦，具有散寒除湿、强筋助阳、抗炎镇痛、收缩子宫等功能，可治疗风湿性关节炎、妇女小腹冷痛、阳痿、抗衰老及抑制癌细胞增生等。其主要的活性成分是黄酮、生物碱、多糖。
天山雪莲属多年生草本植物，生长在海拔2500～3000米雪线以上的环境中，生长缓慢；天山雪莲为一次性开花结实的植物，生育年龄为5～6年，仅以有性繁殖的方式进行繁殖，由于生长环境的土壤极为贫瘠和气候极端恶劣，种子的萌发率和成活率非常低，繁殖相当困难。近年来，随着市场对雪莲的需求不断增长，野生雪莲遭到了毫无节制地掠夺性盗采，致使野生雪莲资源严重匮乏，1988年天山雪莲的资源总量还有2830多万株，而现在可采集量仅为300万株，已被列为国家二级野生保护植物。为了保护野生天山雪莲种质和满足市场的需求，对天山雪莲进行快速繁殖是一条可选择的途径。M.Joshi(2003)以子叶为外植体对同属植物星状雪兔子(Saussureaobvallata(DC))进行了试管繁殖，经过75天的培养，每个外植体上产生了5个芽，在添加0.5mg/L的1/2MS固体培养基上诱导出根，获得完整的植株。中国的杨金玲等在2001年，陈亚琼等在2003年建立了水母雪莲的人工快速繁殖体系；中国的付春祥等在2004年通过毛状根途径建立了天山雪莲的再生体系。尽管都获得了再生植株，但是繁殖效率均比较低；再者，由于采用的是一次性利用外植体的方式进行繁殖，避免不了要使用更多的野生资源，不利于实现连续性生产。
TDZ是人工合成的苯基脲(N-苯基-N′-1，2，3-噻唑-5-脲)衍生物，它能够诱导外植体从愈伤组织形成到体细胞胚胎发生的一系列不同反应，具有植物细胞生长素和植物细胞分裂素的双重功效作用的特殊功能。在组织培养中TDZ通过单独或与其它生长调节物质共同对植物细胞起作用，低浓度的TDZ在较短的时间就能有效的刺激植株再生。TDZ诱导植物细胞形态发生的能力与TDZ的使用浓度和处理时间密切相关，高浓度TDZ抑制植物细胞的形态发生，使细胞处于脱分化状态；TDZ的处理时间对细胞的分化亦有很大的影响，刘春朝等(2003)研究了TDZ在青蒿(Artemisia judaica L.)植株中的作用，结果表明青蒿下胚轴在1μM的TDZ培养基上处理20天产生的芽数达到最大为16个，处理时间延长则芽数减少。自20世纪90年代以来，有关TDZ诱导的植物形态发生过程的研究迅速增加。已经成功的应用在仙客来、天竺葵、葡萄、亚麻、青蒿、花生、金丝桃、紫罗兰等植物的形态发生上。
发明内容
本发明的目的是以实现天山雪莲快速繁殖为目的，利用新型生长调节剂TDZ调控雪莲组织细胞的形态发生，实现科学化繁育，从而提供一种TDZ在天山雪莲快速繁殖中的应用方法。本发明的方法与传统的利用外植体一次性诱导再生的方法相比，具有材料利用率高、生产效率高的优点，容易实现规模化生产。
本发明利用TDZ的生物学特性即在高浓度下保持雪莲细胞的脱分化状态、在低浓度下诱导雪莲细胞的分化和天山雪莲本身属高原耐寒冷植物的特性建立了天山雪莲的人工快速繁殖体系，整个工艺简单可行，既节省了原材料的使用量，又缩短了雪莲试管苗的成株周期，增加了单位时间内雪莲的再生频率和再生数量，容易实现雪莲种苗的规模化生产。
本发明TDZ在天山雪莲快速繁殖中的应用方法的工艺路线如图1所示。总体分为两个阶段，第一阶段获得具有强分化能力的脱分化组织；第二阶段通过低温处理强化脱分化组织在继代过程中的形态发生潜能，并以该组织为原料周而复始地诱导不定芽的产生，然后诱导生根。其步骤如下：
(1).取天山雪莲种子，用10％次氯酸钠溶液或0.1％氯化汞溶液进行表面灭菌，然后接到无激素的MS(Murashige-Skoog)固体培养基上。待幼苗生长15～42天后，取其根、茎、叶接种到含0.25～5μM TDZ的MS培养基上诱导脱分化，培养温度25±2℃，光照强度为500～5000Lux、光周期10～16小时。
(2).将步骤(1)培养20～40后，优选35天后产生的愈伤组织转接到含0.05～2.0μM TDZ的MS培养基上继代培养，每隔3～5代，用低温处理愈伤组织，在0～4℃下处理1～4周。然后转接到含0.05～2.0μM TDZ的MS培养基上继续培养，培养温度25±2℃，光照强度为500～5000Lux、光周期10～16小时。
(3).将步骤(2)培养20～30天，优选25天的愈伤组织转接到MS无激素培养基上继续培养，培养温度25±2℃，光照强度为500～5000Lux、光周期10～16小时。培养35天后产生大量的不定芽。更换新的培养基。
(4).当不定芽伸长至3～5cm时，转移到加有1.65g/L的NH4NO3、1.9g/L的KNO3、0.17g/L的KH2PO4、0.37g/L的MgSO4.7H2O和0.44g/L的CaCl2·2H2O的MS并附加0.2～2mg/L IAA(indole acetic acid)的培养基上诱导生根，或者附加0.5～2mg/L NAA(naphthalene acetic acid)的培养基上诱导生根，或者附加0.2～2mg/L IBA(ndole-3-butyric acid)的培养基上诱导生根，两周后，生根的频率为95％。
所述的天山雪莲种子是天山雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.exMaxim)种苗或野生植物的根、茎、叶。
所述的步骤(1)中愈伤组织诱导时TDZ的使用浓度以0.5μM为佳；步骤(2)中愈伤组织继代时TDZ的使用浓度以0.1μM为佳，低温处理时间以2周为佳；步骤(4)中诱导根产生时以加有1.65g/L的NH4NO3、1.9g/L的KNO3、0.17g/L的KH2PO4、0.37g/L的MgSO4.7H2O和0.44g/L的CaCl2.2H2O的MS并附加0.5mg/L IAA的培养基为佳。
本发明工艺的建立将能够常年持续提供天山雪莲种苗，与常规的试管苗获得途径相比具有节省原材料、可持续性生产和繁殖效率高等特点，容易实现规模化生产，是解决天山雪莲野生资源匮乏的重要途径。
本发明通过使用新型植物生长调节剂TDZ获得具有强分化能力的天山雪莲脱分化组织，这种组织可在TDZ培养基上多次继代，当移入无激素培养基上，经过35天的培养，可产生大量的芽。经过低温处理可强化这种组织的分化能力。将产生的芽移到生根培养基上诱导生根，两周以后，生根率可达95％。
本发明利用新型生长调节剂对天山雪莲的形态发生进行调控，结合低温处理，建立了天山雪莲种苗可持续化生产的新型工艺。本发明的方法与传统的利用外植体一次性诱导再生的方法相比较，具有材料利用率高、生产效率高的优点，节省了人力、物力，很容易实现规模化生产。不仅对天山雪莲的快速繁殖提供了有效的途径，而且为其它高山植物的人工快繁提供了可借鉴的模式。
附图说明
图1.本发明天山雪莲植株再生工艺流程示意图。
具体实施方式
实施例1
1、取天山雪莲种子，用10％次氯酸钠溶液表面灭菌20分钟，用无菌水冲洗3～5次，然后接到无激素的MS固体培养基上。待种苗生长30天后，取其叶片，切割成0.5cm2的小片，接到含0.5μM TDZ的MS培养基上诱导脱分化，培养温度25℃，光照强度为4000Lux、光周期16小时。
2、培养35天后，将产生的愈伤组织转接到含0.1μM TDZ的培养基上继代培养，每隔3代，在4℃下处理2周。然后转接到含0.5μM TDZ的MS培养基上继续培养，培养温度25±2℃，光照强度为4000Lux、光周期16小时。
3、将培养25天的愈伤组织转接到MS无激素培养基上继续培养，培养温度25±2℃，光照强度为4000Lux、光周期16小时。培养35天后产生大量的不定芽，平均每个愈伤组织块上产生12个。更换新的培养基进行培养。
4、当不定芽伸长至3cm时，转移到加有1.65g/L的NH4NO3、1.9g/L的KNO3、0.17g/L的KH2PO4、0.37g/L的MgSO4.7H2O和0.44g/L的CaCl2.2H2O的MS并附加0.5mg/L IAA的培养基上诱导生根，10天后，能够观察到根的产生，根的诱导频率为95％，4周后，每株平均有9条根，平均根长为2cm。
5、将获得的小苗用无菌水清洗干净表面的固体培养基或培养液，然后转接到灭过菌的人工基质上驯化，成活率大于85％。
实施例2
1、取天山雪莲种子，用10％次氯酸钠溶液表面灭菌20分钟，用无菌水冲洗多余的灭菌液，然后接到无激素的MS固体培养基上。待种苗生长30天后，取其叶片，切割成0.5cm2的小片，接到含1μMTDZ的培养基上培养，培养温度25℃，光照强度为3500Lux、光周期16小时。
2、培养35天后，将产生的愈伤组织转接到含0.25μM TDZ的MS培养基上继代培养，每隔3代，在4℃下处理1周。然后转接到含1μM TDZ的培养基上培养，培养温度25±2℃，光照强度为4000Lux、光周期16小时。
3、将培养25天的愈伤组织转接到MS无激素培养基上继续培养，培养温度25±2℃，光照强度为4000Lux、光周期16小时。培养35天后平均每个愈伤组织块上产生8个不定芽。更换新的培养基进行培养。
4、当不定芽伸长至3cm时，转移到加有1.65g/L的NH4NO3、1.9g/L的KNO3、0.17g/L的KH2PO4、0.37g/L的MgSO4.7H2O和0.44g/L的CaCl2.2H2O的MS并附加0.5mg/L IBA的培养基上诱导生根，10天后，能够观察到根的产生，根的诱导频率为90％，3周后，每株平均有8个根，平均根长为1.5cm。
5、将获得的小苗用无菌水清洗干净表面的固体培养基或培养液，然后转接到灭过菌的人工基质上驯化，成活率大于85％。
实施例3
1、取天山雪莲种子，用0.1％氯化汞溶液表面灭菌12分钟，用无菌水冲洗3～5次，然后接到无激素的MS固体培养基上。待种苗生长30天后，取其叶片，切割成0.5cm2的小片，接到含0.5μM TDZ的MS培养基上诱导脱分化，培养温度25℃，光照强度为4000Lux、光周期16小时。
2、培养35天后，将产生的愈伤组织转接到含1μMTDZ的培养基上继代培养，每隔3代，在4℃下处理5周。然后转接到含0.5μM TDZ的MS培养基上继续培养，培养温度25±2℃，光照强度为4000Lux、光周期16小时。
3、将培养25天的愈伤组织转接到MS无激素培养基上继续培养，培养温度25±2℃，光照强度为4000Lux、光周期16小时。培养35天后产生大量的不定芽，平均每个愈伤组织块上产生6个。更换新的培养基进行培养。
4、当不定芽伸长至3cm时，转移到加有1.65g/L的NH4NO3、1.9g/L的KNO3、0.17g/L的KH2PO4、0.37g/L的MgSO4.7H2O和0.44g/L的CaCl2.2H2O的MS并附加0.5mg/L NAA的培养基上诱导生根，10天后，能够观察到根的产生，根的诱导频率为75％，4周后，每株平均有5条根，平均根长为1.2cm。
5、将获得的小苗用无菌水清洗干净表面的固体培养基或培养液，然后转接到灭过菌的人工基质上驯化，成活率大于78％。

Claims (8)

1.一种N-苯基-N′-1，2；3-噻二唑-5-脲在天山雪莲快速繁殖中的应用方法，其特征是，该方法包括以下步骤：
(1).取天山雪莲种子，用次氯酸钠溶液或氯化汞溶液进行表面灭菌，然后接到无激素的MS固体培养基上；待幼苗生长15～42天后，取其根、茎、叶接种到含0.5～1μM N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲的MS培养基上诱导脱分化，培养温度25±2℃，光照强度为500～5000Lux，光周期10～16小时；
(2).将步骤(1)培养20～40天后产生的愈伤组织转接到含0.1～1μM N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲的MS培养基上继代培养，每隔3～5代，用低温处理愈伤组织，在0～4℃下处理1～4周；然后转接到含0.5～1μM N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲的MS培养基上继续培养，培养温度25±2℃，光照强度为500～5000Lux，光周期10～16小时；
(3).将步骤(2)培养20～30天的愈伤组织转接到MS无激素培养基上继续培养，培养温度25℃，光照强度为500～5000Lux，光周期10～16小时；培养35天后产生大量的不定芽；
(4).当不定芽伸长至3～5cm时，转移到加有1.65g/L的NH4NO3、1.9g/L的KNO3、0.17g/L的KH2PO4、0.37g/L的MgSO4·7H2O和0.44g/L的CaCl2·2H2O的MS并附加0.5mg/L IAA的培养基上诱导生根，或者附加0.5mg/L NAA的培养基上诱导生根，或者附加0.5mg/L IBA的培养基上诱导生根。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的天山雪莲种子是由天山雪莲生长成的种苗。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的步骤(1)中愈伤组织诱导时N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲的使用浓度是0.5μM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的步骤(2)中愈伤组织继代时N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲的使用浓度是0.1μM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的低温处理时间是2周。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的步骤(4)中诱导根产生时是转移到加有1.65g/L的NH4NO3、1.9g/L的KNO3、0.17g/L的KH2PO4、0.37g/L的MgSO4·7H2O和0.44g/L的CaCl2·2H2O的MS并附加0.5mg/L IAA的培养基上诱导生根。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的步骤(2)将步骤(1)培养产生的愈伤组织转接到含0.1～1μM N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲的MS培养基上继代培养，是指培养35天后产生的愈伤组织。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的步骤(3)将步骤(2)培养的愈伤组织转接到MS无激素培养基上继续培养，是指培养25天后产生的愈伤组织。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103518622B (zh) * 2013-10-21 2016-01-20 西北大学 一种低大气压力延长新疆雪莲试管苗在低海拔生存时间的方法
CN107384850B (zh) * 2017-07-06 2020-05-12 西北大学 一种提高新疆雪莲愈伤组织多酚生物合成的方法
CN109329055A (zh) * 2018-10-18 2019-02-15 广东海洋大学 一种提高白鹤芋不定芽增殖率又降低白化比例的培养基
CN114176004A (zh) * 2020-08-24 2022-03-15 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种天山雪莲的再生培养方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1600083A (zh) * 2004-10-27 2005-03-30 中国科学院新疆理化技术研究所 一种雪莲组织培养中快速诱导丛生芽的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1600083A (zh) * 2004-10-27 2005-03-30 中国科学院新疆理化技术研究所 一种雪莲组织培养中快速诱导丛生芽的方法

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨林, 邹建华, 刘庆华, 周宜君, 戴均贵.新疆雪莲的组织培养及植株再生.植物生理学通讯41 4.2005,41(4),553.
杨林, 邹建华, 刘庆华, 周宜君, 戴均贵.新疆雪莲的组织培养及植株再生.植物生理学通讯41 4.2005,41(4),553. *
秦静远.TDZ在植物组织培养中的应用.杨凌职业技术学院学报4 2.2005,4(2),19-22.
秦静远.TDZ在植物组织培养中的应用.杨凌职业技术学院学报4 2.2005,4(2),19-22. *
袁晓凡, 赵兵, 王玉春.雪莲的研究进展.中草药35 12.2004,35(12),1424-1426.
袁晓凡, 赵兵, 王玉春.雪莲的研究进展.中草药35 12.2004,35(12),1424-1426. *
贾景明，吴春福，吴立军，胡高升.天山雪莲愈伤组织培养与次生代谢物形成的研究.中药研究与信息7 7.2005,7(7),11-15.
贾景明,吴春福,吴立军,胡高升.天山雪莲愈伤组织培养与次生代谢物形成的研究.中药研究与信息7 7.2005,7(7),11-15. *

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