CN1600083A - 一种雪莲组织培养中快速诱导丛生芽的方法 - Google Patents

一种雪莲组织培养中快速诱导丛生芽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种雪莲组织培养中快速诱导丛生的方法，该方法包括在MS或BS培养基上进行子叶培养，诱导形成愈伤组织；在MS或BS培养基上进行愈伤组织的转代培养诱导形成丛生芽。以新疆雪莲成熟种子为材料，由于雪莲种子有外壳及内膜的保护，有利于较为严格的灭菌消毒条件，同时愈伤诱导过程中污染率较低，避免了由于消毒损伤所造成的外植体褐变现象。采用雪莲成熟种子直接诱导出芽，速度快，一般经一个月的培养即可完成从外植体移植至丛生芽的诱导过程，丛生芽得率相对较高，成熟种子诱导愈伤发生得率在95％以上，愈伤诱导丛生芽的率近80％。

Description

一种雪莲组织培养中快速诱导丛生芽的方法
                           技术领域
本发明涉及一种雪莲组织培养中快速诱导丛生芽的方法，具体是以植物组织培养为手段，用雪莲成熟种子内的子叶为外植体，在培养基上进行培养，快速获得雪莲丛生芽的方法。
                           背景技术
雪莲(Saussurea involucrate Kar.et Kit)为菊科风毛菊属植物。国内仅大面积分布以新疆，是我国中药、民族药中的珍稀名贵药材。
在自然条件下，新疆雪莲一般生长在天山海拔2000米以上的高山冰碛石、流石、滩石隙、高山草甸上，生态环境极为严酷。由于近些年来的极度采挖，天山一带的野生雪莲频临灭绝。在《中国珍稀频危保护植物名录》中被列为国家3级渐危物种而受到保护。
由于雪连种子成熟时，高山地区已是大雪季节，不易采集到成熟的种子，造成了引种栽培上的困难。因此，通过植物组织培养，获得雪莲再生苗的方法就成为引种和保护雪莲的首选方法之一。
现有技术表明，对雪莲的组织培养均以雪莲的鲜嫩叶片为外植体，诱导愈伤组织，分化出芽，并诱导生根。或以雪莲无菌苗为外植体诱导出愈伤组织，丛生芽试管苗。这两种方法中，采自野外的嫩叶灭菌消毒相对困难，对外植体的损伤大，易污染，诱导愈伤的成功率较低。以无菌苗为外植体是目前雪莲组织培养中较为通用的方法，但要先培育无菌苗，再对无菌苗的叶片进行诱导培养，生产周期相对较长。水母雪莲为新疆雪莲的同属植物，国内有文献报道对水母雪莲的组织培养作了深入的工作，取得了许多很好的成果。但水母雪莲为雪兔子亚属植物，未见以水母雪莲成熟种子为外植体进行组织培养的报道。中国专利CN01124108X公开了细胞培养生成新疆雪莲总黄酮的方法，该方法是采用气升式生物反应器培养新疆雪莲细胞提取总黄酮的。
                           发明内容
本发明目的在于，提供一种雪莲组织培养中快速诱导丛生芽的方法，该方法包括在MS或BS培养基上进行子叶培养，诱导形成愈伤组织；在MS或BS培养基上进行愈伤组织的转代培养诱导形成丛生芽。以新疆雪莲成熟种子为材料，由于雪莲种子有外壳及内膜的保护，有利于较为严格的灭菌消毒条件，愈伤诱导过程中污染率较低，避免了由于消毒损伤所造成的外植体褐变现象。采用雪莲成熟种子直接诱导出芽，速度快，一般经一个月的培养即可完成从外植体移植至丛生芽的诱导过程，丛生芽得率相对较高，成熟种子诱导愈伤发生得率在95％以上，愈伤诱导丛生芽的率近80％。
本发明所述的一种雪莲组织培养中快速诱导丛生芽的方法，该方法包括在MS或BS培养基上进行子叶培养，诱导形成愈伤组织；在MS或BS培养基上进行愈伤组织的转代培养诱导形成丛生芽；具体操作按下列步骤进行：
a、选取成熟的雪莲种子，剥去种子外壳，撕去种子内膜，取出种仁，切除种芽，将子叶平铺于愈伤诱导培养基上诱导愈伤发生，时间13-17天；
b、将诱导形成的愈伤转至丛生芽诱导培养基上诱导丛生芽发生，转代周期为5-18天，培养温度为20-28℃，光照强度为2200-2700/ux，光照时间为12-15小时/天；
c、愈伤诱导培养基和丛生芽诱导培养基的pH值为5.5-6。
愈伤诱导培养基为MS或BS培养基，同时附加6-BA0.0-4.0mg/L；NAA0.0-2.0mg/L；2.4-D0.0-1.0mg/L。
丛生芽诱导培养基为MS或BS培养基，同时附加6-BA0.0-4.0mg/L；NAA0.0-2.0mg/L。
雪莲种子的灭菌消毒条件为：75％乙醇浸泡25-35秒，用灭菌水冲洗数次，用2‰的优氯净溶液浸泡25-35分钟，灭菌水冲洗数次，再浸泡于灭菌水中2-4小时。
                    具体实施方式
实施例1
a、选取采自哈密的新疆雪莲成熟的种子10粒，在超净工作台上用75％乙醇浸泡35秒，无菌水冲洗数次，再用2‰的优氯净溶液浸泡25分钟，无菌水冲洗数次，再浸泡于无菌水中2小时；剥去种子外壳，撕去种子内膜，取出种仁，切除种芽，将子叶平铺于愈伤诱导培养基上诱导愈伤发生，时间15天，愈伤诱导培养基为BS培养基，同时附加含有0.0-4.0mg/L的6-氨基腺嘌呤(6-BA)，0.0-2.0mg/L萘乙酸(NAA)，0.0-1.0mg/L的2.4-D，3％的蔗糖，0.55％的琼脂，pH值为5.5，子叶接种5-7天后开始膨大，10-15天形成愈伤组织；
b、15天后将诱导形成的愈伤组织转入丛生芽诱导培养基上诱导丛生芽发生，丛生芽诱导培养基为BS培养基，同时附加含有0.0-2.0mg/L的6-BA，0.0-1.0mg/L的NAA，3％的蔗糖，0.55％的琼脂，pH值为5.5，转代周期培养5-7天后愈伤开始出现芽点突起，10-15天出现大量丛生芽，培养温度为20℃，光照强度为2200/ux，光照时间为12小时/天，出芽愈伤是总愈伤的80％，从接种外植体之大量出现丛生芽需1个月时间。
实施例2
a、选取采自和静县的新疆雪莲成熟的种子300粒，分成3份，每份100粒，在超净工作台上用75％乙醇浸泡25秒，无菌水冲洗数次，再用2‰的优氯净溶液浸泡35分钟，无菌水冲洗数次，再浸泡于无菌水中3小时；剥取种子外壳，撕去种子内膜，取出种仁，切除种芽，将子叶平铺于愈伤诱导培养基上诱导愈伤发生，时间13天，愈伤诱导培养基为MS培养基，同时附加含有0.0-4.0mg/L的6-氨基腺嘌呤(6-BA)，0.0-2.0mg/L萘乙酸(NAA)，0.0-1.0mg/L的2.4-D，3％的蔗糖，0.55％的琼脂，pH值为5.8，子叶接种5-7天后开始膨大，10-15天形成愈伤组织；
b、15天后将诱导形成的愈伤转至丛生芽诱导培养基上诱导丛生芽发生，丛生芽诱导培养基为MS培养基，同时附加含有0.0-2.0mg/L的6-BA，0.0-1.0mg/L的NAA，3％的蔗糖，0.55％的琼脂，pH值为5.5，转代周期培养5-7天后愈伤开始出现芽点突起，10-17天出现大量丛生芽，其中个别愈伤形成船形，船内出现大量球状体，椭圆形体，长柱状体及带有双芽尖的子叶胚，培养温度为25℃，光照强度为2500/ux，光照时间为14小时/天，经3份种子统计，子叶诱导愈伤发生的出愈率均超过95％，只有个别未成熟的种子所剥取的子叶未能诱导愈伤发生，此类未成熟种子的子叶为一层薄皮，即使将诱导时间延长至1个月，也不能诱导发生。只有那些从接近成熟的种子剥取的子叶，在延迟后的诱导培养中形成愈伤组织，诱导时间较成熟种子多了一至两倍。
实施例3
a、选取采自和静县的新疆雪莲成熟的种子50粒，在超净工作台上用75％乙醇浸泡30秒，无菌水冲洗数次，再用2‰的优氯净溶液浸泡30分钟，无菌水冲洗数次，再浸泡于无菌水中4小时；剥取种子外壳，撕去种子内膜，取出种仁，切除种芽，将子叶平铺于愈伤诱导培养基上诱导愈伤发生，时间15天，愈伤诱导培养基为MS培养基，同时附加含有0.0-4.0mg/L的6-氨基腺嘌呤(6-BA)，0.0-2.0mg/L萘乙酸(NAA)，0.0-1.0mg/L的2.4-D，3％的蔗糖，0.55％的琼脂，pH值为6，子叶接种5-7天后开始膨大，10-15天形成愈伤组织；
b、15天后将诱导形成的愈伤转至丛生芽诱导培养基上诱导丛生芽发生，丛生芽诱导培养基为MS培养基，同时附加含有0.0-2.0mg/L的6-BA，0.0-1.0mg/L的NAA，3％的蔗糖，0.55％的琼脂，pH值为5.5，转代培养5-7天后愈伤开始出现芽点突起，10-18天出现大量丛生芽，培养温度为28℃，光照强度为2700/ux，光照时间为15小时/天，子叶诱导愈伤发生的出愈率为95％。

Claims (4)

1、一种雪莲组织培养中快速诱导丛生芽的方法，其特征在于该方法包括在MS或BS培养基上进行子叶培养，诱导形成愈伤组织；在MS或BS培养基上进行愈伤组织的转代培养诱导形成丛生芽；具体操作按下列步骤进行：
a、选取成熟的雪莲种子，剥去种子外壳，撕去种子内膜，取出种仁，切除种芽，将子叶平铺于愈伤诱导培养基上诱导愈伤发生，时间13-17天；
b、将诱导形成的愈伤转至丛生芽诱导培养基上诱导丛生芽发生，转代周期为5-18天，培养温度为20-28℃，光照强度为2200-2700/ux，光照时间为12-15小时/天；
c、愈伤诱导培养基和丛生芽诱导培养基的pH值为5.5-6。
2、根据权利要求1所述的一种雪莲组织培养中快速诱导丛生芽的方法，其特征在于愈伤诱导培养基为MS或BS培养基，同时附加6-BA0.0-4.0mg/L；NAA0.0-2.0mg/L；2.4-D0.0-1.0mg/L。
3、根据权利要求1所述的一种雪莲组织培养中快速诱导丛生芽的方法，其特征在于丛生芽诱导培养基为MS或BS培养基，同时附加6-BA0.0-4.0mg/L；NAA0.0-2.0mg/L。
4、根据权利要求1所述的一种雪莲组织培养中快速诱导丛生芽的方法，其特征在于雪莲种子的灭菌消毒条件为：75％乙醇浸泡25-35秒，用灭菌水冲洗数次，用2‰的优氯净溶液浸泡25-35分钟，灭菌水冲洗数次，再浸泡于灭菌水中2-4小时。
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