CN100459850C - 雪莲愈伤组织诱导及组培苗快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生化工程领域，涉及一种雪莲愈伤组织诱导及组培苗快繁方法。本发明是利用大规模组织培养技术诱导雪莲愈伤组织及快速繁殖雪莲苗，主要步骤包括：无菌外植体材料的准备、以不同部位的外植体诱导愈伤组织、采用固体培养、悬浮培养或生物反应器大规模培养扩繁胚性愈伤和体胚、萌发出芽或植株、丛生芽继代快速繁殖、单芽生长及生根。芽生根率可以达到85%以上。通过大规模组培快繁雪莲苗并进行人工种植，可以克服种子育苗多代种植易退化，易产生病虫害，生长及开花同步性较差等缺点，有利于雪莲种质资源优化、提高雪莲资源储量，保护生态环境，推动雪莲产业链的健康发展。
Description
技术领域
本发明属于生化工程领域，涉及一种雪莲愈伤组织诱导及组培苗快繁方法。
背景技术
雪莲属菊科风毛菊属(Saussurea DC.)植物，有数个品种，可同等入药，品质也有优劣之分。主要用于散寒除湿，活血通经，抗炎镇痛等。民间用于治疗风湿性关节炎，妇科病等。药理实验证明，雪莲花具有抗癌，扩张血管，降血压，抗疲劳等作用。特别是雪莲中含有的黄酮(jaceosidin)对治疗腹水型肿瘤具有显著疗效，其制剂在国内外深受欢迎。由于远远不能满足市场需求，对野生雪莲的滥采滥挖不但使天然资源濒临灭绝，同时亦对生态环境造成了严重破坏。通过种子虽已实现小规模人工种植，但存在野生种子稀缺，难于采集，人工种植的种子多代连续种植后易发生种质退化等问题。由于雪莲生长环境特异，种源稀缺，人工栽培困难，生长周期长，多代种植后种质易退化，因此，利用植物组培、快繁技术进行雪莲种苗生产并进行人工种植是解决目前雪莲资源短缺的有效途径。
中国的瓦·古巴诺娃1990年曾报导利用雪莲的茎、叶片、花托和小头状花序为外植体利用MS添加2毫克每升的萘乙酸和0.2毫克每升的N6-苄基腺嘌呤的培养基诱导愈伤，其中小头状花序的诱导率为85％，其他外植体的诱导率仅为20％，而且愈伤生长缓慢，容易变褐老化。以小头状花序为外植体的愈伤诱导成芽，同时在生根时利用低温处理十几天才能生根。因为雪莲仅在每年的6～8月份开花，采取外植体的时间受到了限制，而且由于在生根时利用低温处理十几天才能生根，因此此方法的繁殖周期相对较长。中国科学院植物研究所曾在1997年报导利用雪莲的茎和叶诱导出愈伤茎的诱导率为100％，叶的诱导率为50％左右，但是对于所诱导的愈伤是不是胚性愈伤，是不是有发芽潜力没有后续报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种雪莲愈伤组织诱导及组培苗快繁方法，利用本发明的方法对雪莲进行室内大规模快繁，以解决雪莲在天然状态下繁殖困难的问题，解决雪莲资源日益匮乏，以致物种濒临灭绝等问题，最终实现野生雪莲的大规模人工种植；并通过生物反应器培养等大规模组织培养技术快速繁殖雪莲，扩大雪莲种植面积，提高雪莲的储量。
本发明的雪莲愈伤组织诱导及组培苗快繁方法包括以下步骤：
(1).从野外直接采集野生的雪莲叶、根等新鲜外植体用于诱导愈伤；或在MS(参见薛庆善，肖渝平，林娟。体外培养的原理与技术北京科学出版社，2001)基本培养基上用雪莲种子萌发、培养无菌苗，然后以其叶、根或胚轴为外植体诱导愈伤。雪莲萌发无菌苗的方法是挑选饱满的雪莲种子，用质量浓度为70％的乙醇和质量浓度为2％的次氯酸钠消毒，接种到MS基本培养基上，在温度为15～35摄氏度，光照1000～5000勒克司下培养10～30天，即可长出雪莲无菌苗。
(2).分别以步骤(1)的雪莲苗的叶、根或胚轴为外植体(野生雪莲苗的叶、根需经过质量浓度为70％的乙醇或质量浓度为2％的次氯酸钠消毒)，无菌外植体分别直接接入MS添加N6-苄基腺嘌呤、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸和蔗糖的培养基中，其中MS培养基中的N6-苄基腺嘌呤浓度为0.01～3.0毫克每升，萘乙酸的浓度为0.01～5.0毫克每升，2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为0～2.5毫克每升，蔗糖的浓度为5～80克每升，培养基的pH值5.7～6.0，加入培养基量的1～9克每升琼脂，在温度115～125℃下灭菌15～20分钟，冷却培养基，在温度15～35摄氏度，光照1000～5000勒克司下培养，诱导出雪莲苗的叶、根或胚轴外植体的愈伤组织，各种愈伤诱导率达85％以上。
(3).采用固体培养、悬浮培养或生物反应器大规模培养扩繁步骤(2)雪莲苗的叶、根或胚轴外植体的愈伤组织的胚性愈伤或体胚，将扩繁后的胚性愈伤或体胚接入MS添加N6-苄基腺嘌呤、萘乙酸和1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的培养基上，其中，MS培养基中N6-苄基腺嘌呤的浓度为0.01～2.5毫克每升，萘乙酸的浓度为0.05～2.0毫克每升，1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的浓度为0～5毫克每升；在温度为15～35摄氏度，光照1000～5000勒克司下培养10～30天，即可萌发出芽或植株；将萌发出的丛生芽大于1厘米小于3厘米的单芽切出，在MS添加N6-苄基腺嘌呤、萘乙酸和1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的培养基中进行扩繁，其中MS培养基中N6-苄基腺嘌呤的浓度为0.01～2.5毫克每升，萘乙酸的浓度为0.01～5.0毫克每升，1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的浓度为0～5毫克每升，待单芽生长到≥4厘米时转入生根培养基中生根；或将萌发出≥4厘米的单芽转入生根培养基中生根；或将萌发的植株转入MS基本培养基上生长。
(4)将步骤(3)的单芽转入生根培养基中生根，是采用容器(如瓶)内无菌生根或者开放式生根；在容器内生根时，将单芽转入MS添加吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸和活性炭的培养器中，其中，MS培养基中吲哚乙酸的浓度为0.01～2.0毫克每升，吲哚丁酸的浓度为0.01～2.0毫克每升，萘乙酸的浓度为0.01～2.0毫克每升，活性炭的质量浓度为0～2.0％；或者将单芽转入装有灭菌后的蛭石的开放式容器中，所述的蛭石用1/2浓度的MS添加有浓度为0.01～2.0毫克每升的吲哚乙酸，浓度为0.01～2.0毫克每升的吲哚丁酸，浓度为0.01～2.0毫克每升的萘乙酸的培养液浸透，在温度为15～35摄氏度，光照1000～5000勒克司下培养，10～30天后生根率可以达到85％以上；将萌发的植株转入MS基本培养基上生长；
(5).将步骤(4)容器内生根的雪莲组培苗或容器外生根的雪莲组培苗，或步骤(3)中转入MS基本培养基生长的植株；转入到壤土+蛭石中进行炼苗，其中，壤土与蛭石的体积比是10:1～1:10。
所述的步骤(2)是用无机酸或无机碱调整pH。如盐酸、硫酸等；氢氧化钠、氢氧化钾等。
本发明是利用大规模组织培养技术快速繁殖雪莲苗，主要步骤包括：无菌外植体材料的准备、以不同部位的外植体诱导愈伤组织、采用固体培养、悬浮培养或生物反应器大规模培养扩繁胚性愈伤和体胚、萌发出芽或植株、单芽生长及生根、丛生芽继代快速繁殖、炼苗、移栽。芽生根率可以达到85％以上，苗移栽野外成活率可达80％以上。通过大规模组培快繁雪莲苗并进行人工种植，可以克服种子育苗多代种植易退化，易产生病虫害，生长及开花同步性较差等缺点，有利于雪莲种质资源优化、提高雪莲资源储量，保护生态环境，推动雪莲产业链的健康发展。
具体实施方式
实施例1：
(1).用雪莲种子萌发、培养无菌苗，然后以其叶为外植体诱导愈伤。雪莲萌发无菌苗方法为：挑选饱满的雪莲种子用质量浓度为70％的乙醇和质量浓度为2％的次氯酸钠消毒，接种到MS基本培养基上，在温度为18摄氏度，光照2000勒克司下培养25天，即可长出雪莲无菌苗。
(2).以步骤(1)的雪莲苗的叶为外植体直接接入MS添加N6-苄基腺嘌呤、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸和蔗糖的培养基中，其中MS培养基中的N6-苄基腺嘌呤浓度为0.5毫克每升，萘乙酸的浓度为2.0毫克每升，2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为1.0毫克每升，蔗糖的浓度为30克每升，利用盐酸和氢氧化钠溶液调整培养基的pH值5.85，加入培养基量的5.5克每升琼脂，在温度121摄氏度下灭菌20分钟，冷却培养基，在温度25摄氏度，光照2000勒克司下培养，诱导出雪莲苗的叶外植体的愈伤组织，愈伤诱导率达88％。
(3).采用悬浮培养培养扩繁步骤(2)雪莲苗的叶外植体的愈伤组织的胚性愈伤，将扩繁后的胚性愈伤接入MS添加N6-苄基腺嘌呤、萘乙酸和1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的培养基上，其中，MS培养基中N6-苄基腺嘌呤的浓度为0.2毫克每升，萘乙酸的浓度为0.05毫克每升，1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的浓度为3毫克每升；在温度为25摄氏度，光照2000勒克司下培养25天，即可萌发出芽；将萌发出≥4厘米的单芽直接转入生根培养基中生根；将萌发出的丛生芽大于1厘米小于3厘米的单芽切出，在MS添加N6-苄基腺嘌呤、萘乙酸和1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的培养基中进行扩繁，其中MS培养基中N6-苄基腺嘌呤的浓度为0.2毫克每升，萘乙酸的浓度为0.05毫克每升，1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的浓度为3毫克每升，待单芽生长到≥4厘米时转入生根培养基中生根。
(4)将步骤(3)的单芽转入生根培养基中生根，是采用容器内无菌生根；在容器内生根时，将单芽转入MS添加吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸和活性炭的培养器中，其中，MS培养基中吲哚乙酸的浓度为0.5毫克每升，吲哚丁酸的浓度为0.2毫克每升，萘乙酸的浓度为0.2毫克每升，活性炭的质量浓度为1％，在温度为25摄氏度，光照2000勒克司下，20天后生根率可以达到95％。
(5).将步骤(4)容器内生根的雪莲组培苗，转入到壤土+蛭石中进行炼苗，其中壤土与蛭石的体积比是1:5。
实施例2：
(1).用雪莲种子萌发、培养无菌苗，然后以其根为外植体诱导愈伤。雪莲萌发无菌苗方法为：挑选饱满的雪莲种子用质量浓度为70％的乙醇和质量浓度为2％的次氯酸钠消毒，接种到MS基本培养基上，在温度为25摄氏度，光照2000勒克司下培养25天，即可长出雪莲无菌苗。
(2).以步骤(1)的雪莲苗的根为外植体直接接入MS添加N6-苄基腺嘌呤、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸和蔗糖的培养基中，其中MS培养基中的N6-苄基腺嘌呤浓度为0.5毫克每升，萘乙酸的浓度为2.0毫克每升，2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为1.0毫克每升，蔗糖的浓度为30克每升，利用盐酸和氢氧化钠溶液调整培养基的pH值5.85，加入培养基量的5.5克每升琼脂，在温度125摄氏度下灭菌15分钟，冷却培养基，在温度25摄氏度，光照2000勒克司下培养，诱导出雪莲苗的根外植体的愈伤组织，愈伤诱导率达98％。
(3).采用生物反应器培养扩繁步骤(2)雪莲苗的根外植体的愈伤组织的胚性愈伤，将扩繁后的胚性愈伤接入MS添加N6-苄基腺嘌呤、萘乙酸和1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的培养基上，其中，MS培养基中N6-苄基腺嘌呤的浓度为0.5毫克每升，萘乙酸的浓度为0.05毫克每升，1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的浓度为1毫克每升；在温度为25摄氏度，光照2000勒克司下培养25天，即可萌发出芽；将萌发出3～5厘米的单芽直接转入生根培养基中生根；将萌发出的丛生芽大于1厘米小于3厘米的单芽切出，在MS添加N6-苄基腺嘌呤、萘乙酸和1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的培养基中进行扩繁，其中MS培养基中N6-苄基腺嘌呤的浓度为0.5毫克每升，萘乙酸的浓度为0.05毫克每升，1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的浓度为1毫克每升，待单芽生长到≥4厘米时转入生根培养基中生根。
(4)将步骤(3)的单芽转入生根培养基中生根，是采用容器内无菌生根；在容器内生根时，将单芽转入MS添加吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸和活性炭的培养器中，其中，MS培养基中吲哚乙酸的浓度为0.2毫克每升，吲哚丁酸的浓度为0.2毫克每升，萘乙酸的浓度为0.2毫克每升，活性炭的质量浓度为1.5％，在温度为25摄氏度，光照2000勒克司下，15天后生根率可以达到96％。
(5).将步骤(4)容器内生根的雪莲组培苗，转入到壤土+蛭石中进行炼苗，其中壤土与蛭石的体积比是1:5。
实施例3：
(1).采用雪莲野生苗叶片作为外植体，用质量浓度为70％的乙醇和质量浓度为2％的次氯酸钠消毒。
(2).以步骤(1)的雪莲苗的叶为外植体直接接入MS添加N6-苄基腺嘌呤、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸和蔗糖的培养基中，其中MS培养基中的N6-苄基腺嘌呤浓度为0.02毫克每升，萘乙酸的浓度为4.0毫克每升，2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为2.0毫克每升，蔗糖的浓度为20克每升，利用盐酸和氢氧化钠溶液调整培养基的pH值5.85，加入培养基量的5.5克每升琼脂，在温度115摄氏度下灭菌25分钟，冷却培养基，在温度25摄氏度，光照2000勒克司下培养，诱导出雪莲苗的叶外植体的愈伤组织，愈伤诱导率达88％。
(3).采用悬浮培养培养扩繁步骤(2)雪莲苗的叶外植体的愈伤组织的胚性愈伤，将扩繁后的胚性愈伤接入MS添加N6-苄基腺嘌呤、萘乙酸和1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的培养基上，其中，MS培养基中N6-苄基腺嘌呤的浓度为2毫克每升，萘乙酸的浓度为1.5毫克每升，1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的浓度为4毫克每升；在温度为25摄氏度，光照2000勒克司下培养25天，即可萌发出芽；将萌发出3～5厘米的单芽直接转入生根培养基中生根；将萌发出的丛生芽大于1厘米小于3厘米的单芽切出，在MS添加N6-苄基腺嘌呤、萘乙酸和1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的培养基中进行扩繁，其中MS培养基中N6-苄基腺嘌呤的浓度为0.2毫克每升，萘乙酸的浓度为2毫克每升，1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的浓度为2毫克每升，待单芽生长到≥4厘米时转入生根培养基中生根。
(4)将步骤(3)的单芽转入生根培养基中生根，是采用容器内无菌生根；在容器内生根时，将单芽转入MS添加吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸和活性炭的培养器中，其中，MS培养基中吲哚乙酸的浓度为0.05毫克每升，吲哚丁酸的浓度为0.15毫克每升，萘乙酸的浓度为1.5毫克每升，活性炭的质量浓度为1％，在温度为25摄氏度，光照2000勒克司下，30天后生根率可以达到90％。
(5).将步骤(4)容器内生根的雪莲组培苗，转入到壤土+蛭石中进行炼苗，其中壤土与蛭石的体积比是1:5。
Claims (5)
1.一种雪莲愈伤组织诱导及组培苗快繁方法，其特征是，该方法包括以下步骤：
(1).从野外直接采集野生的雪莲叶、根的新鲜外植体用于诱导愈伤；或在MS基本培养基上用雪莲种子萌发、培养无菌苗，然后以其叶、根或胚轴为外植体诱导愈伤；
(2).分别以步骤(1)的雪莲苗的叶、根或胚轴为外植体，无菌外植体分别直接接入MS添加N6-苄基腺嘌呤、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸和蔗糖的培养基中，其中MS培养基中的N6-苄基腺嘌呤浓度为0.01～3.0毫克每升，萘乙酸的浓度为0.01～5.0毫克每升，2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为0～2.5毫克每升，蔗糖的浓度为5～80克每升，培养基的pH值5.7～6.0，加入培养基量的1～9克每升琼脂，在温度115～125℃下灭菌，冷却培养基，在温度15～35摄氏度，光照1000～5000勒克司下培养，诱导出雪莲苗的叶、根或胚轴外植体的愈伤组织；
(3).采用固体培养、悬浮培养或生物反应器大规模培养扩繁步骤(2)雪莲苗的叶、根或胚轴外植体的愈伤组织的胚性愈伤或体胚，将扩繁后的胚性愈伤或体胚接入MS添加N6-苄基腺嘌呤、萘乙酸和1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的培养基上，其中，MS培养基中N6-苄基腺嘌呤的浓度为0.01～2.5毫克每升，萘乙酸的浓度为0.05～2.0毫克每升，1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的浓度为0～5毫克每升；在温度为15～35摄氏度，光照1000～5000勒克司下培养，萌发出芽或植株；将萌发出的丛生芽大于1厘米小于3厘米的单芽切出，在MS添加N6-苄基腺嘌呤、萘乙酸和1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的培养基中进行扩繁，其中MS培养基中N6-苄基腺嘌呤的浓度为0.01～2.5毫克每升，萘乙酸的浓度为0.01～5.0毫克每升，1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的浓度为0～5毫克每升，待单芽生长到≥4厘米时转入生根培养基中生根；或将萌发出≥4厘米的单芽转入生根培养基中生根；或将萌发的植株转入MS基本培养基上生长；
(4)将步骤(3)的单芽转入生根培养基中生根，是采用容器内无菌生根或者开放式生根；在容器内生根时，将单芽转入MS添加吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸和活性炭培养基的培养器中，其中，MS培养基中吲哚乙酸的浓度为0.01～2.0毫克每升，吲哚丁酸的浓度为0.01～2.0毫克每升，萘乙酸的浓度为0.01～2.0毫克每升，活性炭的质量浓度为0～2.0％；或者将单芽转入装有灭菌后的蛭石的开放式容器中，所述的蛭石用1/2浓度的MS添加有浓度为0.01～2.0毫克每升的吲哚乙酸，浓度为0.01～2.0毫克每升的吲哚丁酸，浓度为0.01～2.0毫克每升的萘乙酸的培养液浸透，在温度为15～35摄氏度，光照1000～5000勒克司下培养；
(5).将步骤(4)容器内生根的雪莲组培苗或容器外生根的雪莲组培苗，或步骤(3)中转入MS基本培养基生长的植株；转入到壤土+蛭石中进行炼苗，其中，壤土与蛭石的体积比是10:1～1:10。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的步骤(1)雪莲萌发无菌苗的方法是挑选饱满的雪莲种子，用质量浓度为70％的乙醇和质量浓度为2％的次氯酸钠消毒，接种到MS基本培养基上，在温度为15～35摄氏度，光照1000～5000勒克司下培养10～30天，长出雪莲无菌苗。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的步骤(1)野生雪莲苗的叶、根需经过质量浓度为70％的乙醇或质量浓度为2％的次氯酸钠消毒。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的步骤(2)是用盐酸或硫酸调整pH；或用氢氧化钠或氢氧化钾调整pH。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的步骤(2)在温度115～125℃下灭菌15～20分钟。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1907013A (zh) | 2007-02-07 |
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