CN111183903A - 一种提高樟叶越桔组培苗中6′-o-咖啡酰熊果苷含量的方法 - Google Patents

一种提高樟叶越桔组培苗中6′-o-咖啡酰熊果苷含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种提高樟叶越桔组培苗中6′‑O‑咖啡酰熊果苷含量的方法，属于植物组织培养技术领域。选择以下培养基对樟叶越桔组培苗进行继代培养，所述培养基以WPM为基本培养基，添加ZT和NAA两种不同植物生长调节剂，其中ZT添加浓度为0.1～5.0mg/L，NAA添加浓度为0.01～2.0mg/L，调节pH值为5.0～6.0。本方法简单易行，可在较短时间内完成对樟叶越桔组培苗生长调控和次生代谢产物CA的生产调控及含量的测定。通过施加ZT和NAA两种不同植物生长调节剂不同浓度配比进行调控，其组培苗叶片和茎段中CA含量分别提高为对照组WPM条件下的4～7倍和2～5倍，是获取大量高含量CA樟叶越桔材料的有效途径。

Description

一种提高樟叶越桔组培苗中6′-O-咖啡酰熊果苷含量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高樟叶越桔组培苗中6′-O-咖啡酰熊果苷含量的方法，属于植物组织培养技术领域。
背景技术
樟叶越桔(Vaccinium dunalianum)为杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)常绿灌木，主要分布于我国云南、四川、贵州、西藏、台湾等地，锡金、不丹、印度、缅甸和越南亦有分布，在云南省境内则主要分布于云南西北部经滇中高原至滇南和滇东南。其花冠为淡绿带紫红色或淡红色，宽钟状，浆果球形，直径4～12mm，成熟时呈紫黑色，被白粉，花期4～5月，果期9～12月，果实营养丰富，具有较高的药用和保健价值。樟叶越桔的幼嫩叶芽因形似雀嘴呈锥状，在云南彝族民间又称“雀嘴茶”，具有祛风除湿、舒筋活络等功效，自明代起就作为一种茶代用品长期饮用至今。
申请人前期研究发现，樟叶越桔是一种富含咖啡酰熊果苷类物质的特色特殊资源植物，并从雀嘴茶中分离鉴定了熊果苷和10余种酰化熊果苷类衍生物，其中主要化学成分CA的得率高达22％，并对其制备方法进行了专利保护(赵平，张颖君，许敏，杨崇仁，2007.6′-O-咖啡酰基熊果甙的制备方法.授权专利号：ZL200710065956.X)。熊果苷是源于绿色植物的天然活性物质，也是目前国际公认的21世纪的理想皮肤美白祛斑活性剂。基于斑马鱼模型的研究发现，CA的黑色素生成抑制活性优于熊果苷，且毒性仅为熊果苷的1/2，表明樟叶越桔可望作为熊果苷的替代资源加以开发利用。目前，樟叶越桔仍处于野生状态，由于其生长缓慢，且分布量有限，加之随着近年来对雀嘴茶的关注度不断提高，导致其连年遭受破坏性采摘，野生樟叶越桔数量急剧减少。因此，开展樟叶越桔的组织培养并利用组织培养系进行次生代谢产物含量的提高显得非常有必要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，基于CA在樟叶越桔植物体中的分布特点及其所具有的药理活性，提供一种提高樟叶越桔组培苗中6′-O-咖啡酰熊果苷含量的方法，该方法具有繁殖速度快、周期短、CA含量高等优点，是获取大量高含量CA樟叶越桔材料的有效途径，具体过程为：选择以下培养基进行继代培养，所述培养基以WPM为基本培养基，添加ZT和NAA两种不同植物生长调节剂，其中ZT添加浓度为0.1～5.0mg/L，NAA添加浓度为0.01～2.0mg/L，调节pH值为5.0～6.0。
优选的，本发明所述培养条件为：培养基于121～125℃，高压灭菌21～25min；培养温度为25±2℃，光照强度为30～50μmol/m2·s，每天光照12±2h，培养周期2±0.5个月。
本发明用于继代培养的苗为：以野生樟叶越桔幼嫩带芽茎段为外植体通过对初代启动培养，继代增殖培养后，选取生长健壮的组培瓶苗进行继代培养。(参考文献罗旭璐,唐军荣,李娜,等.樟叶越桔的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学报,2014,50(11):1717-1720.)
本发明所述培养基中的凝胶剂可以是琼脂或卡拉胶，优选是琼脂，强度为1300mg/cm3，琼脂在培养基中终浓度为5～6g/L；所用的糖为食用白砂糖，所用的水为蒸馏水。
本发明所述培养基的pH值用1mol/L NaOH或HCl来调节。
本发明的有益效果：
(1)本发明所述方法使用改良WPM培养基，通过ZT和NAA两种不同植物生长调节剂调控，可以显著提高樟叶越桔组培苗6′-O-咖啡酰熊果苷含量，结合组培苗生长态势，在最适宜樟叶越桔组培苗的生长和CA生产的培养条件下，其组培苗叶片和茎段中CA含量分别为对照组WPM培养条件下的6.12倍和4.67倍，是获取大量高含量CA樟叶越桔材料的有效途径；且比传统的WPM基本培养基更有利于樟叶越桔无菌苗增殖和生长。
(2)本发明所述方法的培养基的原料价格低廉，来源广泛，植物生长调节剂配比简单便于试验操作，可靠调节不同植物生长调节剂配比来控制组培苗的生长及次生代谢产物的生产调控。
(3)本发明所述方法结合了组织培养的技术，从幼嫩樟叶越桔无菌苗不断诱导扩繁，不经脱分化和再分化，周期短，遗传性状稳定，芽苗健壮，培养过程简单；另一方面，经高效液相色谱检测发现樟叶越桔组培苗中含有高含量CA，对于该资源的保护和可持续利用具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
本发明实施例以樟叶越桔组培苗为试验材料，研究了不同植物生长调节剂对组培苗的生长和CA生产的影响，通过ZT和NAA两种不同植物生长调节剂调控，使樟叶越桔组培苗主要次生代谢物6′-O-咖啡酰熊果苷(CA)的含量得到明显提高。
实施例1
一种提高樟叶越桔组培苗6′-O-咖啡酰熊果苷含量的方法，具体过程如下：
以樟叶越桔组培苗为试验材料，选择以下培养基进行继代培养，所述培养基以WPM为基本培养基，只添加0.2mg/L的NAA，调整pH值为5.0～6.0，配制分装后于121～125℃，高压灭菌21～25min；培养温度为25±2℃，光照强度为30～50μmol/m2·s，每天光照12±2h，培养周期2±0.5个月。
组培苗提取物制备，将各试验组培苗茎、叶置烘箱中50℃烘干，分别粉碎后过60目筛，各称取100mg样品，采用超声辅助甲醇提取法(甲醇体积分数83％、料液比1:20、超声时间25min、提取次数5次)进行提取，提取液合并后转移至10mL容量瓶定容，过微孔滤膜d＝0.45m，供HPLC定量分析用。
CA含量计算，采用HPLC定量分析方法，分别取一定体积(30～50L)的各试验组培苗茎、叶提取液，按照标准曲线测定的方法进行操作，将测定所得的CA峰面积带入回归方程y＝457.18x-77.59(R2＝0.9997)，结合样品溶液中的CA质量(g)，按下式计算各试验组培苗茎、叶中的CA含量：CA含量＝[CA质量(g)/样品质量(g)]×100％。各提取液的CA测定重复三次，得到平均含量，并计算其相对平均偏差。
在色谱柱AgilentAnalytical Eclipse XDB-C18(4.6mm x 150mm，0.5m)，流动相：甲醇/水体系(含1％HAc)，洗脱体系：0～5min 5％甲醇，5～5.1min、5％～15％甲醇，5.1～25.0min、15％～65％甲醇，25.0～25.1min、65％～95％甲醇，25.1～35.0min、95％～5％甲醇，流速：1.0mL/min，进样量30～50L，检测波长280nm，柱温30℃；通过CA标准品的面积外标法进行含量测定，对照品线性方程为y＝457.18x-77.59(R2＝0.9997)；
经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的樟叶越桔组培苗叶片和茎段中CA的含量分别为1.59％和0.83％。
实施例2
一种提高樟叶越桔组培苗6′-O-咖啡酰熊果苷含量的方法，具体过程如下：
以樟叶越桔组培苗为试验材料，选择以下培养基进行继代培养，所述培养基以WPM为基本培养基，添加0.5mg/LZT+0.4mg/L的NAA，调整pH值为5.0～6.0，配制分装后于121℃，高压灭菌21min；培养温度为25℃，光照强度为30～50μmol/m2·s，每天光照12h，培养周期2个月。
组培苗提取物制备，将各试验组培苗茎、叶置烘箱中50℃烘干，分别粉碎后过60目筛，各称取100mg样品，采用超声辅助甲醇提取法(甲醇体积分数83％、料液比1:20、超声时间25min、提取次数5次)进行提取，提取液合并后转移至10mL容量瓶定容，供HPLC定量分析用。
CA含量计算，采用HPLC定量分析方法，分别取一定体积(30～50L)的各试验组培苗茎、叶提取液，按照标准曲线测定的方法进行操作，将测定所得的CA峰面积带入回归方程y＝457.18x-77.59(R2＝0.9997)，结合样品溶液中的CA质量(g)，按下式计算各试验组培苗茎、叶中的CA含量：CA含量＝[CA质量(g)/样品质量(g)]×100％。各提取液的CA测定重复三次，得到平均含量，并计算其相对平均偏差。
在色谱柱AgilentAnalytical Eclipse XDB-C18(4.6mm x 150mm，0.5m)，流动相：甲醇/水体系(含1％HAc)，洗脱体系：0～5min 5％甲醇，5～5.1min 5％～15％甲醇，5.1～25.0min 15％～65％甲醇，25.0～25.1min 65％～95％甲醇，25.1～35.0min95％～5％甲醇，流速：1.0mL/min，进样量30～50L，检测波长280nm，柱温30℃；通过CA标准品的面积外标法进行含量测定，对照品线性方程为y＝457.18x-77.59(R2＝0.9997)。
经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的樟叶越桔组培苗叶片和茎段中的CA含量分别达到7.33％和2.00％。
实施例3
本实施例条件和实施例2相同，不同在于：添加不同ZT+NAA，结果如表1所示。
表1添加不同ZT+NAA对CA含量的影响
Figure BDA0002411009410000041
Figure BDA0002411009410000051
由表1可以看出，植物生长调节剂ZT和NAA对樟叶越桔组培苗主要次生代谢产物CA含量的生产影响比较大，NAA单独作用下对CA含量的影响不大，同时使用ZT和NAA联合可以显著提高CA含量。

Claims (2)

1.一种提高樟叶越桔组培苗中6′-O-咖啡酰熊果苷含量的方法，其特征在于：选择以下培养基进行继代培养，所述培养基以WPM为基本培养基，添加ZT和NAA两种不同植物生长调节剂，其中ZT添加浓度为0.1～5.0mg/L，NAA添加浓度为0.01～2.0mg/L，调节pH值为5.0～6.0。
2.根据权利要求1所述提高樟叶越桔组培苗中6′-O-咖啡酰熊果苷含量的方法，其特征在于：培养条件为：培养基于121～125℃，高压灭菌21～25min；培养温度为25±2℃，光照强度为30～50μmol/m2·s，每天光照12±2h，培养周期2±0.5个月。
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