CN101629161A

CN101629161A - 龙牙楤木激素自养型细胞系

Info

Publication number: CN101629161A
Application number: CN200910072196A
Authority: CN
Inventors: 曲冠证; 由香玲; 詹亚光; 代金玲; 谭啸; 崔龙义; 李在善
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2009-06-05
Filing date: 2009-06-05
Publication date: 2010-01-20
Anticipated expiration: 2029-06-05
Also published as: CN101629161B

Abstract

本发明属于植物生物技术领域。利用龙牙楤木(Aralia elate Seem.)幼苗的叶子和根为外植体，在MS+2，4－D(0.1－5.0mg/L)+蔗糖(2％)的培养基中诱导获得了一个松散、生长快速的黄色激素自养型细胞系Aral－1。该细胞系在无外源激素的1/2MS培养基中生长3周的鲜重和干重都增长约11倍；用紫外分光光度计测定其总皂苷和总黄酮含量分别为7.10％，1.51％。其中总皂苷含量明显比激素依赖型的白色愈伤组织中的高，与对照野生叶柄中的总皂苷含量相差不大，是野生叶总皂苷的60％；总黄酮含量明显比激素依赖型的白色愈伤组织和野生叶柄中的高，是野生叶总黄酮的68.9％。该细胞系具有无激素快速生长、液体中良好分散相和相对较高药用成分含量等特点，可作为细胞规模化培养生产药用成分的材料。

Description

龙牙楤木激素自养型细胞系

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及通过组织培养方法获得了一种质地松散、黄色、生长迅速的激素自养型龙牙楤木细胞系。与野生叶子相比，该细胞系含有较高的药用次生代谢物黄酮和楤木皂苷，可用于龙牙楤木细胞规模化培养生产药用成分。

背景技术

龙牙楤木(Aralia elate Seem.)，属五加科楤木属的小乔木，是一种食药两用的植物。其嫩芽含有人体必需的各种氨基酸和微量元素，是一种很好的保健食品。龙牙楤木的主要药用成分为楤木皂苷和黄酮。其皂苷的主要构成部分是齐墩果酸。齐墩果酸具有抗炎、镇静、利尿、强心、免疫和防癌等作用，尤其用于治疗黄疸肝炎与迁延性慢性肝炎效果好。黄酮类化合物具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎、抗过敏、抗糖尿病并发症等多种生理活性及药理作用，且无毒无害，对人类的肿瘤、衰老、心血管病等退行性疾病的治疗和预防有重要意义。然而，它们的化学结构复杂，人工合成很困难，现在主要还是从植物中提取。龙牙楤木中齐墩果酸含量明显高于其他药用植物[张登科等，中药材，1989]，是一种很好的药用植物资源。尤其近几年来，其提取物显著的抗肿瘤作用，越来越被国际市场关注。由于过度采挖，而其种子发芽繁殖困难，所需时间长，加之木本特性，自然更新能力很低，致使目前龙牙楤木野生资源很匮乏。现有的栽培资源是为生产刺嫩芽建立的，也很有限。所以龙牙楤木也像其他许多药用植物面临的问题一样：既要开发其药用价值，又要不破坏野生资源和不争夺栽培资源。大量的研究已证明，利用植物生物工程理论和技术进行细胞规模化培养能很好的解决上述问题。

培养和筛选生长快、有用次生代谢产物稳定高产的细胞系，是植物进行细胞规模化培养最先解决的关键问题，但是植物细胞的一些生物学特性不利于规模化培养。例如，植物细胞培养过程中易聚集成团，使次生代谢产物合成不稳定；植物细胞生长相对缓慢，培养周期较长。生长快、高产稳定细胞系能较好地克服上述问题。在许多植物中已经获得了这样的细胞系，且有的实现了产业化。例如，1981年日本Tabata等(Phytochem，1981)利用紫草原生质体克隆，经克隆获得了一个细胞系，紫草素含量是亲本的2倍。1983年日本Fujita等(Biotechnology，1983)利用该细胞系成功进行了紫草素工业化生产。Sasse等(PlantPhysiol，1982)从骆驼蓬细胞系中获得一个哈尔满生物碱比亲本高10倍的细胞系。Yamada和Sato等(Phytochem，1984)获得了一个生长快、小蘖碱含量高达干重13％的细胞系。在我国像人参、三七、三分三等植物也都培育获得了稳定高产细胞系。目前有关龙牙楤木这样的细胞系还未查到相关报道。我们获得的生长快、激素自养型细胞系将为龙牙楤木利用细胞规模化培养，生产药用成分提供良好材料，这对龙牙楤木资源的保护和开发应用都具有重要的意义和价值。

发明内容

本发明涉及一种龙牙楤木激素自养型细胞系，并保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学，430072，电话：027-68752319)，保藏日为2009年6月2日，保藏号为CCTCCNo.P200901，建议的分类命名为龙牙楤木激素自养型细胞系Aral-1。该细胞系具有以下特征：黄色，质地松散，在液体中分散相良好；在无激素条件下生长速率快，1/2MS固体培养基培养周期为3周，干重增长11倍。其总皂苷含量为7.1％，是野生叶总皂苷的60％；其总黄酮含量为1.51％，是野生叶中总黄酮含量的68.9％。该细胞系上述特征非常适合细胞规模化培养生产药用成分。

具体的技术路线包括以下几个部分的内容：

1、激素自养型细胞系的获得：具体是首先将层积好的，开荚龙牙楤木种子，用常规方法消毒后，取出其成熟的合子胚接种于1/2MS培养基中进行萌发。一周后以萌发小苗的叶子、根为材料接种于MS+2，4-D(0.1-5.0mg/L)+蔗糖(2％)的培养基中诱导出白色和黄色愈伤组织。经过观察和筛选，最终确定黄色松散的细胞系在无任何生长调节剂下能快速生长，为激素自养型细胞系。

上述培养基都是首先经过高温高压灭菌(121℃、1.5个大气压、15分钟)后使用的。材料在常规组织培养室中培养的(温度24～26℃，光照强度1000～1500Lx，光/暗周期16h/8h，湿度60％～70％)。

2、激素自养型细胞系在无激素培养基中生长情况分析：在一定生长时期内，根据初始接种量和收获量，计算该细胞系的生长量，确定其生长速率。

3、药用成分(总皂苷、总黄酮)含量分析：将获得的细胞系，利用紫外分光光度计分析其总皂苷和黄酮含量，利用高压液相色谱法分析齐墩果酸含量。与野生6月份采收的叶子、诱导的白色愈伤组织有效成分含量进行比较。

附图说明

附图1黄色愈伤组织

附图2白色愈伤组织

附图3黄色激素自养型细胞系在液体培养基中良好的分散相

附图4齐墩果酸标准曲线

附图5黄酮标准曲线

附图6不同龙牙楤木材料中总皂苷和总黄酮含量

具体实施方式

实例1龙牙楤木激素自养型细胞系的获得

1)材料来源

2007年10月初龙牙楤木种子采自黑龙江省林业多种经营研究所(牡丹江市)种子园。

2)龙牙楤木种子层积处理打破休眠

由于龙牙楤木成熟的果实中，合子胚没有发育成熟，所以种子发芽存在休眠，要打破休眠，必须进行合子胚后熟处理。我们用的处理方法是层积处理。即将种子先经过简单的消毒处理后与湿沙按比例混合，置于4℃冰箱中进行层积处理。

3)无菌实生苗的培育

种子层积4个月后，选择开荚的、合子胚发育成熟的种子，在超净工作台中利用常规消毒处理后取出合子胚，接种于事先准备好的1/2MS培养基中，使胚萌发长成无菌小苗。

4)愈伤组织诱导、特殊细胞系的选择及增殖

小苗萌发一周后，切割1×1cm叶盘和1cm根段作为外植体，接种于含有2，4-D(0.1-5.0mg/L)和蔗糖(2％)的MS培养基中进行弱光培养，诱导愈伤组织。4周后，发现有一个愈伤组织细胞系呈黄色较松散，其他全为白色愈伤组织。将黄色愈伤组织和生长较快的白色愈伤组织在低2，4-D浓度(0.1mg/L)的培养基中每3周继代1次，连续继代2次。之后选择生长较快的愈伤组织，除去2，4-D后，每2周继代1次进行培养，连续继代3次。最后，筛选出一个松散、生长快速的激素自养型黄色细胞系。该细胞系在无任何外援激素的培养基中连续继代6个月生长仍然很旺盛。

实例2激素自养型细胞系的生长量测定

将鲜重为0.16-0.18g细胞置于4个装有30ml 1/2MS固体培养基的100ml玻璃三角瓶中培养3周后，4瓶的生长量为7.81g鲜重和0.48g干重，干重增长11倍，鲜重增长10.8倍。

表1激素自养型细胞系在固体1/2MS培养基中培养3周的生长情况

实例3激素自养型细胞系总皂苷含量的测定

1)供试品溶液的制备

取龙牙楤木干燥粉末0.5g，精密称定，加入无水乙醇溶液15mL，超声振荡25min。之后在70℃的恒温水浴中提取3次，每次1h，收集合并提取液，蒸干。残渣加5mL水溶解后，以乙醚萃取，至乙醚层无色为止，收集合并水溶液，蒸干。残渣以甲醇溶解并定容至50ml，得楤木总皂苷的样品溶液。

2)标准曲线的绘制

齐墩果酸标准品购自中国医药生物制品研究所，批号为(110709-200505)。精确称取齐墩果酸标准品5mg，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得浓度为1mg/mL的标准溶液。精确量取齐墩果酸标准溶液20、40、60、80和100μL，分别置于冰水浴的试管中，精确加8％香草醛-乙醇溶液(香草醛0.8g溶入无水乙醇10mL中，用前新鲜配制)0.5mL和70％硫酸(取蒸馏水30mL，加浓硫酸70mL，混匀，冷却至室温)5.0mL，摇匀，混合物于60℃恒温水浴加热10min，然后立即在冰水浴中冷却15min。设对照为空白试剂。于波长540nm处测其吸光度。取3次重复平均值，绘制楤木皂苷的标准曲线。回归方程为：y＝0.002x+0.020，相关系数：R²＝0.994。齐墩果酸标准品在20～100μg范围，吸收曲线呈现良好的线性关系。

3)稳定性试验

取样品供试液，精密吸取100μL，按标准曲线制备项下的方法进行测定。将同一份反应液间隔10分，测定吸收值，其标准偏差为1.1％，表明样品在10分钟内稳定性良好。

表2稳定性试验结果

4)精密度试验

取齐墩果酸标准溶液，按所述的测定方法，重复测定，记录吸光度，其标准偏差为0.7％，表明仪器精密度良好。

表3精密度实验结果

5)重现性试验

取同一个样品5份，分别制备供试品溶液，测定吸光度，计算总皂苷含量和标准偏差，结果显示重现性良好。

表4重现性结果

6)加样回收率试验

取已知含量的龙牙楤木粉末，精密称定，加入适量齐墩果酸对照品液，测定总皂有较高的回收率，为98.3％。

表5总皂苷回收率

7)激素自养型细胞系总皂苷含量的测定：

以野生龙牙楤木叶和叶柄及白色愈伤组织为对照，分析激素自养型细胞系中总皂苷的含量(结果见表5)。

激素自养型细胞系总皂苷含量明显比激素依赖型的白色愈伤组织中的高，与对照野生叶柄中的总皂苷含量相差不大，是对照野生叶总皂苷的60％。

实例4激素自养型细胞总黄酮含量测定

1)供试品溶液的制备

采用超声波法对其总黄酮进行了提取。将0.5g干燥粉末放入三角瓶中，加入50％的乙醇溶液40mL，密封好后于超声波反应器中提取90min，取滤液定容至50mL备用。

2)对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品10.60mg，置50mL量瓶中，加入50％乙醇水溶液溶解，并稀释至刻度，制成对照品溶液。

3)测定波长的选择

精密量取芦丁对照液3mL，置25mL量瓶中，加5％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，静置6min，加10％硝酸铝溶液1mL，摇匀，静置6min，加4％氢氧化钠10mL，再加50％乙醇至刻度，摇匀，静置15min，置比色皿中在波长400～600nm之间测定吸光度，确定最大吸收波长为510nm。

4)标准曲线的绘制

精密吸取芦丁对照液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分别置于25mL容量瓶中，加5％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，静置6min；加10％硝酸铝溶液1mL，摇匀，静置6min，加4％氢氧化钠10mL，再加50％乙醇至刻度，摇匀，静置15min后，以相应试剂做空白，于510nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。

回归方程为：y＝0.1197x-0.0267，相关系数：R²＝0.9959。芦丁在1.0～6.0mg范围，吸收曲线呈现良好的线性关系。

5)稳定性试验

精确吸取供试品溶液置于10mL容量瓶中，按上述方法每隔10min测一次吸光度，连续测7次。结果(见表6)表明1h内显色稳定。

表6稳定性试验结果

6)精密度试验

将同一样品溶液按上述方法操作后，测定吸光度，标准偏差为2.18(见表7)，说明仪器精密度良好。

表7精密度试验结果

7)样品测定

野生龙牙楤木叶、野生叶柄、白色愈伤组织和激素自养型细胞中总黄酮的含量分别为2.19％、0.35％、1.51％、0.85％。激素自养型细胞系的总黄酮含量明显比激素依赖型的白色愈伤组织和野生叶柄中的高，是野生叶中总黄酮的68.9％。

Claims

1、一种激素自养型龙牙楤木细胞系Aral-1，其保存号为CCTCC No.P200901。

2、一种激素自养型龙牙楤木细胞系Aral-1(CCTCC No.P200901)，其特征在于黄色、在无外源激素的1/2MS培养基中快速生长，3周的生长量为原来干重的11倍。

3、一种激素自养型龙牙楤木细胞系Aral-1(CCTCC No.P200901)，其特征在于质地松散，在液体中具有良好的分散相。

4、一种激素自养型龙牙楤木细胞系Aral-1(CCTCC No.P200901)，其特征在于含有较高含量的总皂苷(7.1％)和总黄酮(1.51％)，分别是野生叶子中的60％和68.9％。

5、一种激素自养型龙牙楤木细胞系Aral-1(CCTCC No.P200901)，用于细胞培养研究其皂苷和黄酮代谢过程极其调控机理。

6、一种激素自养型龙牙楤木细胞系Aral-1(CCTCC No.P200901)，用于细胞规模化培养生产龙牙楤木皂苷和黄酮。