CN102002086A - 一种以宣木瓜细胞培养法制备化合物齐墩果酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以宣木瓜细胞培养法制备化合物齐墩果酸的方法，首先以宣木瓜茎段为外植体接种MS固体培养基，于25±1℃条件下诱导愈伤组织，然后通过诱导出的愈伤组织的继代，优化培养，使愈伤组织达到疏松旺盛的状态，适合悬浮培养。再将优化后的愈伤组织接种在MS液体培养基中进行悬浮培养，再次通过优化，得到生长旺盛，次生代谢物质较高的培养条件，经分离提纯得到齐墩果酸。培养物中齐墩果酸含量达6.88％，高于宣木瓜成熟果实中的含量。本发明方法具有培养周期短、效率高、对环境无污染等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞悬浮培养法制备生物药物的方法，具体地说是一种利用宣木瓜的外植体诱导愈伤组织，并进行细胞悬浮培养生产三萜类化合物——齐墩果酸的方法。
背景技术
人类对植物次生代谢物质的利用有着悠久的历史，次生代谢物是药用植物重要有效成分，但其受植物产量和次生物含量的限制，有些次生物质在自然界的含量甚微，从而局限了植物次生代谢物质的广泛应用；同时野生资源日益减少和栽培品种品质退化，给临床使用和质量控制带来许多困扰。随着生物技术方面的长足进步，人们把目光聚集在利用生物技术获取植物次生物质的研究上。为此，相关研究的科学家们经过近几十年的探索发现，通过植物细胞的规模培养，可以实现植物次生代谢物质“工厂化”高效生产。利用细胞培养生产有效成分，能缓解药用植物资源压力，对于那些生长条件要求严格、生长缓慢、产量小、采集困难、价值贵重的植物药，用这种方法更具有重要意义。
通过药用植物的细胞培养生产次生代谢物质有以下优点：(1)四季均可生产，不受地区、季节及有害生物的影响。(2)占地面积少，可对细胞生长自动控制和代谢过程合理调节，能够完全在人工条件下进行，可以排除病虫害与农药残留量的困扰，且能够严格控制药材的质量，便于进行大规模工业化生产。(3)便于筛选高产细胞株。通过优化培养液、培养条件和选择优良细胞系的方法，可得到含量高于整株植物栽培的次生代谢产物。研究资料显示，有40余种化合物在培养的组织细胞中含量高于完整植物水平。如培养的人参细胞中人参皂甙的含量是天然植物的5.7倍；雷公藤培养细胞中雷公藤内酯的含量是原植物含量的49倍。(4)利于生物转化，寻找新的有效药物成分。植物细胞内存在羟基化酶、氧化酶、还原酶、甲基化酶、酯化酶、糖基转移酶、糖苷酶等多种酶，植物培养物作为一种生物反应器转化外源化合物，能够产生原植物所没有的，甚至是至今自然界尚未发现的化合物。(5)个体差异小，生产周期短，设备简单，能节省人力、物力等。可以在人为提供的一定温度、光照时间、湿度、营养激素等条件下进行科学培养生产。根据需要，按不同药用植物外植体建立不同的培养条件，按几何级数大量繁殖生长，从而可提供大量的优质无病毒种苗和高产细胞株有利于自动化、规模化生产，提高生产效率。(6)利用组织培养过程中出现的芽变或人工诱变，或进行脱毒，培育新品种，提高药用植物品质。(7)保存种质资源。
宣木瓜，又名皱皮木瓜，学名为贴梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai，属蔷薇科木瓜属，落叶阔叶灌木，为常用中药材木瓜的基原，具有很高的药用价值和食用价值。中医认为宣木瓜有舒筋、活络、健脾开胃、舒肝止痛、祛风除湿之功效，在临床上可用于预防和治疗风湿病、霍乱、痢疾、肠炎、脚气病及维生素C缺乏症等疾病。齐墩果酸是宣木瓜的主要药效成分之一。其是五环二萜类化合物，分子式为C30H48O3，是木瓜的主要药效成分，纯品齐墩果酸为白色针状结晶，熔点为308～310℃，不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。有关资料表明，木瓜中齐墩果酸以单体形式存在。
齐墩果酸的主要生理功能有：
1抗肿瘤作用 近年来，人们对OA抗肿瘤的作用机制研究主要通过以下几方面进行：(1)齐墩果酸能抗DNA突变、抑制癌变的启动。(2)齐墩果酸具有肿瘤逆转作用及抗侵袭性。(3)诱导肿瘤细胞凋亡。(4)抑制肿瘤血管形成。总之，OA的抗癌作用几乎贯穿了肿瘤发展的各个阶段。
2保肝作用 齐墩果酸化学结构有双键、羟基、羧基等多个活泼官能团，易发生一些化学反应，如与体内毒性物质结合，起到解肝毒作用。齐墩果酸预处理也可防止四氯化碳诱导的肝谷胱甘肽的排空。动物实验还证实经预处理可将肝中金属硫蛋白(MT)增加了近30倍。经临床验证，齐墩果酸可有效治疗病毒性肝炎，是抗病毒性肝炎药的主要活性成分。
3降血脂、降血糖 早期文献报道，齐墩果酸可降低实验性糖尿病大、小鼠血糖水平，对实验性高血脂症大鼠和兔均有明显的降脂作用。
4对心血管作用 齐墩果酸对心血管疾病作用是其药理作用研究的新发现。有研究指出，齐墩果酸对实验性高血压大鼠无直接降压作用，但有直接的强心作用。当鉴于其同时具有降压、强心及抗心律失常作用，对于高血压合并心绞痛及心力衰竭的患者将是一个很好选择。
目前国内外对宣木瓜齐墩果酸的作用机理和作用效果研究成果较多。在医药上已经广泛应用，在功能食品开发方面越来越受到重视。木瓜药食兼用，已有较大规模的利用宣木瓜果实来加工罐头、果脯、果酱、果酒、果汁等，将其制成保健食品的种类也越来越多。宣木瓜性味甘平微寒、无毒，适合食用，且有益健康。所以目前市场对宣木瓜及其药用成分需求量增长迅速，而目前的生产方式并不能满足市场的需求。
发明内容
本发明公开了一种以宣木瓜细胞培养法制备化合物齐墩果酸的方法，所要解决的技术问题是利用宣木瓜的外植体对愈伤组织进行诱导、扩大培养、细胞大规模的悬浮培养最后生产齐墩果酸。
本发明的技术方案如下：
一种以宣木瓜细胞培养法制备化合物齐墩果酸的方法，以宣木瓜茎段为起始原料，包括宣木瓜愈伤组织的诱导、愈伤组织继代优化培养和细胞悬浮培养以及齐墩果酸的分离和提取，包括以下步骤：
(1)培养基的配制
配制MS固体培养基，每升蒸馏水加入6-8g琼脂，30-32g蔗糖，1mg2，4-D，0.5mg KT，调节培养基pH在5.5-6.0之间。分装于100ml的三角瓶中，每瓶25ml左右，然后进行高压消毒，压力为1.0-1.5Kg/cm2之间，时间为20分钟。
(2)以宣木瓜茎段为材料，用75％的酒精浸泡4-6s，随后转移至0.1％升汞溶液中进行表面消毒6-10min，将茎段切成0.8-1.2cm小段，接种于已配制的MS固体培养基上，培养温度为25±1℃，经过15～20d左右的培养，在切口处获得较多的愈伤组织；
(3)将诱导出的愈伤组织从母体分离，对其进行继代培养，温度25±1℃，通过调节不同糖浓度、不同pH值、不同培养条件等对愈伤组织的培养进行优化，每次调控的周期为三周左右，5次以上继代后，获得颜色为浅黄色的疏松的愈伤组织，此时的愈伤组织可建立悬浮细胞体系；
(4)细胞悬浮培养
以多次继代后所得的宣木瓜疏松愈伤组织为试验材料，接种于MS液体培养基进行悬浮培养，液体培养基未加琼脂，其余和固体培养基组成相同。分装于250ml三角瓶中，每瓶装液量为95-100ml，接种量为3-5g，接入培养瓶后放入恒温的悬浮振荡器，培养条件为：温度25±1℃，摇床转速110-120转/分钟，培养20-22天；通过调节不同的碳源，不同起始pH，不同激素等对悬浮培养条件筛选优化。
(5)分离提取齐墩果酸
悬浮后获得的细胞悬浮液，对其进行抽滤，收集滤纸上面的新鲜愈伤组织，置于60℃烘箱烘干至恒定质量进行研磨。称取愈伤粉1g置于三角瓶中，加入95％乙醇25ml，混合，在超声条件下提取30min，蒸馏回收溶剂，得到的浸膏状的物质用水和氯仿洗涤几次，合并洗涤液，弃水层，蒸馏氯仿，获得齐墩果酸用无水乙醇溶解并定容至25ml。然后对其用紫外分光光度计进行分析测定。
本发明以宣木瓜茎段为原始材料，对外植体进行诱导培养，建立并筛选出适合通过细胞培养法生产齐墩果酸的悬浮培养体系。设计了相应的生长、生产培养基配方。该方法有培养周期短、效率高、对环境无污染等特点。
本发明较已有技术相比具有如下优点：
(1)生产过程完全可控，不受自然环境的影响；
(2)无农药及重金属残留；
(3)提取工艺简单；
(4)低成本，节约大量耕地，提高资源利用率和石榴经济林的综合经济价值；
(5)生产效率高：宣木瓜细胞悬浮培养的齐墩果酸最高含量达到6.88％，远高于宣木瓜成熟果实中齐墩果酸的含量。
具体实施方式
现以实验室培养为例，非限定实施例叙述如下：
下面以实施例形式详细叙述本发明的宣木瓜细胞培养生产齐墩果酸化合物的工艺流程(不限于本实施例)：
1、培养基的配制
配制MS固体培养基，每升加入6-8g琼脂，30-32g蔗糖，1mg2，4-D，0.5mgKT，调节培养基pH在5.5-6.0之间。分装于100ml的三角瓶中，每瓶25ml左右，然后进行高压消毒，压力为1.0-1.5Kg/cm2之间，时间为20分钟。
2、愈伤组织的诱导
以宣木瓜茎段为材料，用75％的酒精浸泡4-6s，随后转移至0.1％升汞溶液中进行表面消毒6-10min，将茎段切成0.8-1.2cm小段，接种于MS固体培养基，培养温度为25±1℃，经过15～20d左右的培养，在切口处获得较多的愈伤组织；
3、愈伤组织继代优化
配置不同成分的培养基，将已经诱导的愈伤组织继代于不同的培养基上，主要是不同培养基组分，及其不同的培养条件对愈伤组织生长的影响，为得到疏松旺盛的悬浮细胞材料对继代的细胞不断优化。每次优化条件：温度25±1℃、弱光照培养20d左右。挑选出颜色嫩黄色，生长疏松旺盛的愈伤进行继代培养，优化出最佳状态的愈伤组织进行下一步的细胞悬浮培养。
4、细胞悬浮培养
以多次继代后的宣木瓜疏松愈伤组织为试验材料，接种于MS液体培养基进行悬浮培养，培养基的组成(1)相同，分装于250ml三角瓶中，每瓶装液量为95-100ml，接种量为3-5g，接入培养瓶后放入恒温的悬浮振荡器，培养条件为：温度25±1℃，摇床转速110-120转/分钟，培养20-22天；
以多次继代后的宣木瓜疏松愈伤组织为试验材料，接种于MS液体培养基中进行悬浮培养，液体培养基未加琼脂，其余和固体培养基组成相同，分装于250ml三角瓶中，每瓶装液量为95-100ml，接种量为3-5g，接入培养瓶后放入恒温的悬浮振荡器.培养条件为：温度25±1℃，摇床转速110-120转/分钟，培养20天后每瓶细胞鲜重增长较大，最多的可达19.49g，培养物齐墩果酸含量最高的达6.88％，高于宣木瓜总的齐墩果酸含量。优化培养细胞，使细胞生长旺盛的同时能够得到最大产量的齐墩果酸。
4、分离提取齐墩果酸
悬浮后获得的细胞悬浮液，对其进行抽滤，收集滤纸上面的新鲜愈伤组织，置于60℃烘箱烘干至恒定质量进行研磨。称取愈伤粉1g置于三角瓶中，加入95％乙醇25ml，混合，在超声条件下提取30min，蒸馏回收溶剂，得到的浸膏状的物质用水和氯仿洗涤几次，合并洗涤液，弃水层，蒸馏氯仿，获得齐墩果酸用无水乙醇溶解并定容至25ml，然后对其用紫外分光光度计进行分析测定。
Claims (1)
1.一种以宣木瓜细胞培养法制备化合物齐墩果酸的方法，以宣木瓜茎段为起始原料，包括宣木瓜愈伤组织的诱导、愈伤组织继代优化培养和细胞悬浮培养以及齐墩果酸的分离和提取，包括以下步骤：
(1)培养基的配制
配制MS固体培养基，每升蒸馏水加入6-8g琼脂，30-32g蔗糖，1mg2，4-D，0.5mg KT，调节培养基pH在5.5-6.0之间，分装于100ml的三角瓶中，每瓶25ml左右，然后进行高压消毒，压力为1.0-1.5Kg/cm2之间，时间为18-22分钟；
(2)以宣木瓜茎段为材料，用75％的酒精浸泡4-6s，随后转移至0.1-0.12％升汞溶液中进行表面消毒6-10min，将茎段切成0.8-1.2cm小段，接种于已配制的MS固体培养基上，培养温度为24-26℃，经过15～20d左右的培养，在切口处获得较多的愈伤组织；
(3)将诱导出的愈伤组织从母体分离，对其进行继代培养，温度24-26℃，通过调节不同糖浓度、不同pH值、不同培养条件等对愈伤组织的培养进行优化，每次调控的周期为三周左右，5-8次继代后，获得颜色为浅黄色的疏松的愈伤组织，此时的愈伤组织可建立悬浮细胞体系；
(4)细胞悬浮培养
以多次继代后所得的宣木瓜疏松愈伤组织为试验材料，接种于MS液体培养基进行悬浮培养，分装于250ml三角瓶中，每瓶装液量为95-100ml，接种量为3-5g，接入培养瓶后放入恒温的悬浮振荡器，培养条件为：温度24-26℃，摇床转速110-120转/分钟，培养20-22天；通过调节不同的碳源，不同起始pH值，不同激素等对悬浮培养条件筛选优化；
其中，所述的MS液体培养基的配制和步骤(1)所述的配制MS固体固体培养基相同，只是不加琼脂；
(5)分离提取齐墩果酸
悬浮后获得的细胞悬浮液，对其进行抽滤，收集滤纸上面的新鲜愈伤组织，置于60℃烘箱烘干至恒定质量进行研磨；称取愈伤粉1g置于三角瓶中，加入95％乙醇25ml，混合，在超声条件下提取30min，蒸馏回收溶剂，得到的浸膏状的物质用水和氯仿洗涤几次，合并洗涤液，弃水层，蒸馏氯仿，获得齐墩果酸用无水乙醇溶解并定容至25ml，然后对其用紫外分光光度计进行分析测定。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101268758A (zh) * | 2008-05-09 | 2008-09-24 | 南京林业大学 | 一种宣木瓜组织培养快速繁殖的方法 |
| CN101475929A (zh) * | 2009-01-19 | 2009-07-08 | 东北林业大学 | 一种利用白桦悬浮培养生产齐墩果酸的方法 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101268758A (zh) * | 2008-05-09 | 2008-09-24 | 南京林业大学 | 一种宣木瓜组织培养快速繁殖的方法 |
| CN101475929A (zh) * | 2009-01-19 | 2009-07-08 | 东北林业大学 | 一种利用白桦悬浮培养生产齐墩果酸的方法 |
| CN101629161A (zh) * | 2009-06-05 | 2010-01-20 | 东北林业大学 | 龙牙楤木激素自养型细胞系 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 《河南中医学院学报》 20030731 张丽萍等 怀牛膝组织培养及齐墩果酸定量分析的研究 32-33 1 第18卷, 第107期 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111771724A (zh) * | 2020-07-24 | 2020-10-16 | 广东省农业科学院果树研究所 | 一种基于单细胞起源的番木瓜高效植株再生方法 |
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