CN1331388C - 水母雪莲毛状根培养生产雪莲多糖类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种水母雪莲总多糖的毛状根培养生产方法，该方法步骤涉及：采用水母雪莲的无菌试管苗，用菌种—R1000，R1601，LBA9402感染，获得的雪莲毛状根用于生产雪莲多糖；生产水母雪莲多糖的毛状根的悬浮培养使用的培养基是：1/2MS培养基;试验证明用本方法其毛状根培养物中总多糖类化合物的含量为毛状根干重的5—10%，总多糖生产率为1～2g/L。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术工程领域，具体地说涉及一种高产多糖的水母雪莲毛状根的培养方法，还包括多糖的分离、提取、制备工艺方法。
技术背景
雪莲花又名雪莲，是我国三类珍稀植物，早在《西北域记》和《相园小识》中，就有关于雪莲的记载，并把二者合而为一，统称雪莲花。作为雪莲花，原生植物名称随产地而别，如西藏等地用三指雪兔子S.tridactyla Sch.Bip.；四川、云南等地用绵头雪兔子S.lanicpsHand.-Mazz.；甘肃、青海等地用水母雪莲S.medusa Maxim；青海也用雪兔子S.gossypiphora D.Don.；新疆用天山雪莲(雪荷花)S.involucrata Kar.et Kir，等，但均属于菊科风毛菊属Saussurea雪兔子亚属Subgen Eriocorye植物，且一般分布于海拔4,000米以上的高山流石滩上。
雪莲花是生长在海拔4000米以上的高山雪线附近的民间常用的一类名贵药用植物，属多年生草本植物。雪莲花性温，味微苦，入肝、脾、肾三经。具有散寒除湿，活血通经、强筋助阳、抗炎、镇痛、收缩子宫等功能，民间用于治疗风湿性关节炎，延缓衰老、动脉硬化、终止妊娠，妇女小腹冷痛、闭经、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、阳萎等症。雪莲多糖有清除自由基和抗疲劳的作用。雪莲花原生植物种类较多，虽然据中药文献记载均可同等入药，但其品质有优劣之分。如雪兔子为大体型的雪莲，产量较大；绵头雪兔子(又称绵头雪莲花)也是一种较大体型的雪莲，产量大；水母雪兔子(又称水母雪莲花)为一种小体型的雪莲；三指雪兔子(又称三指雪莲花)也为一种小体型的雪莲。据有关报道，在以上几种雪莲中销售量最大的是新疆天山雪莲(雪荷花)S.involucrata Kar.et Kir.和水母雪莲S.medusa Maxim。
雪莲为多年生草本植物，自然生长缓慢，采集野生雪莲入药对野生资源具有严重的破坏而且还会造成对资源生态环境的破坏。为此，我国早已将雪莲列为国家三级保护植物。野生雪莲中有效成分——多糖类化合物含量低，通常只有干重的0.7％左右。为此，迫切需要解决药用雪莲资源问题。然而，通过人工培育解决雪莲资源问题是一种有效的途径，可是目前尚未见到有关用细胞培养高产雪莲多糖类化合物这方面的报道。
现代生物技术的运用使大规模生产植物次生代谢物成为可能。利用发根农杆菌诱导植物产生的毛状根具有单细胞起源性、激素自主性、生长快速性、遗传稳定性和次生代谢物高量积累性，使其成为成为继植物细胞发酵培养后又一种更具有优势的工业化获得某些有效成分开辟了新途径。目前，国内报道有诱导毛状根成功的中草药大约人参、西洋参、宁夏枸杞、绞股蓝、荞麦、露水草、松蓝、青蒿、长春花、何首乌、丹参、恬楼、栗米草、甘草、膜荚黄芪、银杏、龙胆、毛喉鞘蕊花、少花龙葵、紫果西番莲、桔梗、红豆草、墨旱莲、红豆杉、天山大黄、决明、天仙子、薯蓣、莨菪等23科50余种药用植物，其具体数目正不断增加。因此，通过毛状根诱导及培养技术解决雪莲资源问题是一种有效的途径，可是目前尚未见到有关用毛状根培养生产雪莲多糖类化合物这方面的报道。
发明内容
为了解决和克服雪莲自然资源的匮乏和由于采集造成对自然资源的破坏。鉴于此，本发明的目的在于建立一种雪莲毛状根细胞系及毛状根培养方法，从而利用培养的高产多糖的雪莲毛状根达到生产雪莲多糖类化合物的目的。该方法步骤涉及：
1.水母雪莲转化体系及毛状根细胞系的建立：
水母雪莲的无菌种子置MS培养基萌发。取3天苗龄的绿色子叶，留2mm左右的子叶柄，置MS+2.0mg/L BA+0.1mg/L NAA培养基上，诱导培养获得丛生苗。丛生苗置MS+1.0mg/L BA+0.5mg/L IAA培养基，进行单株培养。选用MS+1.0mg/L BA+0.2mg/L IAA+200mg/L CH+60mg/L KCl培养基时能使苗更健壮。单株移置诱根培养基1/2MS+1.0mg/L IAA+0.5mg/L NAA+60mg/L KCl，10天后即出现4-7条直径为0.5-1.5mm、长0.5-2.0cm的实生根。
以在MS+1.0mg/L 2，4-D+0.2mg/L BA+1.5mg/L AgNO3中暗培养2-4天的叶片切段为外植体，经在50μmol/l乙酰丁香酮和250mg/L脯氨酸培养过的发根农杆菌R1601介导，进行转化。其外植体于含20mg/L蔗糖的1/2MS+0.5mg/L GA3+500mg/L Cef光照培养3-5天，弱光培养诱导发根。10天以后有毛状根出现的材料接入筛选培养基：含20mg/L蔗糖的1/2MS+500mg/L Cef+100mg/L Km+0.5-1.0mg/L IAA+0.5mg/LNAA+0.5 mg/L GA3保持弱光培养。两周以后，切下2-5毫米的根尖接入筛选平板：含20mg/L蔗糖的1/2MS+300mg/L Cef+80mg/L Km一周以后，切取抗Km根系根尖1-2cm用于进行液体扩大培养。
2.雪莲高产多糖毛状根系悬浮液体培养生产多糖类化合物：选择抗Km且甘露碱检测显阳性的发根根系，切下长2.0--4.0cm根尖部分。
培养基：液体N6培养基，如果有菌再生则加入200-500mg/L Cef。
培养条件：40ml培养基分装于100ml三角瓶，弱光或暗培养条件下，于摇床上以50-80rpm/min震荡培养，25天继代一次。
培养优化：蔗糖30mg/L，GA3 0.Smg/L，AgNO3 0.5-1.0mg/L，有利于发状根的生长和多糖积累，一个周期的生长量(鲜重)为接种量的10-15倍。
3.本发明的目的还在于提供一种雪莲毛状根培养物多糖类化合物的分离、提取、制备工艺。
雪莲细胞培养物置于干燥器中，60℃烘干后，用粉碎机粉碎成20目的粗粉。用石油醚进行脱色、脱脂。然后，加入蒸馏水，98℃水浴中连续加热浸提15h。真空抽滤，将滤液收集起来，4℃保存。
同理在滤渣中再加入0.5M的NaOH溶液，98℃水浴中继续浸提5h，抽滤，收集滤液，4℃保存。将所得滤液减压浓缩至原体积的1/5，加入1 0％醋酸铅进行沉淀，除去酚性物质、蛋白质、鞣质等杂质，用10％Na2SO4除去多余的铅离子。再加入4％活性炭(m/v)，60℃下水浴脱色1小时。加入无水乙醇、丙酮反复沉淀，离心，低温真空干燥，得到多糖。
我们通过发根农杆菌R1601诱导水母雪莲得到的毛状根，在25天左右能够增殖10-25倍，干燥毛根中所测的总多糖含量最高达毛状根干重的5-10％，比野生生药的0.5％有显著的提高。因此，通过毛状根诱导及培养技术解决雪莲资源问题是一种有效的途径，可是目前尚未见到有关用毛状根培养生产雪莲多糖化合物这方面的报道。雪莲为国家保护植物，利用植物毛状根大量培养生产雪莲多糖类化合物，走工业化生产的途径，可有限地保护野生资源，保护生态环境。
本发明较与已有技术相比具有如下优点及积极效果：
(1)雪莲为国家保护植物，利用植物细胞大量培养生产雪莲多糖化合物，走工业化生产的途径，可有限地保护野生资源，保护生态环境。
(2)应用细胞大量培养生产多糖类化合物，与栽培和野生的植物相比，可获得稳定的质量和产量，不受自然条件的限制的影响。
(3)不占用耕地面积，只需要占用有限的厂房和培养室。
(4)通过人工调节与控制细胞的生长和次生产物的合成；可极大地提高多糖类化合物的产量
(5)该项技术，不使用光照，在暗中进行细胞培养，故可节省电力，减少成本价格。产量与含量稳定，污染率极低。
附图说明
图1.水母雪莲试管苗的培养
图2.水母雪莲毛状根的液体培养
图3.水母雪莲毛状根中甘露碱的纸层析检测
图4.水母雪莲毛状根中rol B基因的PCR检测
图5.R1601第二次活化生长曲线(注：第2次活化接种按2％加入4℃下的保存菌液)
图6.多糖测定的标准曲线(注：y＝3.3607x+106.0472 R＝0.9991638；X：absorb，Y：多糖含量(μg)；测量范围：10-70μg；)
具体实施方案
为了更好理解本发明，通过如下实施例予以进一步说明，但并非是对本发明的限定。
实施例中涉及的缩写术语、培养基：
1.外植体-水母雪莲的无菌试管苗新展开叶片，切开成1.0cm2片段
2.菌种-R1000，R1601，LBA9402 发根农杆菌LBA9402为野生型，由清华大学郭志钢教授惠赠；R1000为野生型，R1601是R1000的人工改造菌株，涉及的改造为：第一、农杆碱型pRiA4质粒的TL--DNA上插入新霉素磷酸转移霉基因(nptII)，转基因细胞可以用卡那霉素筛选；第二、引入高毒力Ti质粒pTiBo542的vir区域，提高了R1601的感染效率。北京大学林忠平教授赠送R1601，R1000。
3.发根农杆菌培养基：YEB、YMB、LB
4.植物基本培养基：MS(Murashige and Skoog，1962)；N6培养基(朱自清，1975)
5.抗生素：卡那霉素Km(kanamycin)、头胞霉素Cef(cephamycin)
6.激素：2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid)、BA(benzyladenine)、GA3(gibberellic acid)、IAA(Indoleacetic acid)，NAA(Naphthaleneaceticacid)
7.其他试剂：乙酰丁香酮(AS，3，5-methoxy-4-hydroxyacetophenone)、脯氨酸(Pro，proline)、甘氨酸(Gly，glycin)
8.标准品：甘露碱(Man，mannopine)、精氨酸(Arg，arginine)
实施例1：建立水母雪莲高频再生体系
1.1种子消毒处理
种子来源：2001年于祁连山采摘的水母雪莲(S.medusa Maxim)干品，从花序中剥得种子
清洗：挑选健康饱满，无霉变的种子，自来水冲洗4遍，室温浸泡过夜，流水冲洗1h。
消毒：70％乙醇浸泡30s，0.01％升汞作用10---14min，无菌水清洗4-6次。
无菌种子培养：用无激素MS培养基，0.6％琼脂。25℃，光强2000lux，连续光照，3天后种子陆续萌发。
1.2诱导子叶出丛生苗
外植体处理：挑选发芽3天后子叶展开，色绿的幼苗，于子叶柄处切开，子叶上留2mm左右的子叶柄。
诱导丛生苗培养基：MS+2.0mg/L BA+0.1mg/L NAA
培养：25℃，光强2000lux，16h光照，3-7天后有子叶柄上有数个直径1mm左右的深绿色突起出现，两周后于突起上长出丛生苗(见图1)。
1.3试管苗的继代培养和诱导生根
苗的挑选：把健壮、高1cm左右的丛生苗分成单株，苗下端带少量愈伤组织.
苗的培养：培养基为MS+1.0mg/L BA+0.5mg/L IAA，培养条件为25℃，光强2000lux，16h光照，20天继代一次。
壮苗培养：培养基为MS+1.0mg/L BA+0.2mg/L IAA+200mg/L水解酪蛋白+60mg/L KCl，培养条件同上。
抑制玻璃化：提高琼脂浓度到0.9-1.1％；添加活性碳0.2-0.4％；延长光照到19h。
诱根培养：培养基用1/2MS+0.5mg/L IAA+0.5mg/L NAA+30mg/LKCl，16h光照，10天后插入培养基的苗下端出现4-7条直径为0.5-1.5mm、长0.5-2.0cm的实生根。
实施例2：建立水母雪莲转化体系
2.1转化准备实验1-确定发根农杆菌菌种：
农杆菌菌种的确定：用烟草测试发根农杆菌LBA9402，R1601，R1000的感染效果，发现R1601的毒性最强，被其感染的烟草叶片出发根所用时间最短，所诱导的发根有典型的发根形态特征(抗卡那霉素50mg/l，纤细，多根毛、向地性弱，沿瓶壁生长，斜向次生根)，而且已有同科植物青蒿被R1601以90％的频率诱导得到发根，因此我们确定使用发根农杆菌R1601感染水母雪莲。
2.2转化准备实验2--确定Km筛选压
丛生苗在附加有一定浓度(20，40，60，80，100mg/L)Km的保持培养基中培养，4周后所有的苗都表现出黄化和生长受抑制现象，其中卡那霉素60mg/L可以在30天1内完全杀死水母雪莲幼苗。所以，确定50mg/L为Km筛选压浓度。
2.3 R1601工程菌液的制备
R1601工程菌液的制备：在含100mg/L Km的YEB保持平板上挑单菌落接种于5ml含100mg/L Km的液体YEB，于恒温摇床上29℃，180r/min培养24h，4℃保存菌液。感染前取100μl保存菌液加入5ml新鲜含100mg/L Km的液体YEB中，培养条件同上，在600nm波长下测定培养一定时间菌液的OD值，做该条件下R1601的生长曲线(见图5)，确定第二次活化的R1601菌液达到生长对数期所需的培养时间为9h左右。达对数生长期的R1601二次活化菌液用液体无激素MS(PH5.2)稀释数倍，添加50μmol/L乙酰丁香酮和250mg/L脯氨酸，室温诱导0.5-1h，作为工程菌液备用。
2.4外植体预培养：
叶片切段培养于MS+1.0mg/L2，4-D+0.2mg/L BA+0.5mg/LAgNO3，暗培养2-4天。
2.5感染：
预培养后叶片切段浸泡于备用的工程菌液3-10min。
2.6共培养：
取出感染后的叶片用无菌吸水纸吸去多余的菌液，放回原培养基，暗培养1-2天。
2.7除菌：
当共培养的叶片周围出现明显菌斑时取出叶片用无菌水清洗4-6次，然后用液体无激素MS+500mg/L Cef培养基浸泡20-45min，其间轻微摇动。
2.8诱导毛根：
除菌后叶片培养于含20mg/L蔗糖的1/2MS+0.5mg/L GA3+500mg/L Cef，光照培养3-5天，然后进行弱光培养诱导发根，5-7天更换一次培养基。7-15天后有发根于叶片切口处出现。
实施例3：毛状根的筛选
延迟筛选：把长出发根的叶片接入含20mg/L蔗糖的1/2MS+500mg/LCef+0.5-1.0mg/L IAA+0.5mg/L NAA+0.5mg/L GA3的延迟筛选培养基，保持弱光培养5-8天，以促进发根的诱导和生长。
Km筛选：切下所有根的1.0-2.5cm长的根尖接入含20mg/L蔗糖的1/2MS+300mg/L Cef+50mg/L Km的筛选培养基，弱光培养，10天以后切取抗Km根系的1.0-2.5cm根尖进行液体培养。
实施例4：毛状根的检测
甘露碱的纸层析检测(见图3)
4.1材料样品：新诱导出的水母雪莲发根(NTR)；经过继代培养的发根(TR)；水母雪莲的器官根(NR)、叶片或愈伤细胞(L/C)；R1601菌液(AR)
4.2试剂：
1.提取液：0.1M HCl
2.标准品：1mg/ml精氨酸水溶液；1mg/ml甘露碱水溶液
3.展层系统：正丁醇∶乙酸∶水＝9∶2∶5
4.显色液：
0.2％AgNO3丙酮液
1％NaOH甲醇液
5％硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)水溶液
4.3操作：
1.农杆碱的提取：取1g样品加1ml 0.1N HCl研磨，12,000rpm 5min，取上清液10μl点样。
2.层析：
层析滤纸的制备：将层析滤纸裁成8×8(cm×cm)规格，浸泡于0.4MHCl溶液中24h，然后用蒸馏水淋洗，再依次用乙醇、乙醚洗涤后，平放在托盘上，30℃下凉干，备用。
样品点样：距边1-1.5cm处划一直线，铅笔标记出等距离的点样点。以微量进样器点上5μl样品，边滴加边吹干。
层析展开：干燥滤纸垂直置入密闭的已饱和层析罐，待液体上限距上边缘2-4cm时取出。
3.显色：
将滤纸吹干后，浸入0.2％AgNO3丙酮液1min，取出风干；然后浸入1％NaOH甲醇液2～3min；最后5％硫代硫酸钠液固定；观察并摄影。
实施例5：水母雪莲毛状根RolB基因的PCR检测
5.1材料样品：R1601菌体；水母雪莲的叶片外植体(Leaf)；继代后扩大培养的水母雪莲发根(Hr)。
5.2试剂：
1.R1601质粒提取试剂：
STE：0.1mol/L NaCl 10mol/L Tris-HCl(pH8.0) 1mmol/LEDTA(pH8.0)；
Solution I：4mg/ml溶菌酶，50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris-HCl pH8.0；
Solution II：3％SDS，0.2mol/L NaOH；
Solution III：5mol/L NaAC 60ml，冰乙酸11.5ml，超纯水28.5ml，pH4.8；
TE buffer：1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl pH8.0；
2.雪莲基因组DNA提取试剂：
2×CTAB：2％CTAB，100mmol/L Tris-HCl pH8.0，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA pH8.0，室温下放置；
Rnase：使用前，在100℃下处理10min彻底使残留的Dnase失活，用高压灭菌过的超纯水配成200μg/ml，备用。
5.3操作
1.R1601质粒的提取：
1)挑取R1601单菌落于10mlYEB培养基中，28℃，180rpm，过夜培养。
2)吸取8ml培养好的菌液，加入l0ml离心管中，4,000rpm，离心5min。倾去培养液，加入2ml预冷的STE，重新悬浮细胞。分别吸取1ml菌悬液，加入1.5mlEppendorf管中，12,000rpm离心2min，倾去培养液，获得适量的菌体细胞。
3)加入200μl冰浴过的Solution I，涡旋振荡使细胞均匀分布，室温下放置10min。
4)加入400μl新鲜配置好的Solution II，轻轻颠倒混匀，冰与5min。
5)加入300μl Solution III，反复颠倒数次，使溶液在粘稠的菌体裂解物中分散均匀，然后置冰上5min；
6)12,000rpm离心10min，小心吸取上清液加入1.5mlEppendorf管中。
7)加入等体积的饱和酚：氯仿，通过剧烈振荡混合有机相和水相，12,000rpm离心5min。
8)小心吸取上清液加入一新的1.5mlEppendorf管中，用等体积的氯仿重新抽提一次；
9)小心吸取上清液加入一新的1.5mlEppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/LnaAC，冰浴30min，12,000rpm，离心10min。倾去上清液，倒置在吸水纸上，使溶液流尽。
10)加入1ml70％乙醇洗涤两次，12,000rpm离心5min，收集沉淀；
11)倾去洗涤液，倒置于吸水纸上吸干残余的溶液，在超净工作台上吹干。
12)加入50μlTE重悬，备用。
2.CTAB法提取水母雪莲基因组DNA：
1)取280mg经继代培养的水母雪莲的毛状根在液氮中充分研磨至粉状；
2)用药匙小心转移至1.5mlEppendorff管中，加入65℃预热的600μl 2×CTAB，在65℃下水浴60min，每隔5-10min轻轻振荡一次；
3)取出Eppendorff管冷却至室温，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀后，12,000rpm，离心10min；
4)用一只剪去前端的枪头，小心将上清液移入一只新的Eppendorf管中，并加入两倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，即见到丝状沉淀，-20℃下放置30min，10,000rpm离心5min，得到淡黄色的沉淀；
5)倾去上清液，并用吸水纸吸净残余溶液，加入300μl超纯水重新溶解，在加入600μl-20℃预冷的无水乙醇，沉淀过夜；
6)12,000rpm，离心10min，得到白色的胶状沉淀。倾去上清液，并用吸水纸吸净残余溶液，加入800μl 70％乙醇洗涤沉淀2～3次；
7)吸净残余溶液，置超净工作台中吹干(约需10～15min)；
8)加入40～60μl超纯水，溶解沉淀，加入3μlRnase，室温放置30min后，于-20℃下保存。
3.PCR检测：
PCR引物根据Slightom等RiA4baTL-DNA序列分析结果设计RolB基因的上下游引物：
Primer1
5’TACTGCAGCAGGCTTCATGCA 3’
Primer2
2 5’GCTTTCCCGACCAGAGACTG 3
因为RolB基因存在于Ri质粒的TL-DNA中，而且该基因在发根农杆菌感染植物产生毛状根表型中起到关键性作用，如果能够从水母雪莲毛状根中扩增出862bp的条带，而对照未受感染的水母雪莲外植体中不能扩出该条带，就可以证明R1601质粒的TL-DNA已经整合在了水母雪莲的基因组内。
1)P C R反应体系：
PCR反应体系： 单位μl
10×PCR buffer： 2.5
dNTP 0.5
K62358 0.5
K62359 0.5
Model 1
Taq酶 1U
H2O 20
2)P C R反应条件：
1.94℃，预变性，4min；
2.94℃，热变性，1min；55℃，退火，1min；72℃，延伸，1min；35cycles；
3.72℃，延伸，5min。
4.结果分析：(见图4)1为R1601菌体；2为水母雪莲的叶片外植体(Leaf)；3为继代后扩大培养的水母雪莲发根(Hr)。
实施例6：水母雪莲毛状根的培养
材料：选择抗Km且甘露碱检测显阳性的发根根系，切下长2.0--4.0cm根尖部分。
培养基：液体N6培养基，如果有菌再生则加入Cef200-500mg/L。
培养条件：40ml培养基分装于100ml三角瓶，弱光或暗培养条件下，于摇床上以50-80rpm/min震荡培养，25天继代一次(见图2)。
培养优化：蔗糖30mg/L，GA3 0.5mg/L，AgNO3 0.5-1.0mg/L，有利于发状根的生长和多糖积累，一个周期的生长量(鲜重)为接种量的10-15倍。
实施例7：雪莲毛状根多糖类化合物的分离提取工艺
取雪莲毛状根培养物于空气循环干燥器60℃烘干后，以粉碎机粉碎成20目的粗粉，用石油醚进行脱色、脱脂。然后以1∶30(g∶ml)的比例加入蒸馏水，98℃水浴中连续加热浸提15h。反复提取至无水溶性多糖为止，过程中用Molisch反应检测提取的完全程度。同理用0.5MNaOH溶液在98℃水浴中继续浸提5h，反复提取至无碱溶性多糖为止，过程中用Molisch反应检测提取的完全程度。将所得两部分滤液分别减压浓缩至原体积的1/5，加入等体积的Sevag试剂(氯仿∶正丁醇＝5∶1)去除游离的蛋白。再加入4％活性炭(w/v)，60℃下水浴脱色1小时。先后加入7倍体积的无水乙醇、丙酮反复沉淀，离心。低温真空干燥，得到总多糖。多糖含量用α-萘酚-----浓硫酸法测定。
实验证明在液体悬浮培养条件下，用本发明提供的细胞系和培养基，其细胞生长速率可达18～25g干重/升，多糖类化合物的含量可达培养物干重的5～10％，其中水溶性多糖：2.453％；碱溶性多糖：3.391％(多糖测定的标准曲线见图6)。
Claims (3)
1.一种培育水母雪莲毛状根生产雪莲多糖类化合物的方法，其特征在于：
1)萌发水母雪莲的无菌种子，取其萌发3天苗龄的绿色子叶，取子叶柄置于诱导丛生苗培养基上进行培养，诱导培养获得丛生苗；丛生苗先后置于苗生长培养基和壮苗培养基上，进行单株培养；单株移置于诱根培养基培养，获得的苗下端长有实生根；叶片切段为外植体置于预培养培养基上暗培养，经发根农杆菌R1601的介导进行转化，其外植体于弱光培养诱导发根，毛状根出现的叶片先后接入延迟筛选培养基和筛选培养基上再培养，选择抗Km且甘露碱检测显阳性的发根根系，切取根尖1-2cm用于进行液体扩大培养，
其中所述的诱导丛生苗培养基进行培养是指用MS+2.0mg/L BA+0.1mg/L NAA培养基，在25℃，光强2000lux，16h光照下培养；
其中所述的苗生长培养基为MS+1.0mg/L BA+0.5mg/L IAA，和壮苗培养基为MS+1.0mg/L BA+0.2mg/L IAA+200mg/L水解酪蛋白+60mg/L KCl，进行单株培养的培养条件为25℃，光强2000lux，16h光照，20天继代一次；
其中所述的诱根培养基为1/2 MS+1.0mg/L IAA+0.5mg/L NAA+60mg/L KCl的培养基，培养10天后出现4-7条直径为0.5-1.5mm、长0.5-2.0cm的实生根；
其中叶片切段为外植体置于预培养培养基上暗培养是指在预培养培养基为MS+1.0mg/L 2，4-D+0.2mg/L BA+0.5mg/L AgNO3上暗培养2-4天；
其中所述的发根农杆菌R1601介导的转化是指在MS+1.0mg/L 2，4-D+0.2mg/L BA+1.5mg/L AgNO3中暗培养2-4天的叶片切段为外植体，经在50μmol/L乙酰丁香酮和250mg/L脯氨酸培养过的发根农杆菌R1601介导，进行转化；
其中所述的培养诱导发根是指除菌后叶片培养于含蔗糖20mg/L的1/2MS+0.5mg/L GA3+500mg/L Cef，光照培养3-5天，然后进行弱光培养诱导发根；
其中延迟筛选培养基为含蔗糖20mg/L的1/2MS+500mg/LCef+0.5-1.0mg/L IAA+0.5mg/L NAA+0.5mg/L GA3，筛选培养基为含蔗糖20mg/L的1/2MS+300mg/L Cef+50mg/L Km；
其中液体扩大培养采用液体N6培养基；
2)取雪莲毛状根培养物于空气循环干燥器60℃烘干，干粉以粉碎机粉碎成20目的粗粉，用石油醚进行脱色、脱脂，然后，加入蒸馏水连续加热浸提，真空抽滤，滤液4℃保存；滤渣中再加入0.5M的NaOH溶液继续加热浸提，真空抽滤，滤液4℃保存；对滤液进行多糖类化合物的提取。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于有菌再生时，液体N6培养基中添加Cef 200-500mg/L。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于所述液体扩大培养采用液体N6培养基中添加：蔗糖30mg/L，GA30.5mg/L，AgNO30.5-1.0mg/L。
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