KR101465232B1 - 멜라토닌 또는 아민류의 함량이 증가된 형질전환된 식물체 및 이를 이용한 멜라토닌 또는 아민류의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 멜라토닌 또는 아민류의 함량이 증가된 형질전환된 식물체 및 식물체에 있어서 멜라토닌 또는 아민류의 함량 증가 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 본 발명의 형질전환 식물체는 증가된 멜라토닌 등의 함량을 가지며, 식물에서 멜라토닌 또는 하이드록시트립토판, 트립타민, 세로토닌 또는 아세틸세로토닌과 같은 아민류를 손쉽게 다량 생산할 수 있다. 따라서 식물을 섭취하는 것만으로도 멜라토닌 등의 화합물의 섭취가 손쉬우며, 또한 항산화 효능을 가지는 식품 또는 의약 제조 등에 활용할 수 있으며, 또한 벼의 멜라토닌 함량을 증가시킴으로써 쌀 이용성 증대에 기여할 수 있다.

Description

멜라토닌 또는 아민류의 함량이 증가된 형질전환된 식물체 및 이를 이용한 멜라토닌 또는 아민류의 생산방법{Transformed plants enriched with melatonin or amines, and a method for increaseing melatonin or amines of plants}

본 발명은 멜라토닌 또는 아민류의 함량이 증가된 형질전환된 식물체 및 식물체에 있어서 멜라토닌 또는 아민류의 함량 증가 방법에 관한 것이다.

멜라토닌(N-acetyl-5-methoxytryptamine)은 1958년 소의 송과선((pineal gland)에서 최초로 분리된 이래(Lerner et al., J. Am . Soc. 80, 2587, 1958), 박테리아, 조류를 포함한 모든 동·식물에서 발견되는 물질이다(Herdeland & Poeggeler, J. Peneal Res . 34, 233-241, 2003). 동물에서는 뇌의 송과선에서 생합성되어 혈액에 배출되며, 24시간 주기리듬(circadian rhythm), 계절적 리듬(seasonal rhythm) 및 광주기(photoperiodism) 조절에 관여하는 호르몬으로 역할을 한다(Reiter, Experientia 49, 654-664, 1993). 그 외 면역증강(Carrillo-Vocp et al., Endocrine 27, 189-200, 2005), 항염증 반응(Jung et al., J. Pineal Res . 48, 239-250, 2010), 및 미토콘드리아의 항상성을 유지하는데 관여한다(Paradies et al., J. Pineal Res . 48, 297-310, 2010). 특히 멜라토닌은 트립토판 유도체로 적은 분자량(232 g/mol)으로서 특이하게 친수/친유성 특성(amphiphilic molecule)을 가지고 있어(shida et al., J. Pineal Res . 16, 198-201, 1994; Ceraulo et al., J. Pineal Res . 26, 108-112, 1999), 세포막을 자유롭게 왕래하며, 세포의 모든 기관에 존재하는 것으로 알려져 있다(Herdeland, Biofactors 35, 183-192, 2009).

지난 50년간 멜라토닌 관련 주제로 22,800건의 논문이 발표되었으며, 최근 들어 더욱 증가되고 있는 추세이다(Galano et al., J. Pineal Res , 51, 1-16, 2011). 최근 멜라토닌의 기능으로서 주목받고 있는 분야가 멜라토닌의 항산화 활성 능력이다. 멜라토닌의 항산화 활성은 1993년 최초로 보고된 이래(Tan et al., Endocr. R. 1, 57-60, 1993), 지난 20년간 총 3700편의 논문이 이에 관련된 논문으로서 계속 증대되고 있다. 이처럼 많은 관심을 받고 있는 멜라토닌은 다양한 종류의 활성산소(reactive oxygen species; ROS)와 활성질소(reactive nitrogen species; RNS)을 효과적으로 소거함으로서, 생명체를 산화스트레스로부터 보호하는 역할을 한다(Galano et al., J. Pineal Res . 51, 1-16, 2011). 이같은 멜라토닌의 항산화활성은 멜라토닌의 호르몬 기능과는 달리, 멜라토닌 수용체가 필요하지 않고 직접적으로 작용하는 것으로 알려져 있다.

식물에서 멜라토닌은 1995년 최초로 단자엽 및 쌍자엽 식물에서 동정되었으며(Hattori et al., Biochem . Mol . Biol . Int . 35, 627-634, 1995; Dubbels et al., J. Pineal. Res. 18, 28-31, 1995), 멜라토닌 함량은 조직에 따라 상이하지만, 수 pg에서 ㎍으로 존재한다. 예를 들면 딸기에서는 0.13 ng/g tissue, St John's Wort 경우는 7㎍/g tissue 정도 검출되었다(Paredes et al., J. Exp. Bot. 60, 57-69, 2009). 이 같은 양은 일반적으로 식물체에서 기질인 세로토닌 함량에 비해 멜라토닌이 1000배 정도 낮은 함량을 보여준다. 이는 세로토닌에서 멜라토닌으로 생합성되는 효소의 활성이 매우 낮음을 시사한다(Kang et al., Plant Physiol. 150, 1380-1393, 2009; Kang et al,, J. Pineal Res . 49, 176-182, 2010). 식물에서 멜라토닌 생합성 유전자는 최근 벼에서 모두 클로닝되었다(Da Luca et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86, 2582-2586, 1989; Kang et al., Planta 227, 263-272, 2007; Fujiwara et al., J. Biol . Chem . 285, 11308-11313, 2007; Kang et al., J. Pineal Res . 50, 304-309, 2011; Kang et al., J. Pineal Res. in press doi:10.1111/jpi.12011). 비록 식물에서 멜라토닌 생합성 유전자가 모두 클로닝되었고, 이들 유전자를 암호화하는 효소의 특성이 규명되었지만, 아직까지 이들 유전자를 이용하여 식물체에서 멜라토닌을 과다생성하는 식물체를 육성한 연구결과는 없다.

다만 동물의 멜라토닌 생합성유전자인 세로토닌 N-아세틸트랜스퍼라제 (serotonin N-acetyltransferase) 유전자를 벼에 형질전환하여 멜라토닌 함량을 조사한 결과, 형질전환하지 않은 대조구 벼에 비해 멜라토닌의 함량차이가 크게 증대되지 않았으며(Kang et al., J. Pineal Res. 49, 176-182, 2010), 이는 세로토닌 N-아세틸트랜스퍼라제(serotonin N-acetyltransferase) 유전자가 멜라토닌 함량을 증대하는 제한효소(rate-limiting enzyme)로 작동하지 않음을 시사한다. 또한 식물의 멜라토닌 생합성유전자인 트립타민 5-하이드록실라제(tryptamine 5-hydroxylase) 유전자를 벼에 과다발현하였을 경우에는 오히려 형질전환하지 않은 대조구보다 멜라토닌 생성량이 감소하는 결과를 보여주었다(Park et al., J. Pineal Res. in press doi:10.1111/jpi.12053).

따라서 식물의 멜라토닌 생합성 유전자의 효소특성이 규명되었다고 하더라도, 실제적으로 이들 유전자를 이용하는 것이 식물체에서 목적하는 멜라토닌 및 멜라토닌 관련 화합물을 과량으로 생산할 수 있는지는 당업자가 용이하게 예측할 수 없는 문제점이 있다. 이는 식물체를 생합성 유전자를 추가 발현하도록 형질전환하더라도 발현된 단백질이 기질과 효율적으로 반응하거나, 또는 다양한 원인으로 식물 세포 내에서 존재하는 여러 가지 프로테아제에 의하여 단백질이 분해되어 생산수율에 영향을 미치지 않을 가능성이 있기 때문이다.

이에 본 발명자들은 식물체에서 멜라토닌 및 이와 관련된 아민류의 함량 증가를 위해서 예의 노력한 결과, 식물의 멜라토닌 생합성과 관련된 효소를 암호화하는 유전자로 식물체를 형질전환시켜 이러한 형질전환된 식물체에서 멜라토닌 및 멜라토닌과 관련된 아민류 화합물이 과량 생합성되는 것을 발견하고서, 본 발명을 완성하였다.

한국특허공개공보 제2005-0005723호(2006년 5월 18일 공개) 미국특허공개공보 제2010-0077504호(2010년 03월 25일 공개) 한국특허공개공보 제2008-0078412호(2008년 08월 27일 공개)

본 발명의 일 목적은 멜라토닌 또는 아민류의 함량이 증가된 형질전환된 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 식물체의 멜라토닌 또는 아민류의 함량의 증대 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 목적을 해결하기 위해, 본 발명은 트립토판 디카복실라아제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

상기 트립토판 디카복실라아제를 암호화하는 유전자는 서열번호 1로 이루어지는 TDC1, 서열번호 2로 이루어지는 TDC2, 또는 서열번호 3으로 이루어지는 TDC3 중 어느 하나일 수 있다. 상기 재조합 벡터는 도 2에 도시된 유전자 지도를 포함할 수 있다.

상기 식물체는 보리, 평지, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 잔디, 마초, 사탕수수, 기장, 라이그래스, 오챠드그래스 및 벼로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호 3으로 이루어지는 TDC3을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 멜라토닌 함량이 증가된 벼 식물체의 종자를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 해결하기 위해, 본 발명은 트립토판 디카복실라아제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물체의 멜라토닌 또는 아민류의 함량의 증대 방법을 제공한다. 상기 트립토판 디카복실라아제를 암호화하는 유전자는 화본과(Poaceae)유래 유전자일 수 있으며, 바람직하게는 벼(Oryza sativa) 유래 트립토판 디카복실라아제 유전자일 수 있다. 또한 더욱 바람직하게는 트립토판 디카복실라아제를 암호화하는 유전자는 서열번호 1로 이루어지는 TDC1, 서열번호 2로 이루어지는 TDC2, 또는 서열번호 3으로 이루어지는 TDC3 중 어느 하나일 수 있다.

상기 아민류는 하이드록시 트립토판, 트립타민, 세로토닌 또는 아세틸세로토닌 중 선택되는 어느 하나이상일 수 있다.

상기 멜라토닌 또는 아민류의 함량의 증대방법에 있어서, 상기 식물체는 단자엽식물 또는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 한다. 상기 단자엽식물은 보리, 평지, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 잔디, 마초, 사탕수수, 기장, 라이그래스, 오챠드그래스 및 벼로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 상기 쌍자엽 식물은 대두, 담배, 바나나, 및 목화로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

또한 본 발명은 벼 식물체를 서열번호 3으로 이루어지는 TDC3을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하는 단계를 포함하는 멜라토닌 함량이 증가된 벼 식물체의 종자의 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

먼저 본 발명에서 용어 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 의미하며, " 바이너리 벡터"는 식물세포에서 목적 유전자를 과다발현시킬 수 있는 벡터로, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다.

용어 "프로모터"는 구조 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사개시부위에 인접하는, 유전자의 5' 비-코딩 부위에 위치한다. 용어" 작동가능하게 연결"은 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 발현조절 서열과 결합되어 그의 기능 도는 발현이 상기 발현 조절 서열에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 이와 같이 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드와 발현 조절 서열은 프로모터, 전사종결부위, 선택마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 벡터 내에 포함될 수 있다.

또한 본 발명의 "식물체"는 식물, 식물의 조직, 세포 및 종자로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따라, 트립토판 디카복실라아제(trypophan decarboxylase)를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어, 멜라토닌 또는 아민류의 함량이 증가된 식물체가 제공된다.

상기 트립토판 디카복실라아제를 암호화하는 유전자(TDC)는 식물에서 멜라토닌 생합성의 첫째 효소를 암호화하는 유전자로서 트립토판으로부터 트립타민을 합성할 수 있는 식물 유래효소이다.

본 발명에 있어서, 상기 식물체를 형질전환하는 데 이용하는 트립토판 디카복실라아제를 암호화하는 유전자(TDC)는 화본과(Poaceae)유래의 TDC, 바람직하게는 벼 유래의 TDC 인것을 특징으로 하나, 이에 한정되지는 않는다. 더욱 바람직하게는 상기 TDC는 상기 3종의 TDC 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 TDC1, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 TDC2, 서열번호 3의 염기서열을 갖는 TDC3 중 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 TDC1, TDC2, 및 TDC3는 기 보고된 TDC1(GenBank AK069031) 및 TDC2(GenBank AK102353)(Kang et al., Planta. 227, 263-272, 2007)와 TDC3(GenBank NM001067504)(Kanjanaphachoat et al., Plant Mol. Biol. 78:525-543, 2012) 염기서열을 갖는다. 본 발명의 일실시예에서 TDC 유전자로 TDC1, TDC2, TDC3를 사용하여 재조합 벡터를 제조하여, 식물체를 형질전환시켰다. 본 발명의 일실시예에 사용된 상기 3종의 TDC 유전자는 다음과 같은 방법으로 클로닝되었다. 상기 벼 유래의 3종의 TDC 유전자 중에서 , TDC1(GenBank AK069031) 및 TDC2(GenBank AK103253) 유전자는 일본 농업 생물자원연구소에서 전장 cDNA 유전자를 분양받아 본 실험에 사용하였다. TDC3 유전자는 벼 게놈 서열로부터 추정된 정보(Jensen & Møller, Phytochem. 71, 132-141, 2010)에 기초하여 RT-PCR(역전사 중합효소 연쇄반응, reverse transcription-polymerase chain reacion)으로 전장 유전자길이의 TDC3(서열번호 3)을 클로닝하였다.

본 발명의 식물체를 형질전환시키는데, 사용되는 TDC를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려진 벡터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 공지의 식물 발현용 벡터인 바이너리 벡터를 기본 벡터로 하여 제조될 수 있다. 단자엽식물, 특히 벼의 형질전환시 널리 사용되는 바이너리 벡터의 종류는 매우 다양하며, 거의 모든 바이너리 벡터가 CAMBIA(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)와 같은 국제센터 및 대학연구소에서 입수가능하며, 기본적인 바이너리 벡터의 골격은 Ti 플라스미드를 모체로 하여 유전자가 전달되는 좌측 및 우측경계 부위에 형질전환체 선별 표지 유전자, 프로모터, 전사종결부위 유전자 등을 다양하게 변형시켜 사용하고 있다.

본 발명에서 사용되는 재조합 벡터는 TDC를 암호화하는 유전자, 상기 유전자에 작동가능하게 연결된 식물 특이적 발현을 조절하는 프로모터 및 선별 표지 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 식물 특이적 발현을 조절하는 프로모터는 옥수수 유비퀴틴 프로모터(ubiquitin promoter)를 사용하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 트립토판 디카복실라아제의 과발현을 가능하게 해주는 프로모터는 모두 가능하다. 또한, 상기 선별 표지 유전자는 항생제 저항성 유전자인 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 사용하지만 그것에 한정되는 것이 아니다. 본 발명의 실시예에서는 당업계에서 공지인 분자생물학적 기법을 사용하여, 공지의 바이너리 벡터 pGA1611 및 pIPKb002를 사용하여, 벼 유래 TDC 전장 cDNA를 삽입한 바이너리 벡터 pGA1611:TDC1, pGA1611:TDC2, 및 pIPKb002:TDC3를 제조하여 사용하였다(도 2 참조).

상기 TDC를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 식물로의 도입은 당업계에 공지된 통상적인 형질 전환 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 식물에 대한 형질전환은 아그로박테리움-매개 형질전환법을 이용할 수 있으며, 문헌 (Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985)에 예시된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면 벼에 대한 아그로박테리움-매개 형질전환법은 당업계의 문헌(An et al., EMBO J 4:227-288, 1985) 등에 공지되어 있다. 형질전환용 숙주로 아그로박테리움은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 등이 사용된다. 본 발명의 일실시예에서는 상기의 바이너리 벡터 pGA1611:TDC1, pGA1611:TDC2, 및 pIPKb002:TDC3 를 공지의 동결융해법(An, Methods Enzymol 153: 292-305, 1987)을 통해 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404(Cat. NO. 18313-015, GibcoBRL, 미국)에 도입시켜, 이를 이용하여 벼의 배반으로부터 유도된 캘러스에 형질전환 시켜 형질전환체를 얻었다.

형질전환된 식물 세포들의 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 식물체로 재분화시킬 수 있다. 상기와 같은 방법으로 형질전환될 수 있는 식물은 보리, 평지, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 잔디, 마초, 사탕수수, 기장, 라이그래스, 오챠드그래스 및 벼와 같은 단자엽 식물 및 대두, 담배, 바나나 및 목화와 같은 쌍자엽 식물 모두를 포함할 수 있다. 특히, 식용 가능한 식물체를 형질전환시켜 TDC3 의 과다발현에 의한 멜라토닌, 아세틸세로토닌, 및 하이드록시트립토판등이 합성되는 경우 식물체 자체를 직접 섭취함으로써 항암 효과, 항산화 효과 및 퇴행성질환 방지 효과를 직접 얻을 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 형질전환된 식물세포를 50 μg/ ml 하이그로마이신을 함유하는 선별 배지에서 배양시킨 후, 생존한 하이그로마이신 저항성 캘러스로부터 잎을 유도하기 위해 재분화 배지로 옮겨 일정시간 배양시킴으로써 캘러스가 신초(shoot)로 재분화되었다. 이후, 재분화 신초를 뿌리 유도배지로 옮기고 배양시켜 완전한 TDC 과다발현 식물체를 획득하였다(Lee et al., Plant Cell Physiol, 41, 743-749, 2000).

본 발명의 일 실시예에서는 벼 TDC1, 2, 3 유전자가 벼의 조직별로 어떻게 발현되는지를 평가하기 위해, 포장에서 자라는 12 주된 벼로부터, 꽃, 잎, 뿌리를 채취하여, 총 RNA를 추출하여 RT-PCR 방법을 수행한 결과, TDC1, TDC2 는 모든 조직에서 항상발현되는 것으로 나타났으며, TDC2 의 발현이 상대적으로 높게 발현됨을 알 수 있었다. 이에 비해 TDC3 유전자는 잎과 뿌리에서는 거의 발현되지 않았으나, 꽃 부위에서 주로 발현됨을 확인하였다. 이는 TDC3 유전자의 발현이 화기조직 특이적으로 발현됨을 보여 주고 있다(도 1A 참조). TDC1 과 TDC3 유전자의 아미노산 동질성은 84%로 매우 높지만(도 1B 참조), mRNA 발현은 매우 상이함을 보여 주었다.

벼 유래 TDC1 과 TDC2 유전자를 과다발현하는 형질전환 벼는 T4 세대를 이용하였으며(Kang et al., Planta, 227:263-272, 2007), TDC3 유전자를 과다발현하는 형질전환벼는 pIPKb002:TDC3 바이너리벡터를 이용하여 새롭게 형질전환한 동질 T2 세대 벼를 이용하였다(도 2 의 A 참조). 또한, 각각의 형질전환벼에서 TDC 유전자가 특이적으로 발현되는지 여부를 확인하기 위하여, RT-PCR 분석을 수행한 결과, 형질전환 벼에서 TDC 유전자가 각각 과다발현됨을 확인하였다(도 2의 B 참조).

다음으로, 형질전환 식물체 내에서 과다발현된 TDC mRNA 들이 멜라토닌 생합성과 관련이 있는지를 확인하기 위해, 7 일간 1/2 MS 배지에서 키운, 유묘에서 멜라토닌 함량을 측정한 결과, 벼 TDC3 유전자가 도입된 형질전환벼에서 야생형 대조구(WT)보다 높은 양의 멜라토닌이 생성됨을 확인하였다.(도 3 참조).

본 발병의 일실시예에서는 벼 TDC 유전자가 과다발현된 형질전환 유묘에서 멜라토닌 이외의 아민류 화합물의 합성 정도를 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 통하여 분석하였다. 트립토판은 TDC1 및 TDC2 형질전환 벼에서 대조구보다 높게 나타났으며, 트립타민 및 세로토닌은 TDC3 형질전환벼에서 대조구에 비해 매우 높게 생합성되었고, 아세틸세로토닌은 모든 TDC1, TDC2, TDC3 형질전환벼에서 대조구에 비해 약간 높게 합성되었다(도 4 참고).

종자에서 멜라토닌 및 아민류 함량을 정량하여 보았다. 유묘에서 와같이, 다량의 세로토닌의 TDC3 형질전환벼의 종자에서 검출되었으며, 트립타민 및 하이드록시트립토판 모두 TDC3 형질전환벼에서만 대조구에 비해 높게 합성되었다. 이에 비해 트립토판 함량은 TDC3 형질전환 종자에서 대조구, TDC1, TDC2 보다 적게 검출되었다(도 5 참고). 아세틸세로토닌 함량은 오직 TDC3 형질전환종자에서 대조구에 9 배 이상 높게 생합성되었고, 멜라토닌 함량은 TDC1 형질전환종자에서 대조구보다 약간 높은 g 종자당 0.16 ng 생합성되었고, TDC2 형질전환종자는 대조구와 유의한 차이를 보이지 않았다. 이에 비해 TDC3 형질전환벼종자는 대조구에 비해 무려 60배 높은 멜라토닌이 생합성되어, g 종자당 6 ng 정도의 멜라토닌이 생합성 되었다(도 6 참조). 상기 결과는 TDC3 유전자가 멜라토닌 생합성의 조절생합성 유전자로 작용하고 있음을 보여 준다. 이러한 TDC3 유전자의 특징은 본 발명자들이 최초로 제시하는 것이다.

본 발명의 다른 구현예는 서열번호 3으로 이루어지는 TDC3을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 멜라토닌 함량이 증가된 벼 식물체의 종자 및 상기 서열번호 3으로 이루어지는 TDC3을 포함하는 재조합 벡터로 벼 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는 멜라토닌 함량이 증가된 벼 식물체 종자의 제조방법을 제공한다. 상기와 같이, 본 발명자들은 형질전환벼 내에서 과다 발현된 TDC3 효소가 높은 량의 멜라토닌을 합성하는 것을 최초로 규명하였다. TDC3 형질전환 유묘에서 멜라토닌이 종자보다 적게 생합성되는 것은 벼의 잎에서 멜라토닌이 빠르게 분해되는 것으로 추정되지만, 아직까지 구체적인 연구결과는 없는 실정이다. 벼에서는 그램 조직당 0.04ng 정도의 멜라토닌이 존재하는 것으로 보고되어 있으며(Part et al., J. Pineal Res. 52:211-216, 2012; Byeon et al., J Pineal Res. 53:107-111, 2012), 절취한 벼 잎이 노화시 멜라토닌 생합성이 유도 생합성되는 특징을 가지고 있는 것으로 보고되었지만, 벼 종자내에서 멜라토닌 함량이 증대된 연구결과는 없는 상황이다.

또한 본 발명은 트립토판 디카복실라아제 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물체의 멜라토닌 또는 아민류의 함량 증가용 조성물을 제공한다. 상기 식물체의 멜라토닌 또는 아민류의 함량 증가용 조성물은 트립토판 디카복실라아를 암호화하는 유전자 및 상기 유전자를 과발현시키기 위한 프로모터가 삽입된 재조합 벡터, 또는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 조성물에 있어서, 상기 트립토판 디카복실라아제를 암호화하는 유전자는 화본과 유래, 바람직하게는 벼 유래일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 이루어지는 TDC1, 서열번호 2로 이루어지는 TDC2, 서열번호 3으로 이루어지는 TDC3 일 수 있다.

본 발명에 따르면, 식물에서 멜라토닌 또는 하이드록시트립토판, 트립타민, 세로토닌 또는 아세틸세로토닌과 같은 아민류를 손쉽게 다량 생산할 수 있다. 또한 본 발명의 형질전환 식물체는 증가된 멜라토닌 등의 함량을 가진다. 따라서 식물자체에서 생산되는 바, 식물을 섭취하는 것만으로도 멜라토닌 등의 화합물의 섭취가 손쉬우며, 또한 항산화 효능을 가지는 식품 또는 의약 제조 등에 활용할 수 있으며, 또한 벼의 멜라토닌 함량을 증가시킴으로써 쌀 이용성 증대에 기여할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 클로닝된 3종의 TDC 유전자들의 식물체 부위별 mRNA 발현 패턴과 이들 유전자간의 아미노산 동질성 정도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 3종의 TDC 유전자를 과다발현하는 바이너리 벡터의 모식도와(A), 이들 바이너리 벡터에 의해 형질전환된 형질전환벼에서 TDC 유전자의 mRNA 발현량 측정결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 TDC1, TDC2, TDC3 유전자가 과다발현되는 형질전환 벼의 유묘에서 측정한 멜라토닌 함량을 비교한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 TDC1, TDC2, TDC3 유전자가 과다발현되는 형질전환벼의 유묘에서 측정한 트립토판, 트립타민, 세로토닌, 및 아세틸세로토닌 함량을 비교한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 TDC1, TDC2, TDC3 유전자가 과다발현되는 형질전환 벼의 종자에서 측정한 트립토판, 5-하이드록시트립토판, 트립타민, 및 세로토닌 함량을 비교한 결과를 나타낸다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 TDC1, TDC2, TDC3 유전자가 과다발현되는 형질전환벼의 종자에서 측정한 아세틸세로토닌과 멜라토닌 함량을 비교한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 TDC1, TDC2, TDC3 유전자가 과다발현되는 형질전환벼의 유묘에서 측정한 멜라토닌 생합성 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 실시예들에 한정되지 않는다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.

< 실시예 1> 벼 TDC 유전자들의 조직별 발현 차이 및 아미노산 동질성 정도 비교

논의 자연환경에서 자라고 있는 12주 된 동진벼에서 꽃, 잎, 뿌리를 채취하여, 각각 TRI 시약(Molecular Research Center, Inc., 미국)을 처리하여 전체 RNA를 추출하였고, 상기 전체 RNA를 주형으로 RT-PCR 을 수행하였다. 우선 cDNA를 함성하기 위하여 역전사효소(reverse transcriptase) SuperScript Ⅱ (Invitrogen Inc., 미국)를 이용하였고, 프라이머는 올리고 dT를 사용하였다. 상기 벼 조직에서 나온 역전사효소 반응 산물을 주형으로 하여 TDC1, TDC2, TDC3 유전자를 PCR 반응으로 증폭하였다.

사용한 프라이머는 TDC1은 전방향 프라이머 5'-gcgagggtgaaaccttcca-3' (서열번호 4), 역방향 프라이머 5'-gcgagccggtggagtcc-3'(서열번호5)이고, TDC2는 전방향 프라이머 5'-gtgctgcctttaacattgttgg-3'(서열번호 6), 역방향 프라이머 5'-catgtcattggactttgctatctgt-c'(서열번호 7)이고, TDC3은 전방향 프라이머 5'-gacgtcgagcccttccgc-c'(서열번호 8), 역방향 프라이머 5'-accgtcagccgcgtgatg-c'(서열번호 9)이다. PCR 반응은 10ng의 주형 DNA, 2.5 ㎕ 10 X PCR buffer, 0.25mM dNTP, 1.5mM MgCl₂, 0.5μM의 각 프라이머쌍 및 1.25 units EXTaq polymerase(Takara, Japan)의 총 25 ㎕의 반응액을 수득한 후, 94℃ 1분, 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초, 35회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 최종 반응산물은 1.0%(w/v) 아가로즈 겔 전기영동에서 확인하였다(도 1 -A 참조).

3종의 TDC 유전자는 발현 양상이 서로 다름을 볼 수 있었고, TDC1은 항상 발현되나, TDC2에 비해 발현량이 적었으며, TDC2는 비교적 많은 량으로 항상 발현되었으며, 잎에 다량 발현되는 특징을 보였다. 이에 비해 TDC3 유전자는 잎과 뿌리에서는 검출이 되지 않았으며, 꽃 부위에서만 발현되는 특이한 양상을 보였다. 이는 TDC3 유전자가 화기와 관련된 부위에 특이적으로 다량 발현됨을 보여주며, 결론적으로 종자발달에 관여함을 추론할 수 있다. 벼에서 발현되는 3종의 TDC 유전자의 아미노산 동질성을 비교해 보면, TDC1 과 TDC3가 84% 정도의 높은 동질성을 보였고, TDC2와는 아미노산 동질성이 매우 낮음을 보여주었다.

< 실시예 2> 벼 TDC3 전장 유전자의 클로닝 및 형질전환용 발현 벡터의 제조

벼의 꽃에서 TRI 시약(Morecular Research Center, Inc., 미국)을 처리하여 전체 RNA를 추출하였고, 상기 전체 RNA를 주형으로 RT-PCR을 수행하였다. 우선 cDNA를 합성하기 위하여 역전사효소(reverse transcriptase) SuperScript Ⅱ(Invitrogen Inc., 미국)를 이용하였고, 프라이머는 올리고 dT를 사용하였다. 상기 벼 꽃에서 나온 역전사효소 반응 산물을 주형으로 하여 TDC3 유전자를 PCR 클로닝하였다. TDC3 유전자 클로닝을 위해 사용한 프라이머는 하기 서열번호 10의 전방향 프라이머 5'-(aaaaagcaggctccatggggagcttggacg)-3' 및 하기 서열번호 11의 역방향 프라이머 5'-(agaaagctgggtctacttgtcttctcc)-3'를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 상기 PCR 반응 수행에 의하여 유전자 생성물 TDC3(서열번호 3)이 생성되었다. PCR 증폭된 TDC3 유전자를 pDONR221 Gateway entry vector(Invitrogen 사, 미국)로 BP 반응을 통해 pDONR221-TDC3을 수득하였다. 다시 pDONR221-TDC3 vector 와 Gateway 바이너리벡터 pIPKb002(Himmelbach et al., Plant Physiol . 145:1192-1200, 2007)간의 LR 반응을 통해 최종적으로 pIPKb002:TDC3 유전자를 제작하였다. 상기 유전자의 상류에 기능적으로 연결된 옥수수 유비키틴 프로모터(constitutive ubiquitin promoter) 및 선별 표지로 하이그로마이신 프로포트랜스퍼라제(hygromycin phosphotransferase)를 포함한다(도 2의 A). 상기 제작된 바이너리 벡터 pIPKb002:TDC3를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404(Cat. No. 18313-015, GibcoBRL, 미국)에 도입시켰다. 상기 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 균주를 스펙티노마이신 50 ㎍/㎖을 포함하는 YEP 배지(1%의 Bacto-peptone, 1%의 Bacto-yeast extract 및 0.5%의 NaCl 함유)에서 28℃의 조건으로 하룻밤 동안 배양시켰다. 이 배양물을 원심분리시키고 펠릿들을 동일 부피의 아세토시링곤 100㎍/㎖을 함유하는 AA 배지(Hiei et al., Plant Mol . Biol. 35, 205-218, 1997)에 현탁시켜 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 현탁액을 제조하였다. 벼의 캘러스는 N6 배지에 파종된 벼(품종: 동진)의 배반으로부터 유도되었다(Rashid et al., Plant Cell Rep, 15:727-730, 1996; Hiei et al., Plant Mol , Biol. 35, 205-218, 1997). 약 3 내지 4주령의 밀집된 벼의 캘러스를 상기 세균 현탁액 중에 3분 동안 침적시킨 다음, 멸균 여과지를 현탁액에 접촉시켜 현탁액을 흡수 및 건조시킴으로서 과량의 균체를 현탁액에서 제거시켰다. 상기 공조배양된 캘러스를 세포탁심(Cefotaxim) 250 ㎍/㎖을 함유하는 멸균수로 세척시켜 잔존 세균을 제거시키고, 50㎍/㎖ 하이그로마이신을 함유하는 선별 배지로 옮겨 배양한 결과 전체의 10-15%의 캘러스가 생존하였다. 상기에서 생존한 하이그로마이신 저항성 캘러스들로부터 잎을 유도하기 위해 재분화 배지(regeneration medium)인 무라시게스쿠그(MS)배지(2mg/l)의 벤질아미노퓨린, 1mg/l의 나프탈렌아세틱산 및 50mg/l 스펙티노마이신 포함)로 옮겨 28℃에서 3주 동안 배양시켰다. 상기 선별된 캘러스 중 4-8%의 캘러스가 신초(shoot)로 재분화되었다. 이후 뿌리 유도배지에 옮겨 완전한 식물체를 획득하였다(Lee et al., Plant Cell Physiol. 41, 743-749, 2000). 하이그로마이신 선별 배지로부터 재분화된 형질전환 세포주로부터 종자를 획득하였고, 자가수정과정을 통해 T2 세대 종자를 획득하였다. TDC1 및 TDC2 유전자를 과다발현하는 형질전환벼는 바이너리벡터 pGA1611:TDC1 및 pGA1611:TDC2를 이용하여 상기의 방법과 동일한 방법으로 획득한 T4 세대 형질전환벼를 사용하였다(Kang et al., Planta 227:263-272, 2007). 이들 형질전환벼에서 상기 TDC 유전자가 항상 발현되는지 알고자 RT-PCR 반응을 수행하였다.

도 2의 B에 도시한 바와 같이, TDC1 및 TDC2 유전자가 T4 세대의 유묘에서 형질전환되지 않은 대조구(WT)에 비해 다량 TDC1 및 TDC2 mRNA 를 생성하고 있음을 볼 수 있었다. TDC3 형질전환벼의 유묘에서도, 대조구와 달리 TDC3 mRNA 가 다량 발현됨을 확인할 수 있었다. 이는 각각의 형질전환벼들이 각각 TDC 유전자들만을 특이하게 발현함을 볼 수 있었다.

< 실시예 3> TDC 발현 형질전환벼의 유묘에서 멜라토닌 함량 측정

TDC 형질전환 벼의 유묘에서, 멜라토닌 화합물이 얼마나 합성되는지 여부를 조사하였다. 상기 형질전환 벼를 무라시게스쿠그(MS) 고형화 배지(Duchefa Biochemie 사, 네덜란드)에 치상하여 무균배양하였다. 상기 배지에서 12시간 빛 상태 및 12시간 암 상태를 반복하여 1주간 배양한 유묘를 멜라토닌 함량을 측정하기위한 공시재료로 사용하였다. 멜라토닌 정량은 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 통하여 분석하였다. 벼 잎(0.2g)을 액체 질소에 갈고 6ml 메탄올로 추출하였다. 현탁액을 13,500g, 10분간 원심분리하였다. 상등액을 Sep-Pak C18 cartridge (Waters사, 미국)로 두번 분획하고 Sep-Pak Silica cartridge(Waters)로 한번 더 분획하였다. 클로로포름/메탄올 (30:1)로 분획된 분획물을 증발시키고 0.5ml 메탄올에 녹인 후, HPLC (Waters 2695, Waters 474: Fluoresecence detector)로 분석하였다. 이동상은 30%(v/v) 메탄올이고 0.4 ml/min 의 유속으로 Nova-Pak C18 칼럼(4.6×150mm)으로 분리하였다. 들뜸 파장은 280nm 이고 방출 파장은 348nm 으로 멜라토닌을 정량하였다.

TDC 형질전환벼의 유묘에서 멜라토닌 함량을 측정한 결과, TDC1 및 TDC2 형질전환벼의 유묘에서 멜라토닌 함량을 측정한 결과, TDC1 및 TDC2 형질전환벼에서는 대조구에 비해 같거나 다소 작은량의 멜라토닌이 검출되었으나, TDC3 형질전환벼에서는 대조구에 비해 약 2배 많은 량의 멜라토닌이 유묘에서 검출되었다(도 3 참조), 상기 결과는 TDC3 유전자가 멜라토닌 생합성에 긍정적으로 작용함을 보여주는 것이다.

< 실시예 4> TDC 발현 형질전환벼의 유묘에서 아민류 함량 측정

상기 실시예 3에서 획득한 유묘를 이용하여, TDC 발현이 세로토닌을 비롯한 아민류 생합성에 미치는 영향을 알고자 아민 화합물 함량을 정량하였다. 시료 0.1g 를 시료질량의 10배인 메탄올 1㎖로 5분 정도 충분히 추출하여, 12000g 로 15분간 원심분리 한 후 상등액을 모아두었다. 남아있는 pellet은 50% 메탄올 1㎖로 5분 정도 충분히 추출하여 12000g 로 15분간 원심분리한 후, 상등액을 모아둔 상등액과 합하였다. 모은 상등액을 증발시킨 후, 잔류물을 50% 메탄올 200㎕에 녹였다. 이중 20㎕을 HPLC를 통해 분석하였다. HPLC 조건은 표준 화합물을 기준물질로 삼아 peak 의 retention time 과 면적을 기준으로 하여 시료 추출물에서 검출된 아민류의 양을 계산하였다. 역상 HPLC(Wakosil 5C18HG column, 150×4.6 i.d (Wako 사, 일본))을 수행하고, column oven (Waters, U.S.) 온도는 40℃, 이동상의 조건은 90% 물(0.3% Trifluoroacetic acid v/v) : 10% 메탄올로 이동상 속도 0.8ml/min 로 조정하였다. UV 스펙트럼은 Dual λAbsorbance detector(Waters 2487)로 Waters 2690 HPLC system 을 이용하여 이때 파장은 280nm 이었다.

멜라토닌 생합성의 전구체인 트립토판의 함량은 TDC1 및 TDC2 과다발현 유묘에서 대조구의 트립토판 함량보다 각각 3배 및 2.6 배 높게 나타났으며, TDC3 형질전환벼에서는 라인에 따라 다소 차이가 있지만, 대조구보다 트립토판 함량이 적게 생합성되었다(도 4의 A). 다음으로 TDC 효소의 생성물인 트립타민의 함량을 측정한 결과, TDC1 형질전환벼에서 트립타민의 함량이 g 유묘당 1.32 ㎍ 으로 대조구에 비해 8배 정도 높았으며, TDC2 형질전환벼는 오히려 대조구보다 낮게 나타났다. TDC3 형질전환벼에서는 g 유묘당 1번 라인에서는 23㎍과 2번 라인에서는 16㎍이 생합성되어 대조구에 비해 135배 및 94배 정도로 높게 생합성되었다. 이는 TDC3유전자가 다른 TDC 유전자에 비해 효소활성이 매우 높거나, 식물 세포내에서 매우 안정적으로 발현되고 있음을 시사하고 있다(도 4의 B). 멜라토닌 합성의 중간 생성물인 세로토닌 함량을 측정한 결과, TDC1 형질전환체에서 대조구보다 8배 높았으며, TDC2 형질전환벼에서는 대조구에 비해 약간 높았으며, TDC3 형질전환체에서는 평균적으로 대조구에 비해 62배 높은 세로토닌이 생합성되었다(도 4의 C). 이와 같은 결과는 TDC 발현과 트립타민 및 세로토닌 생성과는 높은 관련이 있는 것으로 보여진다. 마지막으로 멜라토닌 생합성의 기질인 아세틸세로토닌의 함량을 측정하였다. 트립토판, 트립타민, 및 세로토닌의 함량과는 달리, 상대적으로 매우 적은량의 아세틸세로토닌이 벼에서 검출되었다. 대조구에서 g 유묘당 0.01㎍ 정도 생성되었고, TDC1에서는 0.04 ㎍, TDC2는 0.02㎍, TDC3 에서는 0.04㎍ 정도로 생성되어 대조구에 비해 TDC 형질전환벼에서 약간 높게 생성되었다(도 4의 D).

< 실시예 5> TDC 발현 형질전환벼의 종자에서 아민류 함량 측정

TDC 발현 종자에서 아민류의 생합성이 유묘와 비슷한지를 알아보고자, 실시예 4에 기술한 도일한 방법으로 종자에서 아민류 화합물을 분석하였다. TDC1 및 TDC2 유묘와는 달리, 종자에서 이들 형질전환종자에서는 트립토판의 증대 현상이 뚜렷이 나타나지 않았으나, 트립토판의 감소 현상은 TDC3 종자에서 뚜렷이 관찰되었다. 대조구에 비해 TDC3 종자는 평균적으로 5배 이하의 트립토판 함량이 생산되었다(도 5의 A). TDC3 종자에서 트립토판의 함량이 낮았으나, 하이드록시트립토판의 함량은 대조구에 비해 평균적으로 14배 높은 g 종자당 0.285 ㎍ 정도 검출되었다(도 5의 B). TDC 발현 종자에서 트립타민의 상대적인 량은 유묘보다 훨씬 낮았으며, TDC3 종자에서 g 종자당 0.7 ㎍ 정도 생산되었으며, 이는 대조구보다 8배 정도 높은 량이다(도 5의 C). 세로토닌의 경우, 종자에서 g 종자당 TDC3 종자에서 평균 183 ㎍ 정도 생산되었으며, 유묘보다 높게 생산되었다(도5의 D). 결론적으로 종자에서 아민류 함량은 모든 TDC 형질전환벼에서 대조구보다 높게 나타났으며, 이중에서도 TDC3 형질전환벼에서 하이드록시트립토판, 트립타민, 및 세로토닌 함량이 대조구에 비해 월등히 높게 생산되었다.

< 실시예 6> TDC 발현 형질전환벼의 종자에서 멜라토닌 함량 측정

TDC3 형질전환벼의 종자에서 아민류 함량의 증대가 멜라토닌 생합성과 연계되어 있는지 조사하기 위해 실시예 3의 방법과 동일하게 종자에서 멜라토닌 함량을 측정하였다. 먼저 멜라토닌이 전구체인 아세틸세로토닌 함량을 분석하여 본 결과, 대조구에 비해 TDC1 및 TDC2 종자에서는 차이가 발견되지 않았으나, TDC3 종자에서는 대조구에 비해 평균 9배 높은 아세틸세로토닌 함량이 검출되었다(도 6의 A). 최종적으로 종자에서 멜라토닌 함량을 측정한 결과, 아세틸세로토닌 함량과 동일하게, TDC1 및 TDC2 종자에서는 멜라토닌 함량 증대가 관찰되지 않았고, 오직 TDC3 종자에서 g 종자당 평균 6ng 정도 측정되었으며, 이는 대조구인 0.1ng 에 비해 60 배 이상 높은 멜라토닌이 생산되고 있음을 보여주었다(도 6의 B). 상기의 결과로부터 멜라토닌의 종자내 생합성 증대에는 3종의 TDC 유전자 중에서 TDC3 유전자의 발현이 가장 효과적임을 발견할 수 있었다.

< 실시예 7> TDC 발현 형질전환벼에서 멜라토닌 생합성 유전자 발현 측정

대조구와 형질전환유묘로부터 실시예 2에서 생성한 cDNA를 이용하여, 멜라토닌 생합성 유전자의 발현 양상을 RT-PCR 방법으로 관찰하였다. 멜라토닌 생합성의 두번째 효소를 암호화하는 tryptamin 5-hydroxylase(T5H는 트립타민을 세로토닌으로 촉매하는 유전자이다(Fujiwara et al., J. Biol. Chem. 285:11308-11313, 2010). Serotonin N-acetyltransferase(SNAT; NAT5) 유전자는 멜라토닌 생합성의 세번째 효소를 암호화하고 있는 유전자이며 세로토닌을 아세틸세로토닌으로 촉매하는 유전자이다(Kang et al., J. Pineal Res. Doi:10.1111/jpi.12011, in press). 멜라토닌 생합성의 최종 유전자는 N-acetylserotonin methyltransferase(ASMT; MT15)이며, 아세틸세로토닌을 멜라토닌으로 촉매하는 효소이다(Kang et al., T. Pineal Res. 50:304-309, 2011). RT-PCR 반응의 대조구로서 벼 유비퀴틴 5(UBQ5) 유전자를 이용하였다. 사용한 프라이머는 T5H은 전방향 프라이머 5'-(cctcgtcctggacatgttcgtc)-3'(서열번호 12), 역방향 프라이머 5'-(atggcgaacgtgttgatgaacac)-c'(서열번호 13)이고, SNAT(NAT5)는 전방향 프라이머 5'-(gggctgcggcaacttggtcc)-3'(서열번호 14), 역방향 프라이머 5'-(agaaagctgggtctaaaatctggggta)-3'(서열번호 15)이고, ASMT(MT15)는 전방향 프라이머 5'-(taccgtccatgacggcg)-3'(서열번호 16), 역방향 프라이머 5'-(cggccgccttctcgaca)-3'(서열번호 17)이고, UBQ5는 전방향 프라이머 5'-(ccgactacaacatccagaaggag)-3'(서열번호 18), 역방향 프라이머 5'-(aacaggagcctacgcctaagc)-3'(서열번호 19) 등이다. PCR 반응은 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 도 7에 예시한 바와 같이, TDC 형질전환벼의 유묘에서 이들 멜라토닌 생합성 유전자의 발현 양상은 TDC1, TDC2, TDC3 모든 형질전환체에서 대조구와 동일하게 발현되었으며, 대조구와 다르게 발현되는 생합성유전자는 없었다. 이는 TDC3 단독발현으로 멜라토닌 생합성이 증대되고, 특히 종자에서 많이 축적될 수 있음을 보여주었다.

비록 본 발명의 몇몇 실시예들이 도시되고 설명되었지만, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 당업자라면 본 발명의 원칙이나 정신에서 벗어나지 않으면서 본 실시예를 변형할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해 정해질 것이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Transformed plants enriched with melatonin or amines, and a method for increasing content of melatonin or amines of plants <130> P13031020391 <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1545 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> gene <222> (1)..(1545) <223> TDC1-F cDNA Sequence <400> 1 atgggcagct tggacaccaa ccccacggcc ttctccgcct tccccgccgg cgagggtgaa 60 accttccagc cgctcaacgc cgatgatgtc cggtcctacc tccacaaggc ggtggacttc 120 atctcggact actacaagtc cgtggagtcc atgccggtgc tgcccaatgt caagccgggg 180 tacctgcagg acgagctcag ggcctcgccg ccgacgtact cggcgccgtt cgacgtcacc 240 atgaaggagc tccggagctc cgtcgtcccc gggatgacgc actgggcgag ccccaacttc 300 ttcgcgtttt tcccctccac gaatagtgcg gccgccattg ccggcgacct catcgcgtcg 360 gcgatgaaca cggtcgggtt cacgtggcag gcgtcgccgg cggccaccga gatggaggtg 420 ctcgcgctgg actggctcgc gcagatgctc aacctgccga cgagcttcat gaaccgcacc 480 ggcgaggggc gtggcaccgg cggtggggtt attctgggga cgaccagcga ggcgatgctc 540 gtcacgctcg ttgccgcgcg cgacgccgcg ctgcggcgga gcggcagcga cggcgtggcg 600 ggactccacc ggctcgccgt gtacgccgcc gaccagacgc actccacgtt cttcaaggcg 660 tgccgcctcg ccgggtttga tccggcgaac atccggtcga tccccaccgg ggccgagacc 720 gactacggcc tcgacccggc gaggctgctg gaggcgatgc aggccgacgc cgacgccggg 780 ctggtgccca cctacgtgtg cgccacggtg ggcaccacgt cgtccaacgc cgtcgacccg 840 gtgggcgccg tggccgacgt cgcggcgagg ttcgccgcgt gggtgcacgt cgacgcggcg 900 tacgccggca gcgcgtgcat ctgcccggag ttcaggcacc acctcgacgg cgtggagcgc 960 gtggactcca tcagcatgag cccccacaaa tggctgatga cctgcctcga ctgcacctgc 1020 ctctacgtgc gcgacaccca ccgcctcacc ggctccctcg agaccaaccc ggagtacctc 1080 aagaaccacg ccagcgactc cggcgaggtc accgacctca aggacatgca ggtcggcgtc 1140 ggccgccgct tccgggggct caagctctgg atggtcatgc gcacctacgg cgtcgccaag 1200 ctgcaggagc acatccggag cgacgtcgcc atggccaagg tgttcgagga cctcgtccgc 1260 ggcgacgaca ggttcgaggt cgtcgtgccg aggaacttcg ctctcgtctg cttcaggatc 1320 agggccggcg ccggcgccgc cgccgcgacg gaggaggacg ccgacgaggc gaaccgcgag 1380 ctgatggagc ggctgaacaa gaccggcaag gcgtacgtgg cgcacacggt ggtcggcggc 1440 aggttcgtgc tgcgcttcgc ggtgggctcg tcgctgcagg aagagcatca cgtgcggagc 1500 gcgtgggagc tcatcaagaa gacgaccacc gagatgatga actaa 1545 <210> 2 <211> 1494 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> gene <222> (1)..(1494) <223> TDC2 cDNA Sequence <400> 2 atggagggag ttggcggcgg cggcggcggt gaggagtggc tgcggccgat ggacgcggag 60 cagctgcggg agtgcgggca ccggatggtg gatttcgtcg ccgactacta caaatccatc 120 gaggccttcc ccgtcctcag ccaagtccag ccaggatatc tgaaggaagt tcttccagat 180 tcagccccaa gacaacctga tactttggat tccctttttg atgatattca acaaaaaata 240 ataccaggag taacgcactg gcaaagtcca aattattttg cttactatcc ttcaaatagc 300 agcactgctg gattcctggg ggagatgctt agtgctgcct ttaacattgt tggcttcagt 360 tggataacct ctcctgctgc tactgagcta gaggttatag tcttagactg gtttgcaaaa 420 atgctccagc ttccaagcca gtttctgtca actgctcttg gtggaggagt aatacaaggt 480 actgccagtg aagctgttct tgttgcacta ttggctgcac gagatagagc tttaaagaag 540 catgggaagc attcccttga aaagttagta gtttatgcat ctgaccagac acattctgct 600 ctacaaaagg catgccagat tgcaggaatt ttctcagaga atgttagggt tgtaattgct 660 gattgtaata agaactacgc cgttgcccct gaggcagtta gtgaggcgct ttccatagac 720 ctgtcatctg gtttgatacc atttttcatc tgtgcaacag taggtacaac atcatcgtca 780 gctgtggacc ccctgcctga actaggacag atagcaaagt ccaatgacat gtggttccat 840 attgatgccg catatgctgg aagtgcttgt atatgcccag agtaccgaca ccacctcaat 900 ggagtggaag aagctgattc gtttaatatg aatgcccaca aatggttcct cactaacttc 960 gattgttcct tgctatgggt taaggacagg agttttctca tacaatcatt gtctacgaat 1020 ccagagtttc tcaaaaacaa ggcttcccaa gctaattcag ttgttgattt caaagattgg 1080 caaattccac ttggacgacg ctttagatca cttaagctat ggatggtctt gagactttat 1140 ggtgtggaca acctacaaag ctatatccgg aaacacatac atttggctga acattttgag 1200 caacttttat tatctgattc aagatttgag gtagtgactc caaggacttt ttcacttgtt 1260 tgtttccgac ttgtgcctcc cacttctgac catgaaaatg gacgtaaatt gaattacgat 1320 atgatggatg gtgtaaattc aagtggaaag atcttcctat ctcacacggt tctttcaggt 1380 aagttcgtct tgagatttgc agtaggagcg ccacttacag aggagcgaca cgtggatgcc 1440 gcttggaagc ttctacgaga tgaggccacc aaggtcttgg ggaaaatggt gtag 1494 <210> 3 <211> 1572 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> gene <222> (1)..(1572) <223> TDC3 cDNA Sequence <400> 3 atggggagct tggacgccaa cccggccgcc gcctacgccg cgttcgccgc cgacgtcgag 60 cccttccgcc cgctcgacgc cgacgacgtc cgctcctacc tccacaaggc cgtcgacttc 120 gtctacgact actacaagtc ggtggagtcg ctcccggtgc tccctggcgt cgagccgggc 180 tacctcctgc ggctgctgca gtcggcgccg ccgtcgtcgt cggcgccgtt cgatattgct 240 atgaaggagc tcagggaggc ggttgtcccc gggatgaccc actgggcgag cccgaatttc 300 ttcgcgttct ttccggcgac gaatagcgcc gccgcgatcg ccggtgagct catcgcgtcg 360 gcgatgaaca ccgtcggatt cacgtggcag gcggcgccgg cggcgaccga gctggaggtg 420 ctcgcgctgg attggctcgc gcagctgctc gggttgccgg cgagtttcat gaaccgcacc 480 gtcgccggtg ggcgcggcac cggcgggggc gtcattctgg ggaccaccag cgaggcgatg 540 ctcgtcacgc tcgtcgccgc gcgcgacgcc gcgctgcggc ggagcgggtc caatggcgtg 600 gcgggcatca cgcggctgac ggtgtacgcc gccgaccaga cgcactccac gttcttcaag 660 gcgtgccgcc tcgccgggtt cgatccggcg aacatccggt cgatccccac cggggccgag 720 accgactacg gcctcgaccc ggcgaggctg ctggaggcga tgcaggccga cgccgacgcc 780 gggctggtgc ccacctacgt gtgcgccacg gtgggaacca cgtcgtccaa cgccgtcgac 840 ccggtgggcg ccgtggccga cgtcgcggcg aggttcgcgg cgtgggtgca cgtcgacgcg 900 gcgtacgccg gcagcgcgtg catctgcccg gagttccggc accacctcga cggcgtggag 960 cgtgtcgact ccatcagcat gagcccccac aagtggctga tgacctgcct cgactgcacc 1020 tgcctctacg tccgcgacac ccaccgcctc accggctccc tcgagaccaa cccggagtac 1080 ctcaagaacc acgccagcga ctccggcgag gtcaccgacc tcaaggacat gcaggtcggc 1140 gtcggccgcc gcttccgggg gctcaagctc tggatggtca tgcgcaccta cggcgccggc 1200 aagctgcagg agcacatccg gagcgacgtc gccatggcca agacgttcga ggacctcgtc 1260 cgcggcgacg accggttcga ggtcgtggtg ccgaggaact tcgcgctcgt ctgcttcagg 1320 atcaggccga ggaaatccgg cgccgccatc gccgccggcg aggcggaggc cgagaaggcg 1380 aaccgcgagc tgatggagcg gctgaacaag accggaaagg cttacgtggc gcacacggtg 1440 gtcggcggca ggttcgtgct gcgcttcgcg gtggggtcgt cgctgcagga ggagcggcac 1500 gtgcgaagcg cgtgggagct catcaagaag acgaccaccg agatcgtcgc cgacgccgga 1560 gaagacaagt ag 1572 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDC1-RT-F <400> 4 gcgagggtga aaccttcca 19 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDC1-RT-R <400> 5 gcgagccggt ggagtcc 17 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDC2-RT-R <400> 6 gtgctgcctt taacattgtt gg 22 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDC2-RT-R <400> 7 catgtcattg gactttgcta tctgt 25 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDC3-RT-F <400> 8 gacgtcgagc ccttccgc 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDC3-RT-R <400> 9 accgtcagcc gcgtgatg 18 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDC3-F <400> 10 aaaaagcagg ctccatgggg agcttggacg 30 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDC3-R <400> 11 agaaagctgg gtctacttgt cttctcc 27 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T5H-F <400> 12 cctcgtcctg gacatgttcg tc 22 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T5H-R <400> 13 atggcgaacg tgttgatgaa cac 23 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNAT-F <400> 14 gggctgcggc aacttggtcc 20 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNAT-R <400> 15 agaaagctgg gtctaaaatc tggggta 27 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASMT-F <400> 16 taccgtccat gacggcg 17 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASMT-R <400> 17 cggccgcctt ctcgaca 17 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBQ5-F <400> 18 ccgactacaa catccagaag gag 23 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBQ5-R <400> 19 aacaggagcc tacgcctaag c 21

Claims (14)

1. 삭제
2. 서열번호 3으로 이루어지는 TDC3 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 벼 식물체로서, 상기 TDC3는 멜라토닌 생합성 조절유전자인, 야생형에 비해 멜라토닌 함량이 증가된 벼 식물체.
3. 삭제
4. 삭제
5. 서열번호 3으로 이루어지는 TDC3 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 벼 식물체 종자로서, 상기 TDC3 유전자는 멜라토닌 생합성 조절유전자인, 야생형에 비해 멜라토닌 함량이 증가된 형질전환 벼 식물체 종자.
6. (a) 서열번호 3으로 이루어지는 TDC3 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제조단계;
   (b) 상기 (a)의 재조합 벡터로 형질전환하여 TDC3 유전자 과발현 벼 식물체를 제조하는 단계; 및
   (c) 상기 (b)단계의 TDC3 유전자 과발현 벼 식물체를 자가수정하는 단계;
   를 포함하고, 상기 TDC3 유전자는 멜라토닌 생합성 조절유전자인, 야생형에 비해 멜라토닌 함량이 증가된 형질전환 벼 식물체 종자의 제조방법.
7. 삭제
8. 제 6항에 있어서, 상기 TDC3 유전자는 벼(Oryza sativa) 유래 유전자인 것을 특징으로 하는 야생형에 비해 멜라토닌 함량이 증가된 형질전환 벼 식물체 종자의 제조방법.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제

Images