CN104222072B - 一种亚麻种子玻璃化超低温保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种亚麻种子玻璃化超低温保存法，具体方法步骤为：取晒干的新鲜亚麻种子，常温情况下置于装载液中装载20分钟，然后转入装有玻璃化保护剂的冻存管中，冻存管置于梯度降温盒，降至-30℃—-60℃，投入液氮中超低温保存。从液氮中取出冻存管，亚麻种子当室温大于等于20℃，自然解冻，小于20℃，在30℃水浴箱快速解冻1分钟，水洗2-3次就可以直接进行生长培养。本发明工艺简单，操作方便，保存的亚麻种子遗传性状稳定，种子发芽试验可获得98.67％的发芽率，能够长期保存亚麻种子。
Description
技术领域
本发明属于亚麻种质资源保存的技术领域，具体涉及一种亚麻种子的玻璃化超低温保存方法。
背景技术
亚麻(Linumusitatissimum)是世界上古老的韧皮纤维作物和油料作物，起源于近中东及地中海沿岸。亚麻在中国栽培历史悠久，是特色经济作物，亚麻纤维在五大麻纺工业原料作物中效果佳，有麻中皇后之称。亚麻种质资源是亚麻育种、科研、生产及教学等基础工作，种质资源研究的首要任务是收集种质，安全保存种质。目前，亚麻种质资源保存方式为常温、低温保存亚麻种子两种方式。常温保存的亚麻种子，每保存5年就需要重新繁种更新，因为亚麻种子经过5年的保存，活力降低很快，只有50％左右；低温保存亚麻种子，在中国，建立了国家中期库和国家作物种质库，国家中期库保存的温度为4±2℃，相对湿度小于65％，一般设计贮藏种子的寿命为5-10年，国家种质库为种质长期保存库，库中的温度为-18±1℃，相对湿度小于50％，设计贮藏寿命达20年以上，也就是说种质在长期库中保存，活力同样随着时间的推移降低，种质20年后一般需要更新繁种，不是永久的保存。
因此，为了安全保存亚麻种质资源，研究探索一种安全而长久保存亚麻种质资源的方法很有意义，它能够减少或者避免种子更新繁种，省时省力，阻断繁种更新的过程中种质间基因漂移等产生种质变异，保证种质的遗传稳定性。
刘伟伟等人(野生亚麻无性扩繁及保存技术的研究，《中国麻业科学》2008)报道了一种亚麻低温保存技术，但该技术仅仅限于4℃范围下对于亚麻的快繁材料进行42-92天的保存，并不涉及亚麻种子及超低温保存。
超低温(液氮-196℃)条件下保存植物细胞、组织或者器官等生物材料的代谢和生长活动几乎完全停止，植物材料处于相对稳定的生物学状态，不会发生遗传状态的改变或者形态潜能的丧失，理论上超低温能够无限期地保存植物材料。玻璃化超低温保存法是超低温保存法中的一种，它是将植物材料置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中处理，再投入-196℃液氮，使植物样品连同保护剂一起在快速降温过程中固化成玻璃态，并以这种玻璃态在超低温下保存。玻璃化超低温法工艺简单，操作方便，效果和重演性好是长期安全保存植物种质的一种有效安全方法，目前已经应用于大苞鞘石斛(Dendrobiumwardianum)原球茎，菊花(Chrysanthemum)茎尖，马铃薯(SolanumtuberosumL)茎尖等，不同的物种，以及不同的部位进行玻璃化超低温法保存的具体要求和保存效果是有很大差异的，本发明以亚麻种子为材料，玻璃化超低温保存尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种适合于亚麻种子的玻璃化超低温保存法，该方法能够补充现在亚麻种质资源保存技术的不足，可以长期安全的保存亚麻种质资源，为亚麻种质资源保存提供一条新的有效的技术途径。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种亚麻种子玻璃化超低温保存方法，包括以下步骤：室温下将亚麻种子置于装载液，装载20分钟后，取出转入装有玻璃化保护剂的冻存管中，梯度降温至-30℃—-60℃，降温速度为-1℃/分钟，然后迅速投入液氮进行超低温保存。
上述方法梯度降温优选至-40℃。
所述的梯度降温是将冻存管置于加有100％异丙醇的梯度降温盒，随后将梯度降温盒放进-80℃低温冰箱进行梯度降温，梯度降温盒中的异丙醇重复使用4-5次后更新。
所述的装载液组分及配比为：含有0.4-0.6mol.L-1蔗糖及2-2.5mol.L-1甘油的MS液体培养液，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，室温放置。
所述的玻璃化保护剂组分及配比为：含3.25-3.50mol.L-1甘油、2.42mol.L-1乙二醇、1.92mol.L-1二甲基亚砜及0.40-0.50mol.L-1蔗糖的MS液体培养基，121℃灭菌15分钟，室温放置。
本发明采用的亚麻种子为当年收获鲜种，自然晒干，种子含水量为8.5-9.5％。
上述方法中亚麻种子解冻时将冻存管从液氮中取出，当室温≥20℃，自然解冻，室温＜20℃，冻存管置于30℃水浴箱中急速解冻1分钟；然后采用自来水或者蒸馏水洗涤2-3次，即可用于培养。
本发明的技术效果：
1、本发明首次以亚麻种子为材料成功的进行了玻璃化超低温保存方法的探究；
2、在玻璃化保护剂处理时采用独特的梯度降温方式，要明显优于直接一步降温的效果；
3、摸索出最适合亚麻种子的装载时间和梯度降温温度范围；
4、本发明的解冻方式也是现有技术没有报道过的，操作简单方便，不影响发芽率。
总之，本发明的亚麻玻璃化超低温保存法工艺简单，稳定性可靠，保存后的亚麻种子的发芽率和鲜种的发芽率无显著性差异，发芽试验结果表明玻璃化超低温保存后亚麻种子发芽率高达98.67％。本发明能有效的、长期安全保存亚麻种子，是亚麻种质资源长期保存的一种实用新方法。
附图说明
图1是不同装载时间玻璃化超低温保存亚麻种子发芽率；
图2是梯度降至不同温度玻璃化超低温保存亚麻种子发芽率；
图3是不同的保存和处理方式超低温保存亚麻种子发芽率；
图4是玻璃化超低温保存亚麻种子与鲜种发芽率情况比较。
具体实施方式
以下实施案例进一步说明本发明的内容，但不应理解为本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1：种子超低温保存和解冻过程
取当年收获的亚麻“中亚1号”种子(中国农业科学院麻类研究所亚麻育种课题组提供)，自然晒干，将含水量9％左右的亚麻种子放入装载液，装载一定时间，将亚麻种子取出放入装有玻璃保护剂的离心管中，离心管置于加有100％异丙醇的梯度降温盒(美国Nalgene公司生产，型号5100-0001)，随后将梯度降温盒放进-80℃低温冰箱进行梯度降温，梯度降温盒中的异丙醇重复使用4-5次后更新。降至一定温度，投入液氮中保存。超低温保存后的亚麻种子自然解冻，解冻后的亚麻种子用蒸馏水洗涤3次，吸干水生长培养。
装载液组分及配比为：含有0.4-0.6mol.L-1蔗糖及2-2.5mol.L-1甘油的MS液体培养液，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，室温放置。
玻璃化保护剂组分及配比为：含3.25-3.50mol.L-1甘油、2.42mol.L-1乙二醇、1.92mol.L-1二甲基亚砜及0.40-0.50mol.L-1蔗糖的MS液体培养基，121℃灭菌15分钟，室温放置。
实施例2：确定装载时间(分钟)、投入液氮前梯度降至温度与亚麻种子发芽率关系
本实施例是在实施例1的基础上设计装载时间为0min,5min,10min，15min，20min，梯度降至温度为-10℃，-20℃，-20℃，-30℃，-40℃，-50℃，-60℃，-70℃，具体见表1，共设计了40组试验，每组试验亚麻种子数为50粒，重复三次。亚麻种子超低温保存后，被均匀置于湿润的滤纸上(滤纸放在培养皿中，滤纸下放置一层薄薄的是脱脂棉，脱脂棉湿润)，随后放进25℃的培养箱中培养3天，取出培养皿，数发芽数。
根据发芽率结果，分析装载时间、梯度降温及其它们交互作用对玻璃化超低温保存亚麻种子影响，具体结果见表2及图1，2。
从表2中可以发现装载时间(P<0.001)、投入液氮前梯度降温降至的温度(P＝0.001)差异极显著，它们的交互作用同样存在极显著差异(p<0.01)。图1表明，装载20分钟超低温保存亚麻种子发芽率最高，为96.08％。图2表明梯度降温至-60℃超低温保存亚麻种子发芽率最高，为94.66％。装载时间及梯度降温两者交互作用存在极显著差异(p<0.01)，本实施例中发现“中亚1号”装载20分钟，降至-40℃亚麻种子发芽率最高，平均为98.67％。
本实施例说明玻璃化超低温保存后的亚麻种子的发芽率高，最高达到98.67％，玻璃化超低温保存亚麻种子可行，但是装载时间及梯度降温交互作用存在极显著差异，表明玻璃化超低温保存亚麻种子，种质不同，装载时间及梯度降温有一定的变化幅度。
表1：预处理时间、梯度降温及种子发芽百分率(％)
表2、预处理时间、梯度降温及交互作用方差分析表
| 变异来源 | 自由度 | 平方和 | 均方 | 方差比 | F pr. |
| 预处理时间 | 4 | 1147.62 | 286.91 | 12.65 | <0.001 |
| 梯度降至温度 | 7 | 600.41 | 85.77 | 3.78 | 0.001 |
| 时间.温度 | 28 | 1635.90 | 58.42 | 2.58 | <0.001 |
| 残差 | 80 | 1813.99 | 22.67 | ||
| 总变异 | 119 | 5197.92 |
实施例3：亚麻种子不同的保存和处理方式与种子发芽率关系
本实施例中是在实施例1的基础上设计的不同超低温保存方式及处理为：
a亚麻鲜种不经过任何处理装入冻存管，直接放到液氮中进行保存；
b亚麻种子不进行装载处理，直接加玻璃保护剂置于冻存管中，放进液氮中超低温保存；
c亚麻种子装载20分钟，加入玻璃化保护剂，梯度降温到-40℃，投入液氮超低温保存；
d亚麻种子装载20分钟，加入玻璃化保护剂，不经过梯度降温，投入液氮超低温保存。
本实施例中每个试验选用50粒饱满的亚麻种子，每个试验重复三次。亚麻种子超低温保存后，洗涤，均匀置于湿润的滤纸上(滤纸放在培养皿中，滤纸下放置一层薄薄的是脱脂棉，脱脂棉湿润)，随后置于25℃的培养箱中，3天后，从培养箱中取出，数发芽数。试验结果采用GENSTAT12.0软件分析，混合线性模型分析结果表明不同的超低温保存和处理方式之间存在着显著性的差异(P＝0.035)，从图3中可以发现c处理保存方式，亚麻种子的发芽率最高，为98.0％。本实施例说明玻璃化超低温保存亚麻种子可行，优于鲜种直接超低温保存，优于加入装载液，加入玻璃保护保护剂但不经过梯度降温超低温保存。
实施例4：玻璃化超低温保存亚麻种子与鲜种种子发芽率情况
本实施例中玻璃化超低温保存亚麻种子(处理Ⅰ)方案为：装载20分钟，加入玻璃化保护剂，梯度降温至-40℃，投入液氮超低温保存，保存5天后，进行发芽试验。
处理Ⅱ方案为：装载20分钟，加入玻璃化保护剂，梯度降温至-40℃，投入液氮超低温保存，保存4年(保存时间为2010年7月6日)，2014年7月16日取出，进行发芽试验。
对照Ⅰ为鲜种，不经过超低温保存，低温(4℃)保存5天。
对照Ⅱ为鲜种，与处理Ⅱ为同一批次种子，不经过超低温保存，低温(4℃)保存4年多(2010年7月2日保存于4℃冰箱)，2014年8月15日从冰箱中取出，进行亚麻种子发芽试验。
每份种子数为50粒，重复3次。结果见图4，图中表明玻璃化超低温保存亚麻种子处理Ⅰ，处理Ⅱ与对照Ⅰ种子的发芽率没有差异，但是4℃保存4年的亚麻种子活力下降的快，发芽试验显示只有39.16％种子发芽。本实施例说明玻璃化超低温保存亚麻种子是科学可行的，优于4℃低温保存。
Claims (4)
1.一种亚麻种子玻璃化超低温保存方法，其特征在于：包括以下步骤：室温下将亚麻种子置于装载液，装载20分钟后，取出转入装有玻璃化保护剂的冻存管中，梯度降温至-40℃，降温速度为-1℃/分钟，然后迅速投入液氮进行超低温保存；
所述的装载液组分及配比为：含有0.4-0.6mol.L-1蔗糖及2-2.5mol.L-1甘油的MS液体培养液，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，室温放置；
所述的玻璃化保护剂组分及配比为：含3.25-3.50mol.L-1甘油、2.42mol.L-1乙二醇、1.92mol.L-1二甲基亚砜及0.40-0.50mol.L-1蔗糖的MS液体培养基，121℃灭菌15分钟，室温放置。
2.根据权利要求1所述的亚麻种子玻璃化超低温保存方法，其特征在于：所述的梯度降温是将冻存管置于加有100％异丙醇的梯度降温盒，随后将梯度降温盒放进-80℃低温冰箱进行梯度降温，梯度降温盒中的异丙醇重复使用4-5次后更新。
3.根据权利要求1所述的亚麻种子玻璃化超低温保存方法，其特征在于：亚麻种子为当年收获鲜种，自然晒干，种子含水量为8.5-9.5％。
4.根据权利要求1所述的亚麻种子玻璃化超低温保存方法，其特征在于：亚麻种子解冻时将冻存管从液氮中取出，当室温≥20℃，自然解冻，室温＜20℃，冻存管置于30℃水浴箱中急速解冻1分钟；然后采用自来水或者蒸馏水洗涤2-3次，即可用于培养。
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