CN107691433A - 一种山苍子种子超低温保存方法 - Google Patents

一种山苍子种子超低温保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种山苍子种子超低温保存方法，包括步骤以下：室温下将山苍子种子用水洗净，用营养液培育20～50min后，取出培育过的山苍子种子；培育过的山苍子种子放入冻存管中，再加入抗冻液进行室温温育15～35min，再将其放入梯度降温盒中；将带有山苍子种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在‐35℃～‐60℃，降温速度为‐1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用；经低温保存6年后，再将降温盒从液氮中取，缓慢解冻，洗净后用于种子发芽。

Description

一种山苍子种子超低温保存方法
技术领域
本发明涉及一种山苍子种子超低温保存方法，属于药材种子资源保存技术领域。
背景技术
山苍子又名山鸡椒、木姜子、过山香，为樟科木姜子属，是珍贵芳香油料小乔木，其花、叶、果和树皮可蒸馏提取山苍子油，成熟的果实含油量最高。山苍子油中含有柠檬醛、高级醇、有机酸，柠檬醛含量高达70％，是配制香精、香料和合成维生素A、E的主要原料，还可直接用于杀虫灭菌，一直是我国出口创汇最大的天然植物精油。山苍子主要分布于我国浙江、福建、湖南、湖北、江西、广东、广西、云南、贵州、台湾等省(区)，其植株的生长环境主要在阳坡、采伐迹地、火烧迹地、荒山灌丛和稀疏林中。
山苍子是一种将生态、经济、社会效益高度统一的树种，因其具有很高的经济价值。目前，我国的山苍子大部分仍处于野生状态，加工的山苍子85％以上采自野果，并且多以毁灭性的砍树为主要采摘方式，这不仅严重破坏了生态平衡，还对山苍子资源的继续利用造成极坏的影响，导致资源枯竭和产量下降，使山苍子油在目前供不应求。山苍子适应性广，耐瘠薄，截水围土性能好，可用来治理疏林地水土流失。传统栽培主要用种子繁殖，不仅种子发芽率低，优良性状遗传也不稳定，严重地影响着山苍子油的产量质量。
目前种质资源保存方式为常温、低温保存山苍子种子两种方式。常温保存中药材种子，需要每年重新繁种更新，因为植物种子经过常温保存，活力降低很快；低温保存植物种子，在中国，建立了国家中期库和国家种质库，国家中期库保存的温度为4℃左右，相对湿度小于65％，一般设计贮藏种子的寿命为5～10年，国家种质库为种质长期保存库，库中的温度为-18℃左右，相对湿度小于50％，设计贮藏寿命达20年以上，也就是说种质在长期库中保存，活力同样随着时间的推移降低，种质20年后一般需要更新繁种，不是永久的保存。
因此，为了安全保存山苍子种质资源，研究探索一种安全而长久保存山苍子种质资源的方法很有意义，它能够减少或者避免种子更新繁种，省时省力，阻断繁种更新的过程中种质间基因漂移等产生种质变异，保证种质的遗传稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种适合于山苍子种子的超低温保存法，该方法能够补充现在山苍子种质资源保存技术的不足，可以长期安全的保存山苍子种质资源，为山苍子种质资源保存提供一条新的有效的技术途径。
本发明的目的是提供一种山苍子种子超低温保存方法，包括步骤以下：
(1)室温下将山苍子种子用水洗净，用营养液培育20～50min后，取出培育过的山苍子种子；
(2)培育过的山苍子种子放入冻存管中，再加入抗冻液进行室温温育15～35min，再将其放入梯度降温盒中；
(3)将带有山苍子种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在-35℃～-60℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用；
(4)经低温保存6年后，再将降温盒从液氮中取，缓慢解冻，洗净后用于种子发芽。
所述山苍子种子为当年收获鲜种，自然晒干，种子含水量为6～15％。
在一个具体方案中，步骤(1)中所述营养液指MS液体培养液，还包含有1.5～2.5mol/L甘油和1～1.5mol/L二甲基亚砜。
所述营养液优选105～121℃高压蒸汽灭菌15min以上，冷却至室温放置。
在一个具体方案中，步骤(2)中所述梯度降温盒中含有100％甘油或异丙醇，可以重复使用。
在一个具体方案中，步骤(2)中所述抗冻液是指MS液体培养液，还包含有2.5～3.6mol/L甘油、1.6～2.5mol/L二甲基亚砜和0.5～0.8mol/L蔗糖。
所述抗冻液优选105～121℃高压蒸汽灭菌15min以上，冷却至室温放置。
在一个具体方案中，步骤(3)中所述低温冰箱的温度要求一般在-70℃以下。
山苍子上述所保存的山苍子种子进行解冻时，若室温超过20℃，将冻存管从液氮中取出，直接利用室温自然解冻；若室温低于20℃，将冻存管从液氮中取出，并置于20～24℃水浴箱中解冻。解冻完后，取出冻存管中山苍子种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤3～5次，清洗后山苍子种子直接用于培养。
技术效果
1、本发明进行山苍子超低温保存，工艺简单，稳定性可靠，保存后的山苍子种子的发芽率和鲜种的发芽率无显著性差异，发芽试验结果表明超低温保存后山苍子种子发芽率高达90％以上。
2、本发明具有长期、有效、安全保存山苍子种子，是山苍子种质资源长期保存的最有效方法。
具体实施方式
下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任何一个或类似实例。
实施例1
取某地当年收获的山苍子，洗净后自然晒干，将含水量9.5％左右的山苍子种子用含有2.35mol/L甘油和1.3mol/L二甲基亚砜的MS液体培养液温育，温育20min后，取出温育过的山苍子种子，再放入冻存管中，再加入含有3.2mol/L甘油、1.85mol/L二甲基亚砜和0.6mol/L蔗糖的MS，室温温育30min，再将其放入梯度降温盒中；山苍子将梯度降温盒放进-70℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在-50℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存7年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中山苍子种子从液氧取出室温解冻，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后山苍子种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到94.26％。
对照实施例1
取某地当年收获的山苍子，洗净后自然晒干，将含水量9.5％左右的山苍子种子用含有2.35mol/L甘油的MS液体培养液温育，温育20min后，取出温育过的山苍子种子，再放入冻存管中，再加入含有3.2mol/L甘油、1.85mol/L二甲基亚砜和0.6mol/L蔗糖的MS，再将其放入梯度降温盒中；将梯度降温盒放进-70℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在-50℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存7年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中山苍子种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后山苍子种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到72.52％。
对照实施例2
取某地当年收获的山苍子，洗净后自然晒干，将含水量9.5％左右的山苍子种子用含有2.35mol/L甘油和1.3mol/L二甲基亚砜的MS液体培养液温育，温育20min后，取出温育过的山苍子种子，再放入冻存管中，再加入含有3.2mol/L甘油、1.85mol/L二甲基亚砜和0.6mol/L蔗糖的MS，室温温育30min，再将其放入在-5℃左右低温冰箱保存7年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃左右，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中山苍子种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后山苍子种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到23.77％。而取新鲜山苍子1～5℃下低温保存6年后，用于发芽实验，经测试山苍子未能发芽。
实施例2
取某地当年收获的山苍子，洗净后自然晒干，将含水量6.5％左右的山苍子种子用含有2.4mol/L甘油和1.5mol/L二甲基亚砜的MS液体培养液温育，温育30min后，取出温育过的山苍子种子，再放入冻存管中，再加入含有3.3mol/L甘油、1.7mol/L二甲基亚砜和0.65mol/L蔗糖的MS，室温温育20min，再将其放入梯度降温盒中；将梯度降温盒放进-80℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在-55℃左右，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存7年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃左右，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中山苍子种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后山苍子种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到95.62％。

Claims (7)

1.一种山苍子种子超低温保存方法，包括步骤以下：
(1)室温下将山苍子种子用水洗净，用营养液培育20～50min后，取出培育过的山苍子种子；
(2)培育过的山苍子种子放入冻存管中，再加入抗冻液进行室温温育15～35min，再将其放入梯度降温盒中；
(3)将带有山苍子种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在‐35℃～‐60℃，降温速度为‐1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用；
(4)经低温保存6年后，再将降温盒从液氮中取，缓慢解冻，洗净后用于种子发芽。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中所述营养液指MS液体培养液，还包含有1.5～2.5mol/L甘油和1～1.5mol/L二甲基亚砜。
3.根据权利要求2的方法，其中所述营养液优选105～121℃高压蒸汽灭菌15min以上，冷却至室温放置。
4.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中所述梯度降温盒中含有100％甘油或异丙醇，可以重复使用。
5.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中所述抗冻液是指MS液体培养液，还包含有2.5～3.6mol/L甘油、1.6～2.5mol/L二甲基亚砜和0.5～0.8mol/L蔗糖。
6.根据权利要求5的方法，其中所述抗冻液优选105～121℃高压蒸汽灭菌15min以上，冷却至室温放置。
7.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)中所述低温冰箱的温度要求一般在‐70℃以下。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100697317B1 (ko) * 2004-09-07 2007-03-20 바이오컬쳐(주) 봉선화의 원형을 장기보존하기 위한 동결건조방법
CN104222072A (zh) * 2014-08-27 2014-12-24 中国农业科学院麻类研究所 一种亚麻种子玻璃化超低温保存方法

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Non-Patent Citations (1)

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李庆荣: "樟科等树种种子超低温保存机理与技术研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

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