CN107864953A - 一种天南星种子超低温保存方法 - Google Patents

一种天南星种子超低温保存方法 Download PDF

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向华
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N3/00—Preservation of plants or parts thereof, e.g. inhibiting evaporation, improvement of the appearance of leaves or protection against physical influences such as UV radiation using chemical compositions; Grafting wax

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Abstract

本发明提供了一种天南星种子超低温保存方法，包括步骤以下：室温下将天南星种子用水洗净，用营养液培育，放入冻存管中，再加入抗冻液进行室温温育，再将其放入梯度降温盒中；放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在‐35℃～‐60℃，取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用；经低温保存6年后，再将降温盒从液氮中取，缓慢解冻，洗净后用于种子发芽。本发明进行天南星超低温保存，工艺简单，稳定性可靠，保存后的天南星种子的发芽率和鲜种的发芽率无显著性差异，发芽试验结果表明超低温保存后天南星种子发芽率高达95％以上。

Description

一种天南星种子超低温保存方法
技术领域
本发明涉及一种天南星种子超低温保存方法，属于现代中草药种质保护技术领域。
背景技术
天南星别名南星、白南星等。块茎扁球形，直径2-4厘米，顶部扁平，周围生根，常有若干侧生芽眼。鳞芽4-5，膜质。叶常单1，叶柄圆柱形，粉绿色，下部3/4鞘筒状；叶片鸟足状分裂，裂片13-19，有时更少或更多，倒披针形。花序柄长30-55厘米，从叶柄鞘筒内抽出。佛焰苞管部圆柱形；檐部卵形或卵状披针形。肉穗花序两性和雄花序单性。两性花序。单性雄花序长3-5厘米，粗3-5毫米。雌花球形，花柱明显，柱头小。雄花具柄，花药2-4，白色，顶孔横裂。浆果黄红色、红色，圆柱形，种子黄色，具红色斑点。花期4-5月，果期7-9月。喜湿润，疏松肥沃的土壤和环境。天南星以球状块茎供药用，具有祛风定惊、化痰散结的功能。由于野生资源少，用量大，人工栽培少，为紧俏中药材之一。天南星多系野生，中国南北各地均能栽培。除西北、西藏外，大部分省区都有分布，海拔2700米以下，生于林下、灌丛或草地。为了满足用药的需要，对天南星进行大量人工栽培，目前对天南星种子需求量增加，但野生采挖严重，对种质资源影响很大。
目前种质资源保存方式为常温、低温保存天南星种子两种方式。常温保存中草药种子，每年就需要重新繁种更新，因为中草药种子经过一年的保存，活力降低很快，只有25％左右；低温保存中草药种子，在中国，建立了国家中期库和国家种质库，国家中期库保存的温度为4℃左右，相对湿度小于65％，一般设计贮藏种子的寿命为5～10年，国家种质库为种质长期保存库，库中的温度为-18℃左右，相对湿度小于50％，设计贮藏寿命达20年以上，也就是说种质在长期库中保存，活力同样随着时间的推移降低，种质20年后一般需要更新繁种，不是永久的保存。
因此，为了安全保存天南星种质资源，研究探索一种安全而长久保存天南星种质资源的方法很有意义，它能够减少或者避免种子更新繁种，省时省力，阻断繁种更新的过程中种质间基因漂移等产生种质变异，保证种质的遗传稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种适合于天南星种子的超低温保存法，该方法能够补充现在天南星种质资源保存技术的不足，可以长期安全的保存天南星种质资源，为天南星种质资源保存提供一条新的有效的技术途径。
本发明的目的是提供一种天南星种子超低温保存方法，包括步骤以下：
(1)室温下将天南星种子用营养液处理，处理20～60min后，取出处理过的天南星种子；
(2)处理过的天南星种子放入装有冻存液的冻存管中，室温温育10～30min，再将其放入梯度降温盒中；
(3)将带有天南星种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在-35℃～-55℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用。
所述天南星种子为当年收获鲜种，自然晒干，种子含水量为6～15％。
在一个具体方案中，步骤(1)中所述营养液是指1/2MS液体培养液，还包含有1.5～2.5mol/L甘油和1～1.5mol/L二甲基亚砜。
在一个具体方案中，步骤(2)中所述梯度降温盒中含有100％异丙醇或甘油，可以重复使用。
在一个具体方案中，步骤(2)中所述冻存液是指1/2MS液体培养液，还包含有2.8～3.8mol/L甘油、1.6～2mol/L二甲基亚砜和0.45～0.6mol/L蔗糖。
在一个具体方案中，步骤(3)中所述低温冰箱的温度要求一般在-70℃以下。
天南星上述所保存的天南星种子进行解冻时，若室温超过20℃，将冻存管从液氮中取出，直接利用室温自然解冻；若室温低于20℃，将冻存管从液氮中取出，并置于20～24℃水浴箱中解冻。解冻完后，取出冻存管中天南星种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤3～5次，清洗后天南星种子直接用于培养。
技术效果
1、本发明进行天南星超低温保存，工艺简单，稳定性可靠，保存后的天南星种子的发芽率和鲜种的发芽率无显著性差异，发芽试验结果表明超低温保存后天南星种子发芽率高达90％以上。
2、本发明具有长期、有效、安全保存天南星种子，是天南星种质资源长期保存的最有效方法。
具体实施方式
下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任何一个或类似实例。
实施例1
取湖南某地当年收获的天南星，自然晒干，将含水量10.8％左右的天南星种子用含有2.2mol/L甘油和1.3mol/L二甲基亚砜的1/2MS液体培养液处理，处理20min后，取出处理过的天南星种子，再放入含有3.2mol/L甘油、1.7mol/L二甲基亚砜和0.6mol/L蔗糖的1/2MS液体培养液的冻存管中，室温温育30min，再将其放入梯度降温盒中；天南星将梯度降温盒放进-70℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在-45℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存10年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃左右，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中天南星种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后天南星种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到91.37％。
对照实施例1
取湖南某地当年收获的天南星，自然晒干，将含水量10.8％左右的天南星种子用含有2.2mol/L甘油的1/2MS液体培养液处理，处理20min后，取出处理过的天南星种子，再放入含有3.2mol/L甘油、1.7mol/L二甲基亚砜和0.6mol/L蔗糖的1/2MS液体培养液的冻存管中，再将其放入梯度降温盒中；将梯度降温盒放进-70℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在-45℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存10年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃左右，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中天南星种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后天南星种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到77.62％。
对照实施例2
取湖南某地当年收获的天南星，自然晒干，将含水量10.8％左右的天南星种子用含有2.2mol/L甘油和1.3mol/L二甲基亚砜的1/2MS液体培养液处理，处理20min后，取出处理过的天南星种子，再放入含有3.2mol/L甘油、1.7mol/L二甲基亚砜和0.6mol/L蔗糖的1/2MS液体培养液的冻存管中，室温温育30min，再将其放入在-5℃左右低温冰箱保存10年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃左右，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中天南星种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后天南星种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到24.21％。而取新鲜天南星1～5℃下低温保存10年后，用于发芽实验，经测试天南星未能发芽。
实施例2
取湖南某地当年收获的天南星，自然晒干，将含水量7％左右的天南星种子用含有2mol/L甘油和1.5mol/L二甲基亚砜的1/2MS液体培养液处理，处理30min后，取出处理过的天南星种子，再放入含有3mol/L甘油、1.8mol/L二甲基亚砜和0.5mol/L蔗糖的1/2MS液体培养液的冻存管中，室温温育20min，再将其放入梯度降温盒中；将梯度降温盒放进-80℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在-55℃左右，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存10年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃左右，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中天南星种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后天南星种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到92.81％。

Claims (7)

1.一种天南星种子超低温保存方法，包括步骤以下：
(1)室温下将天南星种子用营养液处理，处理20～60min后，取出处理过的天南星种子；
(2)处理过的天南星种子放入装有冻存液的冻存管中，室温温育10～30min，再将其放入梯度降温盒中；
(3)将带有天南星种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在‐35℃～‐55℃，降温速度为‐1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中所述营养液指1/2MS液体培养液，还包含有1.5～2.5mol/L甘油和1～1.5mol/L二甲基亚砜。
3.根据权利要求2的方法，其中所述营养液优选105～121℃高压蒸汽灭菌15min以上，冷却至室温放置。
4.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中所述梯度降温盒中含有100％甘油或异丙醇，可以重复使用。
5.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中所述抗冻液是指1/2MS液体培养液，还包含有2.8～3.8mol/L甘油、1.6～2mol/L二甲基亚砜和0.45～0.6mol/L蔗糖。
6.根据权利要求5的方法，其中所述抗冻液优选105～121℃高压蒸汽灭菌15min以上，冷却至室温放置。
7.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)中所述低温冰箱的温度要求一般在‐70℃以下。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010041364A1 (en) * 1998-10-07 2001-11-15 Bruno Florin Process for the cryo-preservation of plants
CN104222072A (zh) * 2014-08-27 2014-12-24 中国农业科学院麻类研究所 一种亚麻种子玻璃化超低温保存方法

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Non-Patent Citations (1)

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卢魏魏: "白花蛇舌草种子质量标准及引发技术研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

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