JPH07280714A

JPH07280714A - 走査電子顕微鏡用生物試料作製方法および生物試料観察方法並びに走査電子顕微鏡用生物試料作製装置

Info

Publication number: JPH07280714A
Application number: JP6099366A
Authority: JP
Inventors: Takeo Suzuki; 武雄鈴木; Masahiko Kimoto; 正彦木元
Original assignee: NIPPON DENSHI TECHNIC KK; Jeol Ltd
Current assignee: NIPPON DENSHI TECHNIC KK; Jeol Ltd
Priority date: 1994-04-13
Filing date: 1994-04-13
Publication date: 1995-10-27
Anticipated expiration: 2015-06-19
Also published as: JP3053731B2

Abstract

(57)【要約】【目的】試料の変形がない走査電子顕微鏡用生物試料
作製方法及び生物試料観察方法並びに走査電子顕微鏡用
生物試料作製装置を提供すること。【構成】制御装置１４は電源１６に冷却信号を送る。
この結果、サーモモジュール６上に位置する試料ホルダ
１１は冷やされ、試料１２も冷やされる。制御装置１４
が−４５℃の時点で冷却信号の供給を停止させる制御
は、前記メモリー１５に記憶されたデータに基づくもの
である。制御装置１４は試料室２の真空度を０．０１Ｔ
ｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空状態に設定する。制御
装置１４は電源１６に加熱信号を送る。試料の加熱温度
は徐々に上昇し、試料の温度が１５℃になった時点で終
了する。以上の試料の処理が終了すると、前記低真空状
態において試料に電子線が照射され、試料から放出され
る反射電子に基づいて試料像が表示装置に表示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、走査電子顕微鏡で水
分を含んだ生物試料を観察するための走査電子顕微鏡用
生物試料作製方法および生物試料観察方法並びに走査電
子顕微鏡用生物試料作製装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】水分を含んだ生物試料を走査電子顕微
鏡で観察する際、その試料はできるだけ生体時に近い状
態に維持する必要がある。しかし、生物試料はその７０
〜８０％が水分であり、試料を摘出後そのまま走査電子
顕微鏡内に挿入すれば装置内が真空のため、水分が気化
し乾燥による収縮変形を起こすことが多い。

【０００３】そこで、現在、生物試料を走査電子顕微鏡
で観察する前に、生物試料に処理が行なわれる。図１
（ａ）は、従来の生物試料作製の手順を説明するために
示したものであり、従来の生物試料作製の手順は以下の
通りである。

【０００４】試料の摘出が行なわれる。試料の摘出
は、試料が乾燥しないように手早く細分化する必要があ
る。

【０００５】摘出した試料が洗浄される。洗浄する理
由は、摘出した試料はそのままでは試料表面に粘液や細
胞内顆粒が付着しており、走査電子顕微鏡で観察する
際、試料の観察すべき部位が覆い隠される恐れがあるた
めである。通常は摘出した試料の端をピンセットでつま
み、そのまま緩衝液中で振り洗いをする（これを２〜３
回繰り返す）。この洗浄にかかる時間は３０分程度であ
る。

【０００６】洗浄された試料は固定処理が行なわれ
る。固定とは、試料に化学的変化を与えて硬化させるこ
とである。生物試料を固定する場合、通常は１〜２．５
％グルタールアルデヒド固定液、１％オスミウム固定液
などが使用されるが、固定法としては固定液を一種類だ
けで固定する「単独固定」と二種類の固定液を使って順
次固定する「二重固定」とがある。グルタールアルデヒ
ド固定液は主にタンパク質のみの固定であるが、オスミ
ウム酸固定液はタンパク質、脂質分が固定されるため比
較的固く固定される。「単独固定」では、生物試料はグ
ルタールアルデヒド固定液中で１〜２時間以上、オスミ
ウム固定液中で１〜２時間以内放置される。また、「二
重固定」では、生物試料はグルタールアルデヒド固定液
中で１〜２時間以上放置される。

【０００７】生物試料は、試料と化学反応しなかった
固定液を除去するために、緩衝液で洗浄される。余分な
固定液が残っていると試料を乾燥した際に、試料表面に
オスミウム酸などの結晶が析出し観察の妨げになる。こ
の洗浄にかかる時間は３０分〜２時間程度である。

【０００８】生物試料中の水分をエチルアルコール、
アセトンなどの有機溶媒と置換し除去する脱水処理が行
なわれる。これは有機溶媒が水に比較して表面張力が１
／３程度小さいことにより収縮変形による影響が小さ
く、乾燥時間が短いことによる。しかし、１００％の有
機溶媒中に水分を含んだ試料を直接入れると脱水作用が
急激に進み、試料が収縮変形するため、始めはアルコー
ル（アセトン）などを精製水（純粋、蒸留水）で希釈
し、５０％溶液とした中に水分を含む試料を浸し、脱水
する。同様に６０％、７０％、８０％、９０％、９５％
溶液を作り、順次高濃度の溶液中に試料を移し変えてい
く。試料を１つの溶液に浸す時間は５〜１５分程度であ
る。最後に、生物試料を１００％のエチルアルコールの
中に浸し脱水するが、試料を浸す時間は３０分程度で、
２回脱水処理が行なわれる。なお、変形を起こしやすい
試料は２％溶液から脱水処理が行なわれる。

【０００９】以上、試料の脱水処理までが終了したが、
これ以降の手順は、臨界点乾燥法とｔ−ブチルアルコー
ル凍結乾燥法により異なる。臨界点乾燥法の手順を
で説明し、ｔ−ブチルアルコール凍結乾燥法の手順を
で説明する。

【００１０】脱水処理された生物試料は酢酸イソアミ
ル（酢酸アミル）中に入れられ、約１５分間放置され
る。

【００１１】の置換処理が行なわれた試料は、耐圧
容器内に入れられ、室温の状態で液体二酸化炭素が容器
に満たされ、密閉した容器が臨界温度以上に加温されて
容器の圧力は上昇し、容器の圧力がある圧力に達すると
二酸化炭素は瞬間的に液体から気体に変移する。そし
て、そのまま気体を容器外に徐々に排出させると試料は
乾燥する。

【００１２】の脱水処理が行なわれた試料は、ｔ−
ブチルアルコールの中に入れられる。ｔ−ブチルア
ルコールに置換された試料は、凍結乾燥装置の試料ステ
ージ上に置かれ、ステージが５℃まで冷やされる（また
は冷蔵庫内に数十分放置してもよい）。ｔ−ブチルアル
コールが凍結したら凍結乾燥装置内はゆっくりと排気さ
れ、凍結したｔ−ブチルアルコールは昇華する。昇華が
終わり圧力が急激に下がり始めたらステージ温度が室温
にもどされ、大気圧にすると乾燥した試料が出来上が
る。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】以上、従来の生物試
料作製の手順を説明したが、図２はｔ−ブチルアルコー
ル凍結乾燥法により処理されたアナベナの走査電子顕微
鏡による２次電子像を示す図面代用写真である。図２
（ａ）は、固定液が２％グルタールアルデヒドで、脱水
が２０％アルコールから行なわれたアナベナの２次電子
像であり、アナベナは収縮している。図２（ｂ）は同じ
条件で処理されたアナベナの２次電子像であり、アナベ
ナは変形している。このように、アナベナをｔ−ブチル
アルコール凍結乾燥法により処理すると、アナベナは収
縮又は変形して原形（生体）を維持しなくなる。又、収
縮又は変形というようにこの方法においては再現性がな
い。図２（ｃ）は、固定液が２％グルタールアルデヒド
で、脱水が１０％アルコールから行なわれたアナベナの
２次電子像であるが、アナベナは収縮している。なお、
臨界点乾燥法により処理された試料の２次電子像は挙げ
なかったが、臨界点乾燥法においてもｔ−ブチルアルコ
ール凍結乾燥法と同じ問題が生ずる。

【００１４】また、従来においては、臨界点乾燥法やｔ
−ブチルアルコール凍結乾燥法による試料作製の過程で
試料が変形した場合、走査電子顕微鏡像を観察するまで
試料の変形が確認できない。このため、せっかく試料を
作製しても、その作業が無駄になる場合がある。

【００１５】また、臨界点乾燥法やｔ−ブチルアルコー
ル凍結乾燥法による試料作製においては、化学固定を含
む前処理作業と専門知識と習熟度が要求され、また、前
述したように多くの処理時間が必要になる。

【００１６】本発明はこのような問題を解決する走査電
子顕微鏡用生物試料作製方法および生物試料観察方法並
びに走査電子顕微鏡用生物試料作製装置を提供すること
を目的とする。

【００１７】

【課題を解決するための手段】この目的を達成する本
発明の走査電子顕微鏡用生物試料作製方法は、凍結した
試料を真空引きされた試料室の中に配置し、該凍結試料
を零度より高い温度まで昇温させることを特徴とする。
また、本発明の生物試料観察方法は、凍結した試料を真
空引きされた試料室の中に配置し、該凍結試料を零度よ
り高い温度まで昇温させ、温度上昇過程における試料の
状態を走査電子顕微鏡により観察することを特徴とす
る。また、本発明の走査電子顕微鏡用生物試料作製装置
は、試料が配置される試料室と、該試料室を排気する手
段と、前記試料を凍結する手段と、前記試料を加熱する
手段と、該加熱手段の温度を零度より高い温度まで昇温
させる手段とを備えている。

【００１８】

【実施例】以下、本発明の実施例を図面を用いて説明
する。図３は本発明の実施例として示した走査電子顕微
鏡の概略図である。図３において、１は走査電子顕微鏡
の鏡筒、２は試料室、３は試料室２を排気する排気装置
である。４は試料ステージで、試料ステージ４はＸ，
Ｙ，およびＺ方向に移動可能である。５は吸熱器であ
る。６はサーモモジュールで、サーモモジュール６は、
Ｐ型半導体７とＮ型半導体８を金属電極９で接合したπ
型直列回路からなるペルチエ素子を単数または複数並列
してセラミック板１０で挟んで構成したものである。サ
ーモモジュール６は、電流を矢印Ａの方向に流すとペル
チエ効果によりその接合部で吸熱が生じ、その反対側で
発熱が生じ、また、電流を矢印Ｂの方向に逆転して流す
と、吸熱と発熱が逆転する。したがって、電流の向きを
変えることにより、電子的に加熱と冷却が可能である。
１１は試料ホルダ、１２は生物試料である。図４は試料
ホルダ１１上に置かれた生物試料１２を示したものであ
る。生物試料１２は水１８で覆われている。なお、水の
かわりにアルコール溶液であってもよい。１３は試料ホ
ルダ１１の温度を検出する温度検出器、１４は制御装置
である。１５はメモリーであり、そのメモリー１５に
は、図１１のＴに示すような、試料ホルダ加熱開始から
所定時間経過後における試料ホルダの目標温度が記憶さ
れている。１６は電源、１７は真空ゲージである。

【００１９】以下、この装置の動作を説明する。

【００２０】制御装置１４は電源１６に冷却信号、すな
わち、サーモモジュール６に電流を前記矢印Ａの向きに
流すための信号を送る。この結果、サーモモジュール６
上に位置する試料ホルダ１１は冷やされ、試料１２も冷
やされる。試料ホルダ１１の温度は温度検出器１３で検
出され、その検出信号は制御装置１４に送られている。
制御装置１４は試料ホルダ１１の温度が−４５℃になる
と、電源１６への冷却信号の供給を停止する。制御装置
１４が−４５℃の時点で冷却信号の供給を停止させる制
御は、前記メモリー１５に記憶されたデータに基づくも
のである。この冷却により、試料１２は水１８に覆われ
た状態で凍結する。試料の冷却が終わると、制御装置１
４は排気装置３に排気信号を送り、排気装置３は試料室
２を排気する。試料室２の真空度は真空ゲージ１７によ
り測定され、その信号は制御装置１４に送られており、
制御装置１４は試料室２の真空度を０．０１Ｔｏｒｒ〜
２Ｔｏｒｒの間の低真空状態に設定する。

【００２１】次に、制御装置１４は電源１６に加熱信
号、すなわち、電流を前記矢印Ｂの向きに流すための信
号を送る。この結果、サーモモジュール６上に位置する
試料ホルダ１１は加熱され、試料１２も加熱される。試
料ホルダ１１の温度は温度検出器１３で検出され、その
検出信号は制御装置１４に送られている。制御装置１４
は、メモリー１５に記憶されている温度と、温度検出器
１３から送られてくる温度を比較し、試料の温度と略同
一とみなし得る試料ホルダの温度がメモリー１５に記憶
されたデータに基づいて予め設定された速度で徐々に上
昇するように電源１６を制御する。このようにして、試
料は室温である例えば１５℃になった時点で温度変化を
終了する。

【００２２】ここで、加熱による試料１２の状態の変化
及び生物試料が変形等を起こさない理由を説明する。

【００２３】アーチ状または平板状に凍結した氷は、試
料室内の真空と試料ホルダの温度値の関係で昇華を始め
る。そのスピードは、ホルダの昇温カーブによる。昇華
のスピードは、生物試料の細胞膜の構造により若干変更
することが必要である。その理由は、細胞内の氷の昇華
スピードに合わせるためである。そのバランスがくずれ
ると、生物試料に収縮変形を誘発する。つまり、試料を
覆った氷が昇華完了する前に試料内部の氷も全て昇華さ
せることが重要である。

【００２４】ところで、試料内部の氷が昇華するにした
がって、入射電子線が試料の深部まで拡散し、内部で発
生した反射電子が検出可能なため、光学顕微鏡のように
内部組織の観察も可能である。なお、従来は化学固定を
行なっていたため、化学反応により細胞の質量が大きく
なって入射電子の拡散が行なわれにくくなり、内部観察
が思うようにできなかった。また、試料加熱中の試料像
は表示装置（図示せず）に表示され、オペレーターはこ
の像を観察することにより、温度上昇過程における試料
の変形の有無を確認することができる。

【００２５】上述した温度処理が行なわれた試料の走査
電子顕微鏡の低真空状態における反射電子像及び高真空
状態における二次電子像の例をあげる。尚、前記温度処
理が行なわれた試料を高真空状態で観察する場合には、
チャージアップによる像の劣化を防ぐため、試料にはコ
ーティングが施される。

【００２６】図５は、アオミドロの低真空状態における
反射電子像を示す図面代用写真であり、アオミドロの収
縮はなく、アオミドロは原形（生体）を維持している。
また、本発明の試料作製においては、従来のように試料
を化学固定しないので、アオミドロの内部がはっきりと
観察できる。図６（ａ）は、水中に発生した藻の低真空
状態における反射電子像を示す図面代用写真であり、図
６（ｂ）は、その藻の高真空状態における２次電子像を
示す図面代用写真である。この像からも明らかなよう
に、藻の収縮はなく、藻はほとんど原形（生体）を維持
している。図７（ａ），（ｂ）は、藻の低真空状態にお
ける反射電子像を示す図面代用写真であり、図７（ｃ）
は、藻の高真空状態における２次電子像を示す図面代用
写真である。図７は図６に示した写真の倍率より高い倍
率の写真であるが、藻が原形（生体）を維持しているこ
とが一層理解できる。図８（ａ）は、藻の低真空状態に
おける反射電子像を示す図面代用写真であり、図８
（ｂ）は、藻の高真空状態における２次電子像を示す図
面代用写真である。図９（ａ），（ｂ）は、ミジンコの
低真空状態における反射電子像を示す図面代用写真であ
り、図１０（ａ），（ｂ）は、ミジンコの高真空状態に
おける２次電子像を示す図面代用写真である。この像か
ら明らかなように、ミジンコの変形はなく、ミジンコは
原形（生体）をほとんど維持している。

【００２７】図１（ｂ）は、上述した本発明の生物試料
作製の操作手順をまとめたものである。本発明の生物試
料作製にかかる時間は、数時間程度であり、従来に比べ
生物試料の作製時間は大幅に短縮される。

【００２８】なお、上記実施例においては、メモリー１
５を設け、試料の温度上昇をメモリーに記憶された情報
に基づいて制御したが、メモリーや制御手段を設けずに
実施することもできる。その場合、試料の温度上昇を制
御した場合と略同じような速度で試料の温度が上昇する
ように、周囲から試料ホルダへの熱の流入速度や試料ホ
ルダの熱容量を適切に選択することが必要である。ま
た、試料の温度制御は、試料の温度が前記図１２の斜線
の範囲内において上昇するように制御してもよい。ま
た、以上の説明においては、試料の作製を走査電子顕微
鏡内において行なったが、前記構成を備えた装置、すな
わち、試料を冷却および加熱する手段、試料室を排気す
る手段などを備えた装置内で試料を作製してもよい。

【００２９】

【発明の効果】本発明は、凍結した試料を真空引きさ
れた試料室の中に配置し、該凍結試料を零度より高い温
度まで昇温させるので、変形のない原形を維持した生物
試料の走査電子顕微鏡像を得ることができ、従来のよう
に化学固定を行なわないので試料の内部組織の観察が可
能である。また、本発明においては、従来の固定、脱
水、置換、臨界点乾燥及び凍結乾燥を行なわなくてすむ
ので、薬品による危険がなくなる。また、本発明の試料
作製は非常に簡単なので、試料の出来ぐあいが専門知識
と習熟度に左右されず、試料作製時間は従来に比べ著し
く軽減される。また、本発明は、凍結した試料を真空引
きされた試料室の中に配置し、該凍結試料を零度より高
い温度まで昇温させ、温度上昇過程における試料の状態
を走査電子顕微鏡により観察するので、試料作製の過程
で試料が微妙に変形した場合、試料が変形したかどうか
を知ることができ、走査電子顕微鏡で得られた生物試料
の像が、原形（生体）を維持した生物試料の像かどうか
を判断することができる。また、本発明においては化学
固定を行なわないが、出来上がった試料は保存が可能で
ある。

【図面の簡単な説明】

【図１】従来の生物試料作製の手順及び本発明の生物試
料作製の手順を示したものである。

【図２】ｔ−ブチルアルコール凍結乾燥法により処理さ
れたアナベナの低真空走査電子顕微鏡による反射電子像
を示す図面代用写真である。

【図３】本発明の実施例として示した走査電子顕微鏡の
概略図である。

【図４】試料ホルダ上に置かれた生物試料を示したもの
である。

【図５】本発明の処理がされたアオミドロの低真空状態
における反射電子像を示す図面代用写真である。

【図６】本発明の処理がされた藻の走査電子顕微鏡像を
示す図面代用写真である。

【図７】本発明の処理がされた藻の走査電子顕微鏡像を
示す図面代用写真である。

【図８】本発明の処理がされた藻の走査電子顕微鏡像を
示す図面代用写真である。

【図９】本発明の処理がされたミジンコの低真空状態に
おける反射電子像を示す図面代用写真である。

【図１０】本発明の処理がされたミジンコの高真空状態
における２次電子像を示す図面代用写真である。

【図１１】試料ホルダ加熱開始から所定時間経過後にお
ける試料ホルダ加熱温度を説明するために示したもので
ある。

【符号の説明】

１鏡筒２試料室３排気装置４試料ステージ５吸熱器６サーモモジュール７Ｐ型半導体８Ｎ型半導体９金属電極１０セラミック板１１試料ホルダ１２試料１３温度検出器１４制御装置１５メモリー１６電源１７真空ゲージ１８水

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】凍結した試料を真空引きされた試料室の
中に配置し、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温さ
せることを特徴とする走査電子顕微鏡用生物試料作製方
法。
【請求項２】凍結した試料を真空引きされた試料室の
中に配置し、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温さ
せ、温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡
により観察することを特徴とする生物試料観察方法。
【請求項３】試料が配置される試料室と、該試料室を
排気する手段と、前記試料を凍結する手段と、前記試料
を加熱する手段と、該加熱手段の温度を零度より高い温
度まで昇温させる手段とを備えた走査電子顕微鏡用生物
試料作製装置。